CN101041846A - 新型脂肽类生物表面活性剂surfactin的制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型脂肽类生物表面活性剂surfactin的制备方法及用途,利用枯草芽孢杆菌株E8(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,菌种保藏编号为1107)进行微生物液体发酵生产脂肽类生物表面活性剂surfactin,对所需的液体培养基进行碳源、氮源、无机盐成份进行优化,获得的发酵液经离心除菌体,上清液酸化提取粗提物,粗提物进一步经过溶剂抽提后再酸化收集沉淀,离心真空干燥后即得初步提纯品。再经疏水柱及FPLC分离冻干获得高纯品。发酵24-56小时酸化粗提物的产量达到5-13g/L,高产菌株E8的发酵主要产物分子量1022Da,CMC值达到1μM,是已报道的surfactin CMC值中最低的。酸化粗提物和提纯品可以应用于化妆品、食品、洗涤剂、药品、农药及环保等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物领域,更具体的说是属于利用一种枯草芽孢杆菌的菌株生产脂肽类生物表面活性剂surfactin的方法,并涉及其的应用范围。
背景技术
生物表面活性剂是由微生物在一定条件下产生的同时具有亲水性和疏水性两种结构的代谢产物。除具有化学合成表面活性剂相同或相近的理化特性外,生物表面活性剂还具有结构复杂、专一性强,低毒性、可生物降解、环境友好,可利用廉价农副产品生物发酵生产,某些生物表面活性剂还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药理作用及生理活性。生物表面活性剂已在石油、食品、化妆品及药学等领域获得广泛的应用。
1968年由Arima等人发现枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis生产的产一种脂肽类表面活性剂,活性极强,命名为surfactin。surfactin是目前所知表面活性最强的生物表面活性剂之一,自从被发现以来,受到持续的关注。但由于产量很低,达不到商业化用途,许多发明者致力于提高surfactin的产量。1968年Arima发现surfactin时产量只有0.05-0.10g/L,1981年Cooper等人采用含4%葡萄糖的基本无机盐培养基培养ATCC21332,并收集泡沫分离surfactin,产量达到0.78g/L,1989年Mulligan等人发现一株枯草芽孢杆菌ATCC21332的紫外突变株,产surfactin可以达到1.124g/L,1997年Kim等人采用一个改进的Cooper培养基并在限氧条件下培养枯草芽孢杆菌C9,surfactin产量达到7.0g/L,2002年魏毓宏等人采用一种强化无机盐培养基伴以控制pH使surfactin产量接近3.5g/L。如何降低生产成本是目前研发的主要目标,这需要选育优良的高产菌株,合适廉价的培养基,开发高附加值产品,这正是本发明要解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型脂肽类生物表面活性剂surfactin的制备方法及用途;生物表面活性剂surfactin产物以1022Da物质为主,临界胶束浓度CMC值为1μM。产物主要用于化妆品添加剂、药物前体助剂、食品添加剂、农药助剂以及环境保护等方面。
本发明的技术方案为:
新型脂肽类生物表面活性剂surfactin的制备方法,其特征是先对斜面保存的枯草芽孢杆菌的高产菌株E8斜面活化;采用液体培养基,在发酵罐发酵培养,利用菌枯草芽孢杆菌株E8发酵生产surfactin;分离提纯,得到surfactin表面活性剂;菌枯草芽孢杆菌株E8菌种保藏编号为1107;所述的液体培养基是中含有碳源、氮源和无机盐,碳源选自4%的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、麦芽糖和乳糖、酵母抽提物yeast extract;氮源选自谷氨酸、氨基酸、黄豆饼粉、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钠、氯化铵以及氯化铵和硝酸钠混合氮源,所述的无机盐是指磷酸二氢钾KH2PO4、硫酸镁MgSO4、氯化钾KCl、七水合硫酸亚铁FeSO4·7H2O、硫酸锰MnSO4、五水合硫酸铜CuSO4·5H2O。
所述的碳源为可溶性淀粉或麦芽糖,氮源为硝酸钠或硝酸钠和氨基酸的混合物。
所述的液体培养基每1000ml中含有:可溶性淀粉35-45g,硝酸钠NaNO34-8g,磷酸二氢钾KH2PO4 0.5-1.5g,硫酸镁MgSO4 0.2-1g,氯化钾KCl 0.2-1g,七水合硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.10-0.5g,硫酸锰MnSO4 1.2-2mg,五水合硫酸铜CuSO4·5H2O 0.1-0.3mg,酵母抽提物yeast extract 0.5-2g;
更为具体的配方,所述的液体培养基每1000ml中含有:可溶性淀粉40g,硝酸钠NaNO3 7g,磷酸二氢钾KH2PO4 1g,硫酸镁MgSO4 0.5g,氯化钾KCl 0.5g,七水合硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.30g,硫酸锰MnSO4 1.69mg,五水合硫酸铜CuSO4·5H2O 0.16mg,酵母抽提物yeast extract 1g。
所述的分离提纯是指:发酵液经8000rpm离心30min除菌体,上清液用6mol/L盐酸调pH至2,放4℃冰箱过夜,8000rpm离心30min收集沉淀,真空干燥得酸化粗提物。酸化粗提物用二氯甲烷抽提,抽提物挥发溶剂后溶于碱水,使最终pH达到7-8,再次用盐酸调pH至2,收集沉淀,冷冻干燥即得surfactin初步提纯产品。
冷冻干燥即得的surfactin初步提纯产品进行进一步分离提纯及质谱分析:疏水性分析用SOURCE15 PHE疏水柱;反相疏水分析用Pharmacia公司制备型FPLCAKTA EXPLORER 100,Biotech Resource RPC 3ml柱;质谱分析用Thermo Finnigan公司LCQ-Advantage型电喷雾质谱分析仪;
SOURCE15 PHE条件:pH 6.8的磷酸缓冲液:Na2HPO4-NaH2PO4 20mmol/L,体积比为49.0∶51.0;1M(NH4)2SO4缓冲液;
RPC3柱条件:缓冲液A为20%乙腈、0.05%三氟乙酸(TFA);B为95%乙腈、0.05%TFA;各缓冲液均需经0.22μm水性滤膜过滤,超声波处理15分钟除气泡;经透析过的样品直接上经1M(NH4)2SO4溶液平衡后的SOURCE15 PHE疏水相互作用层析柱。样品全部进入柱子以后,220nm检测吸收值;用(NH4)2SO4溶液冲洗疏水柱至紫外吸收至基线;然后换用20mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4 pH6.8的缓冲液冲洗,至已无蛋白从柱内洗出;最后用重蒸水将表面活性物质从柱上洗脱,收集吸收峰,冷冻干燥;取各冷冻干燥的样品配成100μl浓度为20%溶液,溶解在20%的乙腈、0.05%TFA溶液中;先用20%乙腈、0.05%TFA溶液充分平衡的Pharmacia公司的RPC柱,注入10μl样品;在30分钟内,以线性梯度形式使流动相变至0.05%TFA、95%乙腈的水溶液;这种洗脱条件即可将表面活性物质依次分离。
用前述方法制备的新型脂肽类生物表面活性剂surfactin的用途,是做为农药分散剂及环境修复剂等助剂使用;经过初步提纯的surfactin,可以配成钠盐做为化妆品添加剂、农药助剂和食品添加剂、洗涤助剂使用;经过进一步分离提纯的产品做为药物前体应用。
以下是关于枯草芽孢杆菌E8的制备方法介绍:
一种芽孢杆菌属菌株,是为枯草芽孢杆菌,编号为E8,菌种保藏编号为1107;
一种枯草芽孢杆菌株的制备方法,是将从土壤中分离得到的菌枯草芽孢杆菌B.s(Landy发酵液表面张力为30.3mN/m)经20keV,1.3×1014N+/cm2~5.2×1015N+/cm2,不同剂量的N+注入筛选到高产高产surfactin的活性菌株E8。该菌株与原始出发菌株相比,表面活性增强,在Landy培养基上去除菌体后的发酵液在稀释50倍和100倍之后,其表面张力值分别为27.1mN/m和28.5mN/m;出发菌株同等条件下其表面张力值分别为64.4mN/m和71.2mN/m,其表面活性分别是出发菌株的5.6和17.4倍。
所述的枯草芽孢杆菌株的制备方法,其特征是采用N+脉冲式辐照处理,样品置于水冷的无菌靶台上,将B.s制成菌悬液,取0.1mL菌悬液铺于Φ90mm的空白平皿中,于超净台中风干制成菌膜备用;用不同剂量N+的辐照处理后将菌膜用1mL无菌水洗脱于血平板固体培养基中。培养24hr后挑取产生明显溶血圈的单菌落;将经过离子束注入处理的,从培养24h的斜面挑一环细胞接种于种子培养基中培养后接种于发酵培养基,培养后,测表面张力,筛选高产菌株。
所述的枯草芽孢杆菌株,其特征是使用血平板作为初筛平板。血平板制备:取营养琼脂,加热使其溶解待冷至45-50℃,以灭菌操作于每100毫升营养琼脂加灭菌脱纤维羊血5毫升,轻轻摇匀,立即倾注于平板制成备用。
所述的枯草芽孢杆菌株的制备方法,其特征是发酵培养基装液量为50ml/250ml,按接种量2%接种,发酵液的pH值为7.0,发酵罐转速为200rpmin,温度为33℃,培养30小时。
本发明从土壤中筛选并分离出具有表面活性的枯草芽孢杆菌B.s作为原始菌株。
原始菌株的离子注入实验于低能离子束细胞修饰技术和装置上进行,采用N+脉冲式辐照处理,该装置的专利号为93103361.6。
本发明对于制备的脂肽类生物表面活性剂surfactin进行了表面活性试验及CMC测定;培养基筛选时以粗提物重量并辅以发酵液稀释200和400倍时的表面张力值作为筛选指标。
枯草芽孢杆菌株发酵液的表面张力测定是利用Sigma公司产的703表面/界面张力仪测定的。取15ml发酵液10000rpm离心10min,取上清液200倍和400倍稀释液于测量杯中,用Wilhelmy铂金片分别测定表面张力值。
本发明的产生菌的发酵工艺稳定简单,对环境无污染。
具体实施方式
1、从土壤中筛选并分离出有一定表面活性的枯草芽孢杆菌B.s(Landy发酵液表面张力为30.3mN/m)作为原始菌株。
2、原始菌株的离子注入实验于低能离子束细胞修饰技术和装置上进行,该装置的专利号为93103361.6。采用N+脉冲式辐照处理,经20keV,1.3×1014N+/cm2~5.2×1015N+/cm2,不同剂量的N+注入,其过程是:样品置于水冷的无菌靶台上,将B.s制成菌悬液,取0.1mL菌悬液铺于Φ90mm的空白平皿中,于超净台中风干制成菌膜备用;用不同剂量N+的辐照处理后,将菌膜用1mL无菌水洗脱于血平板固体培养基中培养24hr后挑去产生明显溶血圈的单菌落;将经过离子束注入处理的,从培养24h的牛肉膏斜面挑一环细胞接种于Landy液体培养基中(1000ml的Landy液体培养基含葡萄糖20g,L-谷氨酸5g,MgSO4 0.5g,KCl 0.5g,KH2PO4 1g,FeSO4·7H2O 0.15g,MnSO4 0.005g,CuSO4·5H2O 0.16mg,酵母抽提物 1g),按接种量2%,发酵液的pH值为7.0,发酵罐转速为200rpmin,温度为33℃。培养30hr后,表面/界面张力仪测定表面张力,筛选高产菌株,经过多轮筛选后得到本发明的枯草芽孢杆菌株E8,现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,菌种保藏编号为1107。
3、生物表面活性剂surfactin的制备。首先进行培养基的优化。碳源的选择:取4%的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、麦芽糖和乳糖分别加入不含碳源的Landy培养基,接种量2%,培养温度33℃,摇床转速200rpm培养48小时,然后测发酵液及稀释液的表面张力值以及酸化粗提物的重量。酸化粗提物的测定结果为:葡萄糖2.8g/L,蔗糖3.2g/L,可溶性淀粉4.6g/L,糊精4.4g/L,麦芽糖4.5g/L,乳糖1.0g/L。发酵液稀释400倍时的表面张力值分别为葡萄糖45.4mN/m,蔗糖37.8mN/m,可溶性淀粉38.3mN/m,糊精37.5mN/m,麦芽糖38.4mN/m和乳糖66.2mN/m。碳源以可溶性淀粉和麦芽糖效果最好。
4、氮源的选择:取0.6%谷氨酸、2%黄豆饼粉、0.6%蛋白胨、0.6%硝酸铵、0.6%硫酸铵、0.6%硝酸钠、0.6%氯化铵以及0.3%氯化铵和0.3%硝酸钠混合氮源分别加入不含谷氨酸的Landy培养基,接种量2%,培养温度33℃,摇床转速200rpm培养48小时,然后测发酵液及稀释液的表面张力值以及酸化粗提物的重量。酸化粗提物的测定结果为:谷氨酸2.8g/L,黄豆饼粉4.2g/L,蛋白胨0g/L,硝酸铵0g/L,硫酸铵0g/L,硝酸钠5.8g/L,氯化铵0g/L,氯化铵和硝酸钠0g/L。相应的发酵液稀释400倍时的表面张力值为谷氨酸40.0mN/m,黄豆饼粉52.1mN/m,蛋白胨72.6mN/m,硝酸铵73.0mN/m,硫酸铵73.2mN/m,硝酸钠36.4mN/m,氯化铵71.7mN/m,氯化铵和硝酸钠72.0mN/m。碳源以硝酸钠效果最好,可以添加部分氨基酸。
5、培养基正交实验。以筛选得到的碳源可溶性淀粉以及氮源硝酸钠,并结合对surfactin发酵有重要影响的无机金属离子Fe2+和Mn2+,设计一个L9(34)正交实验。可溶性淀粉选取2%、3%、4%三水平,硝酸钠选取0.5%、0.6%、0.7%三水平,硫酸亚铁选取0.015%、0.030%、0.050%三水平,硫酸锰选取0.01mM、0.03mM、0.05mM三水平,其余培养基同Landy培养基。接种量2%,培养温度33℃,摇床转速200rpm培养48小时,然后测发酵液及稀释液的表面张力值以及酸化粗提物的重量。实验结果表明选取可溶性淀粉4%、硝酸钠0.7%、硫酸亚铁0.030%和硫酸锰0.01mM时发酵结果最好,发酵24-56小时,酸化粗提物可达到5-13g/L;生长曲线实验表明在48-54小时酸化粗提物产量最高。在产量到达最高阶段,去菌体发酵液稀释400倍时的表面张力值可以达到33.1mM/m左右。
6、所述的优化后的液体培养基,每1000ml中含有:可溶性淀粉40g,硝酸钠NaNO3 7g,磷酸二氢钾KH2PO4 1g,硫酸镁MgSO4 0.5g,氯化钾KCl 0.5g,七水合硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.30g,硫酸锰MnSO4 1.69mg,五水合硫酸铜CuSO4·5H2O 0.16mg,酵母抽提物yeast extract 1g。
7、利用上述液体培养基,枯草芽孢杆菌株E8在发酵罐发酵培养,得到发酵液,经8000rpm离心30min除菌体,上清液用6mol/L盐酸调pH至2,放4℃冰箱过夜,8000rpm离心30min收集沉淀,真空干燥得酸化粗提物。酸化粗提物用二氯甲烷抽提,抽提物挥发溶剂后溶于碱水,使最终pH达到7-8,收集沉淀,冷冻干燥即得surfactin初步提纯产品。
表面活性物质的进一步分离提纯及质谱分析。疏水性分析用SOURCE15 PHE疏水柱;反相疏水分析用Pharmacia公司制备型FPLC AKTA EXPLORER 100,Biotech Resource RPC 3ml柱(3ml,100×6.4mm)。质谱分析用Thermo Finnigan公司LCQ-Advantage型电喷雾质谱分析仪。
SOURCE15 PHE条件:pH 6.8的磷酸缓冲液:Na2HPO4-NaH2PO4 20mmol/L(体积比为49.0∶51.0);1M(NH4)2SO4缓冲液。RPC3柱条件:缓冲液A为20%乙腈、0.05%三氟乙酸(TFA);B为95%乙腈、0.05%TFA。各缓冲液均需经0.22μm水性滤膜过滤,超声波处理15分钟除气泡。
8、经透析过的样品直接上经1M(NH4)2SO4溶液平衡后的SOURCE15 PHE疏水相互作用层析柱。样品全部进入柱子以后,220nm检测吸收值;用(NH4)2SO4溶液冲洗疏水柱至紫外吸收至基线;然后换用20mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4 pH6.8的缓冲液冲洗,至已无蛋白从柱内洗出;最后用重蒸水将表面活性物质从柱上洗脱,收集吸收峰,冷冻干燥。
9、取各冷冻干燥的样品配成100μl浓度为20%溶液,溶解在20%的乙腈、0.05%溶液中;先用20%乙腈、0.05%TFA溶液充分平衡的Pharmacia公司的RPC柱,注入10μl样品;在30分钟内,以线性梯度形式使流动相变至0.05%TFA、95%乙腈的水溶液。这种洗脱条件即可将表面活性物质依次分离。
10、电喷雾质谱(ESI-MS)分析。各取40μl收集的样品液体,加入600μl蒸馏水、300μl色谱级乙腈混匀后进行ESI-MS分析。样品通过注射器直接进样。毛细管电压32伏,喷雾电压5千伏,毛细管温度320℃。
11、出发菌株与E8的峰分布相似,但各峰的峰值差异比较明显,两者的表面活性物质类似,但各组分的量及其比例发生了变化。[M-H]-的分子量分别为993.3Da、1007.2Da、1021.1Da、1034.9Da和1048.7Da,相差的14Da分子量为-CH2-,以上峰值分别对应于12~16个碳原子。出发菌株以1034.9Da峰值最高,丰度是1021.1Da物质量的两倍;而E8却以1021.1Da的物质量最多,是1034.9Da物质的两倍。
12、表面活性物质surfactin的CMC值测定。经过疏水分析收集的样品冷冻干燥后称取相应重量的样品溶解于10ml蒸馏水,配成100μM溶液;分别测量二者的表面张力,同时将二溶液分别稀释10倍、12.5倍、25倍、50倍、100倍、200倍、400倍,测定不同溶液的表面张力值;确定表面张力与浓度之间的曲线关系,确定该表面活性物质的CMC值。
13、出发菌株的表面活性物质的CMC值为4μM,高产菌株E8产的表面活性物质surfactin的临界胶团浓度CMC值为1μM,是已报道的surfactin CMC值中最低的。
14、上述得到的酸化粗提物可以做为农药分散剂及环境修复剂等助剂使用;提纯的surfactin,可以配成钠盐做为化妆品添加剂、农药助剂和食品添加剂,也可作为洗涤助剂使用;进一步的提纯产品可以做为药物前体应用。
Claims (7)
1、新型脂肽类生物表面活性剂surfactin的制备方法,其特征是先对斜面保存的枯草芽孢杆菌的高产菌株E8斜面活化;采用液体培养基,在发酵罐发酵培养,利用菌枯草芽孢杆菌株E8发酵生产surfactin;分离提纯,得到surfactin表面活性剂;菌枯草芽孢杆菌株E8菌种保藏编号为1107;所述的液体培养基是中含有碳源、氮源和无机盐,碳源选自4%的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、麦芽糖和乳糖、酵母抽提物yeast extract;氮源选自谷氨酸、氨基酸、黄豆饼粉、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钠、氯化铵以及氯化铵和硝酸钠混合氮源,所述的无机盐是指磷酸二氢钾KH2PO4、硫酸镁MgSO4、氯化钾KCl、七水合硫酸亚铁FeSO4·7H2O、硫酸锰MnSO4、五水合硫酸铜CuSO4·5H2O。
2、根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述的碳源为可溶性淀粉或麦芽糖,氮源为硝酸钠或硝酸钠和氨基酸的混合物。
3、根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述的液体培养基每1000ml中含有:可溶性淀粉35-45g,硝酸钠NaNO3 4-8g,磷酸二氢钾KH2PO40.5-1.5g,硫酸镁MgSO4 0.2-1g,氯化钾KCl 0.2-1g,七水合硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.10-0.5g,硫酸锰MnSO4 1.2-2mg,五水合硫酸铜CuSO4·5H2O0.1-0.3mg,酵母抽提物yeast extract 0.5-2g。
4、根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于所述的液体培养基每1000ml中含有:可溶性淀粉40g,硝酸钠NaNO37g,磷酸二氢钾KH2PO41g,硫酸镁MgSO40.5g,氯化钾KCl 0.5g,七水合硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.30g,硫酸锰MnSO41.69mg,五水合硫酸铜CuSO4·5H2O 0.16mg,酵母抽提物yeastextract 1g。
5、根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述的分离提纯是指:发酵液经8000rpm离心30min除菌体,上清液用6mol/L盐酸调pH至2,放4℃冰箱过夜,8000rpm离心30min收集沉淀,真空干燥得酸化粗提物。酸化粗提物用二氯甲烷抽提,抽提物挥发溶剂后溶于碱水,使最终pH达到7-8,再次用盐酸调pH至2,收集沉淀,冷冻干燥即得surfactin初步提纯产品。
6、根据权利要求5所述的方法,其特征在于冷冻干燥即得surfactin初步提纯产品进行进一步分离提纯及质谱分析:疏水性分析用SOURCE15 PHE疏水柱;反相疏水分析用Pharmacia公司制备型FPLC AKTA EXPLORER 100,BiotechResource RPC3ml柱;质谱分析用Thermo Finnigan公司LCQ-Advantage型电喷雾质谱分析仪;
SOURCE15 PHE条件:pH 6.8的磷酸缓冲液:Na2HPO4-NaH2PO4 20mmol/L,体积比为49.0∶51.0;1M(NH4)2SO4缓冲液;
RPC3柱条件:缓冲液A为20%乙腈、0.05%三氟乙酸(TFA);B为95%乙腈、0.05%TFA;各缓冲液均需经0.22μm水性滤膜过滤,超声波处理15分钟除气泡;经透析过的样品直接上经1M(NH4)2SO4溶液平衡后的SOURCE15 PHE疏水相互作用层析柱。样品全部进入柱子以后,220nm检测吸收值;用(NH4)2SO4溶液冲洗疏水柱至紫外吸收至基线;然后换用20mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4pH6.8的缓冲液冲洗,至已无蛋白从柱内洗出;最后用重蒸水将表面活性物质从柱上洗脱,收集吸收峰,冷冻干燥;取各冷冻干燥的样品配成100μl浓度为20%溶液,溶解在20%的乙腈、0.05%TFA溶液中;先用20%乙腈、0.05%TFA溶液充分平衡的Pharmacia公司的RPC柱,注入10μl样品;在30分钟内,以线性梯度形式使流动相变至0.05%TFA、95%乙腈的水溶液;这种洗脱条件即可将表面活性物质依次分离。
7、用权利要求1方法制备的新型脂肽类生物表面活性剂surfactin的用途,是做为农药分散剂及环境修复剂等助剂使用;经过初步提纯的surfactin,可以配成钠盐做为化妆品添加剂、农药助剂和食品添加剂、洗涤助剂使用;经过进一步分离提纯的产品做为药物前体应用。
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