CN103276035B - 一种枯草菌脂肽及其钠盐的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种枯草菌脂肽及其钠盐的制备方法。该方法为获得保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8种瓶培养物，取保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8种瓶培养物接种于发酵培养基，培养57～168h，经纯化，即得。本发明提供的枯草菌脂肽制备方法可提高枯草菌脂肽酸化粗产物和纯品的产量，减少粗产品中杂质的含量。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及一种枯草菌脂肽及其钠盐的制备方法。
背景技术
表面活性剂是指能显著降低溶剂表面张力和液-液界面张力，并具有一定结构、亲水亲油特性和特殊吸附性能的物质。表面活性剂分子的结构具有一端亲水、一端亲油的不对称结构，溶解于水以后，表面活性剂能降低水的表面张力，并提高有机化合物的可溶性。根据化学结构的不同，表面活性剂分为离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和特殊类型表面活性剂。特殊类型表面活性剂又分为Gemini表面活性剂、生物表面活性剂、元素表面活性剂和高分子表面活性剂。其中，生物表面活性剂是一种新兴的表面活性剂，它是利用生物技术提取的一种两亲结构的物质，主要由发酵和酶法途径生产，除具有化学表面活性剂相同或相近的理化特性外，还具有结构多样性、较低的毒性、生物可降解性、良好的生物相容性、极强的乳化性、良好的起泡性以及生产成本低廉等诸多优点，并且对极端的温度、pH和盐浓度有较高的选择性和专一性，因此，在环保、石油开采、高端化妆品、医药、食品加工等领域具有较大的应用研究价值。
枯草菌脂肽（Surfactin）及其钠盐为生物表面活性剂的一种，Surfactin自1968年被Arima等人首次发现以来，一直是表面活性最强、研究最多的生物表面活性剂之一。Surfactin在20μmol/L浓度下即可使水的表面张力从72mN/m降低到27mN/m，水和正十六烷体系的界面张力从43mN/m降到1mN/m以下，其临界胶束浓度值为7×10－5mol/L。除了具有较强的表面活性外，Surfactin还能增加憎水烃类的可生物降解性，在受烃类污染土壤和海洋的生物修复中发挥重要作用，它还能与部分重金属结合而移除受污染土壤和沉积物中的重金属，并具有一定的抗菌活性。
Surfactin及其钠盐是由枯草芽孢杆菌经发酵合成，利用现有的制备方法生产Surfactin时，酸化粗产物的产量较低，粗产品中含有较多的残糖、中间体、蛋白质和氨基酸等杂质，这些杂质的存在增加了分离纯化的难度，需要投入大量的资金和人员，很难应用于工业化生产。因此，提供一种高产、杂质含量低的枯草菌脂肽及其钠盐的制备方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种枯草菌脂肽及其钠盐的制备方法。该方法通过优化发酵时间，提高了枯草菌脂肽的产量，减少了粗产品中杂质的含量，从而降低了分离纯化的难度，适于工业化生产。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种枯草菌脂肽及其钠盐的制备方法，获得保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8种瓶培养物，取保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8种瓶培养物接种于发酵培养基，培养57～168h，经纯化，即得。
作为优选，培养的时间为73～168h。
作为优选，枯草芽孢杆菌菌株E8种瓶培养物的接种量为发酵培养基体积的1.0～5.0%。
作为优选，培养的温度为30～40℃。
作为优选，培养的转速为150～350r/min。
作为优选，发酵培养基包括葡萄糖或麦芽糖30～50g/L、可溶性淀粉或糊精30～50g/L、L-谷氨酸钠15～25g/L、磷酸二氢钾0.5～2g/L、酵母提取物0.2～5g/L。
作为优选，发酵培养基的pH值为7.0～7.2。
作为优选，保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8种瓶培养物的制备方法包括：
取保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8，接种于母斜面培养基，在30～40℃条件下培养24～90h，获得一级种子，4℃保藏1～20d；
取（0.2～2.0）×（0.2～3.0）cm2的一级种子接种于子斜面培养基，在30～40℃条件下培养24～90h，获得二级种子，4℃保藏1～20d；
取（0.2～1.0）×（0.2～2.0）cm2的二级种子接种于种瓶培养基，在30～40℃、150～350r/min条件下培养12～24h。
作为优选，母斜面培养基包括牛肉膏2～8g/L、蛋白胨5～15g/L、氯化钠2～8g/L、琼脂粉10～25g/L。
作为优选，母斜面培养基的pH值为7.0～7.2。
作为优选，子斜面培养基的配方与pH值可与母斜面培养基的配方与pH值相同。
作为优选，种瓶培养基的配方为：葡萄糖15～25g/L、L-谷氨酸2～10g/L、磷酸二氢钾0.5～2g/L、酵母提取物0.2～5g/L。
作为优选，种瓶培养基的pH值为7.0～7.2。
作为优选，本发明提供的制备方法中纯化具体为：
枯草菌脂肽发酵液经预处理获得枯草菌脂肽粗产物；
溶解枯草菌脂肽粗产物，过滤收集滤液；
调节滤液pH值沉淀蛋白，收集上清液；
取上清液与沉淀剂混合，收集沉淀物，干燥，即得。
在本发明提供的一些实施例中，预处理为发酵液过滤除菌体，调节pH值至2～5，0～8℃静置12～20h，收集沉淀，干燥得枯草菌脂肽粗产物。
作为优选，沉淀剂为氯化钠、脂肪氨盐酸盐、烷磺酸钠、烷基酚醛树脂-聚氧丙烯聚氧乙烯醚、聚甲基苯基硅油-聚氧丙烯聚氧乙烯醚或超高分子聚氧丙烯聚氧乙烯醚。
作为优选，溶解枯草菌脂肽粗产物为加入溶解剂溶解，溶解剂为醇类、脂类或烷类，溶解剂加入量为每1g枯草菌脂肽粗产物加入溶解剂5～30mL。
作为优选，调节滤液pH值沉淀蛋白为滤液先调节pH值至6.5～7.0，然后离心取滤液调节pH值至3.5～5.5，离心。
在本发明提供的一些实施例中，保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8是以沙土管的方式进行保藏，由沙土管转接斜面培养基的接种量为0.01～0.5g的沙土。
本发明还提供了一种枯草菌脂肽钠的制备方法，由本发明提供的枯草菌脂肽的制备方法获得的枯草菌脂肽，经转盐，即得。
在本发明提供的一些实施例中，转盐的方式为碱化成盐。
碱化成盐具体为：取枯草菌脂肽粗产物溶解于水中，以g/mL计，枯草菌脂肽粗产物与水的质量体积比为（5～10）︰（20～50），加NaOH调节pH至6.5～7.5之间，经干燥，即得。
本发明提供了一种枯草菌脂肽及其钠盐的制备方法。该方法为获得保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8种瓶培养物，取保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8种瓶培养物接种于发酵培养基，培养57～168h，经纯化，即得。通过对酸化粗产物含量的测定，本发明提供的制备方法制得的枯草菌脂肽酸化粗产物含量可达15.21～25.30g/L，通过HPLC测定枯草菌脂肽发酵液中枯草菌脂肽纯品含量达到8.15～17.64g/L，制备的枯草菌脂肽纯度为53.58～69.72%，而经发酵培养48h制得的枯草菌脂肽酸化粗产物含量仅为12.49g/L，枯草菌脂肽纯品的含量仅为4.37g/L，纯度为34.99%，结果表明利用本发明提供的制备方法制得的枯草菌脂肽酸化粗产物和纯品的含量高，杂质的含量低。由此可见，利用本发明提供的枯草菌脂肽制备方法可提高枯草菌脂肽酸化粗产物和纯品的产量，减少粗产品中杂质的含量。
附图说明
图1示枯草菌脂肽标准品的HPLC图谱；
图2示实施例1提供的枯草菌脂肽的HPLC图谱；
图3示实施例2提供的枯草菌脂肽的HPLC图谱；
图4示对比例1提供的枯草菌脂肽的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种枯草菌脂肽及其钠盐的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的枯草菌脂肽及其钠盐的制备方法中所用原料或试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1枯草菌脂肽的制备
按照下列培养基的配方进行斜面培养基、种瓶培养基和发酵培养基的制备：
斜面培养基的配方：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉18g/L，pH值7.0～7.2；
种瓶培养基的配方：葡萄糖20g/L、L-谷氨酸5g/L、磷酸二氢钾1g/L、酵母提取物1g/L，pH值7.0～7.2；
发酵培养基的配方：麦芽糖40g/L、可溶性淀粉或糊精40g/L、L-谷氨酸钠20g/L、磷酸二氢钾1g/L、酵母提取物1g/L，pH值7.0～7.2。
取保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8沙土管中0.01g的沙土，接种于母斜面培养基，在40℃条件下培养90h，获得一级种子，在4℃的冰箱中保藏1d；取0.04cm2的母斜面培养基的菌落接种于子斜面培养基，在40℃条件下培养90h，获得子斜面培养基的菌落，在4℃的冰箱中保藏1d；取0.04cm2的子斜面培养基的菌落接种于种瓶培养基，在40℃、350r/min条件下培养24h。按1%的接种量，取种瓶培养基菌液接种于发酵培养基，在40℃、350r/min条件下培养168h，获得枯草菌脂肽发酵液；取枯草菌脂肽发酵液，过滤除去菌体得到发酵上清液，调节发酵上清液pH值至5.0，0℃静置20h，收集沉淀，干燥即得枯草菌脂肽粗产物。
取枯草菌脂肽粗产物加入无水乙醇，每1g枯草菌脂肽粗产物加5mL无水乙醇，并添加1mL聚山梨酯，30～40℃水浴锅中150～350r/m的转速磁力搅拌5h，过滤，向所得滤液中加入0.2%的活性炭，吸附45min，抽滤去除活性炭。调节滤液的pH值至6.5，10000rpm离心20min。然后取离心后的上清液，缓慢滴入4～5.5mol/L的盐酸溶液并缓慢搅拌，调节上清液的pH值至3.5，10000rpm离心20min。收集离心所得上清液，加入上清液20倍体积的氯化钠饱和溶液，然后装入分液装置中静置5h，弃去底部残渣，上清液8000rpm离心30min，收集沉淀，干燥制得枯草菌脂肽成品。
实施例2枯草菌脂肽的制备
按照下列培养基的配方进行斜面培养基、种瓶培养基和发酵培养基的制备：
斜面培养基的配方：牛肉膏2g/L、蛋白胨5g/L、氯化钠8g/L、琼脂粉25g/L，pH值7.0～7.2；
种瓶培养基的配方：葡萄糖15g/L、L-谷氨酸2g/L、磷酸二氢钾2g/L、酵母提取物5g/L，pH值7.0～7.2；
发酵培养基的配方：葡萄糖30g/L、可溶性淀粉或糊精30g/L、L-谷氨酸钠15g/L、磷酸二氢钾2g/L、酵母提取物5g/L，pH值7.0～7.2。
取保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8沙土管中0.2g的沙土，接种于母斜面培养基，在35℃条件下培养50h，获得一级种子，在4℃的冰箱中保藏15d；取2cm2的一级种子接种于子斜面培养基，在35℃条件下培养50h，获得二级种子，在4℃的冰箱中保藏15d；取0.36cm2的二级种子接种于种瓶培养基，在35℃、200r/min条件下培养20h。按3%的接种量，取种瓶培养基菌液接种于发酵培养基，在35℃、200r/min条件下培养73h，获得枯草菌脂肽发酵液；取枯草菌脂肽发酵液，过滤除去菌体得到发酵上清液，调节发酵上清液pH值至2.0，8℃静置12h，收集沉淀，干燥即得枯草菌脂肽粗产物。
按照实施例1中的纯化方法对上述枯草菌脂肽粗产物进行纯化，即得。
实施例3枯草菌脂肽的制备
按照下列培养基的配方进行斜面培养基、种瓶培养基和发酵培养基的制备：
斜面培养基的配方：牛肉膏8g/L、蛋白胨15g/L、氯化钠2g/L、琼脂粉10g/L，pH值7.0～7.2；
种瓶培养基的配方：葡萄糖25g/L、L-谷氨酸10g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、酵母提取物0.2g/L，pH值7.0～7.2；
发酵培养基的配方：麦芽糖50g/L、可溶性淀粉或糊精50g/L、L-谷氨酸钠25g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、酵母提取物0.2g/L，pH值7.0～7.2。
取保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8沙土管中0.5g的沙土，接种于母斜面培养基，在30℃条件下培养24h，获得一级种子，在4℃的冰箱中保藏20d；取6cm2的一级种子接种于子斜面培养基，在30℃条件下培养24h，获得二级种子，在4℃的冰箱中保藏20d；取2cm2的二级种子接种于种瓶培养基，在30℃、150r/min条件下培养12h。按5%的接种量，取种瓶培养基菌液接种于发酵培养基，在30℃、150r/min条件下培养57h，获得枯草菌脂肽发酵液；取枯草菌脂肽发酵液，过滤除去菌体得到发酵上清液，调节发酵上清液pH值至4.0，4℃静置15h，收集沉淀，干燥即得枯草菌脂肽粗产物。
按照实施例1中的纯化方法对上述枯草菌脂肽粗产物进行纯化，即得。
实施例4枯草菌脂肽含量及纯度的测定
取实施例1～3制备枯草菌脂肽的发酵上清液，量取发酵上清液20mL于烧杯中，用盐酸调节发酵上清液pH值至4.0左右，4℃静置12h，10℃、9000rpm离心25min，收集沉淀，60℃烘箱烘干72h，即得枯草菌脂肽酸化粗产物，称量并计算枯草菌脂肽酸化粗产物含量，结果见表4，其中枯草菌脂肽酸化粗产物含量计算公式为：
枯草菌脂肽酸化粗产物含量（g/L）＝枯草菌脂肽质量（g）/发酵上清液体积（L）。
利用HPLC测定枯草菌脂肽发酵液中枯草菌脂肽纯品含量。以乙腈-3.8mM三氟乙酸溶液（80∶20）为流动相。枯草菌脂肽标准品、实施例1和实施例2提供的枯草菌脂肽HPLC图谱如图1、图2、图3所示，图1、图2、图3的图谱数据分别见表1、表2、表3，实施例3提供的枯草菌脂肽HPLC图谱及数据与实施例1和实施例2提供的枯草菌脂肽HPLC图谱及数据相近。
计算枯草菌脂肽纯品含量，并计算枯草菌脂肽纯品纯度，结果见表4。其中，枯草菌脂肽纯品含量和枯草菌脂肽粗产物纯度按下列公式计算：
枯草菌脂肽纯品含量＝样品峰面积/标准品峰面积×标准品浓度×样品稀释倍数；
枯草菌脂肽粗产物纯度＝枯草菌脂肽纯品含量/枯草菌脂肽粗产物含量×100%。
表1本发明提供的枯草菌脂肽标准品HPLC图谱数据
表2本发明实施例1提供的枯草菌脂肽HPLC图谱数据
表3本发明实施例2提供的枯草菌脂肽HPLC图谱数据
表4枯草菌脂肽的含量及纯度
由表4结果可知，实施例1～3提供的枯草菌脂肽酸化粗产物含量达到15.21～25.30g/L，HPLC测定枯草菌脂肽纯品含量达到8.15～17.64g/L，制备的枯草菌脂肽纯度为53.58～69.72%。
实施例5枯草菌脂肽钠的制备
取实施例1制得的枯草菌脂肽，取5g枯草菌脂肽粗产物溶解于50mL水中，滴加0.5mol/L NaOH调节pH至6.5～7.5之间，经干燥，即得。
实施例6枯草菌脂肽钠的制备
取实施例2制得的枯草菌脂肽，取10g枯草菌脂肽粗产物溶解于20mL水中，滴加0.5mol/L NaOH调节pH至6.5～7.5之间，经干燥，即得。
实施例7枯草菌脂肽钠的制备
取实施例3制得的枯草菌脂肽，取8g枯草菌脂肽粗产物溶解于40mL水中，滴加0.5mol/L NaOH调节pH至6.5～7.5之间，经干燥，即得。
对比例1枯草菌脂肽的制备及含量测定
按照下列培养基的配方进行斜面培养基、种瓶培养基和发酵培养基的制备：
斜面培养基的配方：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉18g/L，pH值7.0～7.2；
种瓶培养基的配方：葡萄糖20g/L、L-谷氨酸5g/L、磷酸二氢钾1g/L、酵母提取物1g/L，pH值7.0～7.2；
发酵培养基的配方：麦芽糖40g/L、可溶性淀粉或糊精40g/L、L-谷氨酸钠20g/L、磷酸二氢钾1g/L、酵母提取物1g/L，pH值7.0～7.2。
取保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8沙土管中0.1g的沙土，接种于母斜面培养基，在33℃条件下培养72h，获得一级种子，在4℃的冰箱中保藏2d；取1cm2的一级种子接种于子斜面培养基，在33℃条件下培养72h，获得二级种子，在4℃的冰箱中保藏2d；取1cm2的二级种子接种于种瓶培养基，在33℃、200r/min条件下培养24h。按1%的接种量，取种瓶培养基菌液接种于发酵培养基，在37℃、200r/min条件下培养48h，获得枯草菌脂肽发酵液；取枯草菌脂肽发酵液，过滤除去菌体得到发酵上清液，调节发酵上清液pH值至5.0，0℃静置20h，收集沉淀，干燥即得枯草菌脂肽酸化粗产物。
溶解枯草菌脂肽酸化粗产物，过滤收集滤液，调节滤液pH值沉淀蛋白，收集上清液，加入沉淀剂，收集沉淀物；溶解沉淀物，调pH值至6～7，经结晶、干燥、层析，即得。
取本对比例制得的枯草菌脂肽的发酵上清液20mL于烧杯中，用盐酸调节发酵上清液pH值至4.0左右，4℃静置12h，10℃、9000rpm离心25min，收集沉淀，60℃烘箱烘干72h，即得枯草菌脂肽酸化粗产物，称量并计算枯草菌脂肽酸化粗产物含量。
利用HPLC测定枯草菌脂肽发酵液中枯草菌脂肽纯品含量。以乙腈-3.8mM三氟乙酸溶液（80∶20）为流动相。枯草菌脂肽的HPLC图谱如图4所示，图谱数据见表5。
表5本发明对比例1提供的枯草菌脂肽HPLC图谱数据
通过测定，本对比例提供的枯草菌脂肽酸化粗产物含量仅为12.49g/L，枯草菌脂肽纯品的含量仅为4.37g/L，纯度为34.99%，而本发明提供的枯草菌脂肽的制备方法制得的枯草菌脂肽酸化粗产物含量达到15.21～25.30g/L，枯草菌脂肽纯品的含量达到8.15～17.64g/L，纯度为53.58～69.72%，结果表明本发明提供的枯草菌脂肽的制备方法制得的枯草菌脂肽酸化粗产物和纯品的含量均比对比例提供的方法制得的枯草菌脂肽酸化粗产物和纯品的含量高，且杂质的含量低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种枯草菌脂肽的制备方法，其特征在于，获得保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8种瓶培养物，取所述保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8种瓶培养物接种于发酵培养基，培养57～168h，经纯化，即得；
所述保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8种瓶培养物的制备方法包括：
取保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8，接种于母斜面培养基，在30～40℃条件下培养24～90h，获得一级种子，4℃保藏1～20d；
取(0.2～2.0)×(0.2～3.0)cm2的所述一级种子接种于子斜面培养基，在30～40℃条件下培养24～90h，获得二级种子，4℃保藏1～20d；
取(0.2～1.0)×(0.2～2.0)cm2的所述二级种子接种于种瓶培养基，在30～40℃、150～350r/min条件下培养12～24h；
所述枯草芽孢杆菌菌株E8种瓶培养物的接种量为发酵培养基体积的1.0～5.0％；所述培养的温度为30～40℃；所述培养的转速为150～350r/min；
所述发酵培养基包括：葡萄糖或麦芽糖30～50g/L、可溶性淀粉或糊精30～50g/L、L-谷氨酸钠15～25g/L、磷酸二氢钾0.5～2g/L、酵母提取物0.2～5g/L；
所述母斜面培养基包括牛肉膏2～8g/L、蛋白胨5～15g/L、氯化钠2～8g/L、琼脂粉10～25g/L。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，取保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌菌株E8种瓶培养物接种于发酵培养基，培养73～168h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH值为7.0～7.2。
4.一种枯草菌脂肽钠的制备方法，其特征在于，如权利要求1至3任一项所述的制备方法获得的枯草菌脂肽，经转盐，即得。
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