CN101327975A - 一种制备微生物絮凝剂的方法 - Google Patents
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Abstract
一种制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于：采用戴尔福特食酸菌作为制备微生物絮凝剂的菌种来源通过液体培养基的制备、菌种的发酵培养、絮凝剂粗制品的制备和絮凝剂精制品的制备步骤制备成微生物絮凝剂。本发明为国内首次发现戴尔福特食酸菌可产生絮凝性能稳定、絮凝效果较好的微生物絮凝剂，筛选出的絮凝剂具有絮凝活性高、用量少、发酵时间短、提取工艺简单等优良特性，可大大降低生产成本；该菌生产絮凝剂的方法简单，易行；对实际废水处理实验表明，该絮凝剂应用后，絮凝效果比较理想。
Description
技术领域
本发明属于微生物科学领域，特别涉及一种制备微生物絮凝剂的方法。
背景技术
絮凝技术是广泛应用于给水、废水处理、污泥脱水等处理过程中的一项重要举措，絮凝效果如何关键取决于絮凝剂的选择上。长期以来，给水和废水处理使用的絮凝剂主要有两大类：以铝盐、铁盐及其水解聚合物为代表的无机絮凝剂和以聚丙烯酰胺及其衍生物为代表的有机高分子絮凝剂。尽管无机和有机絮凝剂因其具有良好的絮凝效果和较低的成本而得到广泛应用，然而它们在使用过程中给环境造成的二次污染不得不引起人们的重视。研究表明，无机絮凝剂中的铝离子易引起老年性痴呆症；铁盐絮凝剂中的铁盐对金属有腐蚀作用，可造成处理水中带有颜色，易形成某些难絮凝沉淀的化合物；而聚丙烯酰胺类絮凝剂的合成单体丙烯酰胺具有累积性神经毒性，已被确定为有基因毒性的致癌物。随着生物科学领域许多重大突破的取得，特别是微生物被广泛地应用于环境治理，20世纪80年代，各国的科学家研制开发出了第三代絮凝剂——微生物絮凝剂。该类絮凝剂是利用生物技术，通过微生物发酵、分离提取其代谢产物而得到的一种新型水处理剂，具有安全、可生物降解、对环境和人类健康无害等优点。
目前，很多国家对微生物絮凝剂进行了研究，筛选出多种能够产生絮凝剂的微生物，包括细菌，霉菌，酵母菌，放线菌和藻类等，并在絮凝条件、机理，絮凝剂分离纯化、性质、应用，产絮凝剂的基因控制等诸方面进行了一系列的研究。如1986年，R.Kurane等利用红球菌属微生物Rhodococcus etythropolis制成絮凝剂NOC-1，它对大肠杆菌、酵母菌、泥浆水、河水、粉煤灰水、活性炭粉水、膨胀污泥、纸浆废水等均有极好的絮凝和脱色效果。1991年，K.Toeda等从土壤中分离出革兰氏阴性菌——产碱杆菌Alcaligcnecupidus AL201，该菌在含有蔗糖的培养基中生长并分泌絮凝物质。Y.Baror P.和Hormidium发现一些海底蓝细菌(蓝藻)如Anabaenopsiscirculais PCC6720和Phormidium sp.J-1菌J-1能产生数量可观的胞外絮凝剂。1994年，Kurane等报道分离出一组能够产生大量粘液的R-3的混合菌株，在液体培养中能高效产生APR-3絮凝剂。在此之后的研究中，比较有代表性的是1997年Suh.H-H等人发现的DP-152絮凝剂，这是首次发现杆状细菌也能产生絮凝剂。
我国对于絮凝剂产生菌及微生物絮凝剂的研究起步较晚，从20世纪90年代起，国内有关絮凝剂产生菌及微生物絮凝剂的报道日渐多起来了。1980年台湾的邓德丰等从废水处理场的废水中分离得到具有絮凝作用的C-62细菌菌株。1996年张本兰用从活性污泥中筛选出的微生物菌株P.Alcaligenes 8724，其脱色率分别达95％和98％以上。1999年邓述波等用从土壤中分离得到的A-9菌株所产生的絮凝剂对淀粉厂废水进行处理。胡筱敏等利用A-9所产生的微生物絮凝剂MBFA9处理含泥河水、硫化染料废水和淀粉黄浆废水，效果明显优于传统的化学絮凝剂。武汉市建设学院康建雄、陶涛用黑酵母以淀粉水解或葡萄糖为原料发酵产生普鲁兰絮凝剂。江南大学的李寅、何宁等研究了新型蛋白聚糖类微生物絮凝剂REA-11的合成途径。
生物絮凝剂的化学成份主要是多聚糖和蛋白质以及一些金属离子，因而其提取方法与一般的多聚糖和蛋白质提取方法并无多大的差异，提取方法现有多种，因絮凝剂的具体结构而异，也与最终要求达到的纯度和使用的方式有关，较常用的有下面三种：
凝胶电泳：将细菌培养物过滤，取滤液用6mol/L的HCl将pH调到7.0，离心分离沉淀，取沉淀物加0.5mol/L的NaOH溶解，离心分离，取沉淀，用1∶1的氯仿和甲醇混合液提取，之后离心，用0.1mol/L盐酸将沉淀溶解，再加6mol/L的NaOH溶液调pH到7.0，离心后，用乙酸盐缓冲液(0.01mol/L pH为4.0)溶解沉淀物。最后用DEAE琼脂糖凝胶柱(A-50)色谱和琼脂糖凝胶柱(G-200)色谱分离提纯。然后可以用获得的纯品进行化学分析。
溶剂提取：用丙酮提取可以获得生物絮凝剂的粗制剂，将细菌培养物过滤，取滤液，用丙酮以1∶1的比例提取，然后离心，取沉淀物用50％的丙酮洗，之后冷冻干燥，就可得到絮凝剂的粗制剂，粗制剂可以用于实验室的絮凝能力研究试验和工业用途。
碱提取：用NaOH从活性污泥中提取生物絮凝剂的方法如下：将经驯化的活性污泥静置，用水洗污泥3次；加入NaOH溶液，慢速搅拌数小时，离心后取上清液；加乙醇至到60％的浓度，4℃冰箱中放置过夜，离心后去上清液，加60％乙醇，离心后去上清液，加90％丙酮，离心后去上清液，加乙醚，离心后去上清液；将沉积物溶于少量蒸馏水中，在2～3天内透析数次，在50℃下减压浓缩，并冷冻干燥粉状，得到精制絮凝剂。
尽管微生物絮凝剂具有无毒、无二次污染及生物可降解的特点，但由于其具有生产成本高，发酵周期长，絮凝效率低，产絮凝剂的性状不稳定等缺点，使其还没有进行大规模的工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于针对上述已有技术存在的不足，提供一种采用戴尔福特食酸菌(Delftiaacidovorans)制备微生物絮凝剂的方法，该戴尔福特食酸菌经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏日期：2007年05月11日，保藏编号：2041，分类命名：Delftia acidovorans。
本发明的技术方案如下：
1、确定最适宜作为微生物絮凝剂的菌种：
1.1、以肥沃土壤、河(湖)水底泥，活性污泥等作为菌种来源样品，按常规方法制备培养基，采用稀释涂布平板分离法对样品进行微生物菌种分离，待形成单菌落后，按各单菌落所用的固体培养基配制液体培养基，按常规方法将单菌落接种于液体培养基中进行空气浴震荡器震荡培养，制备成微生物培养液。
1.2、对所培养的微生物进行初筛，初筛的目的是为了找出能够产生微生物絮凝剂的菌种。初筛的方法为：在试管中装入浓度为5g/L的高岭土悬浮液20ml，加入2～3滴培养后的微生物培养液，震荡、摇匀、静置5min，观察是否有絮团生成，若有絮团生成，则说明该菌具有絮凝效果，能够作为微生物絮凝剂进行培养。
1.3、将获得的具有絮凝效果的细菌菌株，采用平板划线法对所培养的细菌菌株进行分离和纯化，获得纯菌株，并制备成微生物培养液，对高岭土悬浮液进行絮凝处理，絮凝率的确定如下：
在100ml量筒中加入0.5g高岭土(平均粒度约为2μm)，加100ml蒸馏水摇匀后，制备成高岭土悬浮液，加入一定量所得细菌菌株的微生物培养液，摇匀后静置5min，取50ml处上清液采用722分光光度计测定光密度OD550，以不加微生物培养液的高岭土悬浮液作为对比，通过下列公式确定絮凝率E(％)：
E(％)＝(A-B)/A×100
其中：A为絮凝处理前550nm处的光密度值；B为絮凝处理后550nm处的光密度值。
将所产微生物絮凝剂絮凝率最高的菌种作为研究对象，并进行鉴定，经鉴定该菌种为戴尔福特食酸菌(Delftia acidovorans)。测其絮凝率在97％以上。
2、微生物絮凝剂的制备：
2.1液体培养基的配制：
戴尔福特食酸菌的液体培养基组成为：可溶性淀粉5～20克，NaNO3 1～10克，K2HPO4 0.5～5克，MgSO4·7H2O 0.1～2克，KCl 0.1～2克，调节pH＝5.0～9.0，1000mL蒸馏水。
按上述比例将可溶性淀粉、NaNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O和KCl加入到蒸馏水中，搅拌均匀，即配制成戴尔福特食酸菌的液体培养基。
2.2、菌种的发酵培养：
将液体培养基进行高压蒸汽灭菌，然后放入经过灭菌的种子培养容器中，接种戴尔福特食酸菌菌株，然后将种子培养器放入HZQ-C型空气浴震荡器中，在20～40℃，120～180r/min的条件下培养10～15h，获得戴尔福特食酸菌种子培养液。
将戴尔福特食酸菌种子培养液接种于装有液体培养基的发酵罐中进行搅拌发酵，其中发酵罐经过空罐蒸汽充汽灭菌，装入液体培养基后再经过实罐灭菌；接种按种子培养液体积占液体培养基体积的10～20％，发酵温度为25～35℃，鼓入空气量为0.5～1.0L/min，电机搅拌速度为140～160r/min，培养时间为15～50h，以此获得戴尔福特食酸菌发酵液。
2.3、絮凝剂粗制品的制备：
在戴尔福特食酸菌发酵液中加入2～10倍体积的蒸馏水稀释，在室温和转速为70r/min条件下搅拌2h以上，然后在5000～8000r/min条件下离心分离10～30min去除菌体；将离心分离后的液体在40～60℃条件下蒸发浓缩至0.5倍原体积；将浓缩后的液体在4℃条件下预冷1h以上，然后加入2～4倍体积无水冷乙醇，混合均匀后，可见丝状絮凝沉淀物产生，在4℃条件下放置12h以上，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物。
将获得的液体部分加入等体积的质量浓度为80％的乙醇，静置获得絮凝沉淀物，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物。
再于分离后的液体部分加入等体积的质量浓度为80％的乙醇，静置获得絮凝沉淀物，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物。
收集三次获得的絮凝沉淀物，以3000～6000r/min的速度离心10min，将离心后的固相真空干燥5～6h，获得絮凝剂粗制品，其中真空干燥条件为：温度为60℃±2，真空度为0.06MPa。
其中无水冷乙醇为在4℃条件下预冷1h以上的无水乙醇。
2.4、絮凝剂精制品的制备：
将絮凝剂粗制品溶解于无菌水中，获得絮凝剂粗制品溶解液，溶解按质量比例为絮凝剂粗制品∶无菌水＝1∶100，加入有机溶液，加入量按体积比为絮凝剂粗制品溶解液∶有机溶液＝1∶0.5～2，以120～160r/min的速度室温振荡12h以上，静置分层，下层减压蒸馏回收，上层液体在速度为3000～6000r/min的条件下离心10～30min，保存上清液，将固相溶解于无菌水中重复3次提取操作。
收集上清液，将上清液装入清洗后的透析袋里，用去离子水在40±2℃条件下透析24～60小时，透析内液(上清液)与透析外液(去离子水)体积比为1∶8～12，每隔8小时换一次透析外液。透析完成后将透析内液加入2～6倍体积的无水冷乙醇，静置1h以上，产生絮凝沉淀物，然后以3000～6000r/min的速度离心10～30min，收集固相，真空干燥4～6h后，得到微生物絮凝剂精制品，其中真空干燥条件为：温度为60℃±2，真空度为0.06Mpa。
透析袋的清洗方法为：用质量浓度为50％乙醇煮沸1小时，再依次用质量浓度50％乙醇、浓度为0.01mol/L的碳酸氢钠溶液和浓度为0.001mol/L的EDTA溶液整体洗涤，最后用蒸馏水整体冲洗后使用。
有机溶液为氯仿和正丁醇混合液，有机溶液的成分按体积比为氯仿∶正丁醇＝1.25～4∶1；无水冷乙醇为在4℃条件下预冷1h以上的无水乙醇。
经过实验验证表明，该微生物絮凝剂对抚顺市天湖啤酒厂生产废水絮凝率达95％，CODCr去除率达79.2％；对沈阳市印染工业园华岳印染厂生产废水絮凝率达93％，色度去除率达98.6％，CODCr去除率达78.8％；与聚合氯化铝(PAC)复配协同处理沈阳市南湖公园含藻湖水，絮凝率达99％，CODCr去除率达69.4％，并且可有效减少PAC的投加量，从而降低无机絮凝剂引起的二次污染。
本发明的优点在于：(1)本发明为国内首次发现戴尔福特食酸菌可产生絮凝性能稳定、絮凝效果较好的微生物絮凝剂，由此可丰富现有的絮凝剂产生菌的种类库；(2)筛选出的戴尔福特食酸菌所产絮凝剂具有絮凝活性高、用量少、发酵时间短、提取工艺简单等优良特性，可大大降低生产成本；(3)该絮凝剂适用温度为20～90℃，适用pH为3～10，根据不同处理对象用量范围为0.1ml/L～1ml/L，展现了其广泛的实际废水应用潜力，具有很好的推广价值；(4)该菌生产絮凝剂的方法简单，易行；(5)对实际废水处理实验表明，该絮凝剂应用后，絮凝效果比较理想。
具体实施方式
本发明采用HZQ-C型空气浴震荡器作为初筛振荡摇匀设备和种子培养设备。
本发明采用锥形瓶作为种子培养器，种子培养液的高压蒸汽灭菌采用LD2X-40BI电热压力蒸汽灭菌器，操作条件为在温度121℃，压力为0.105Mpa的条件下维持20～30min。
本发明采用的发酵罐为DS-Y-10L微生物发酵罐。
本发明的发酵罐空罐及其中的液体培养基采用DZFZ6全自动电热蒸汽发生器进行蒸汽充汽灭菌，灭菌时间为20～30min，额定工作压力为0.4Mpa，饱和蒸汽温度为152℃。
本发明中的无水冷乙醇为在4℃条件下预冷1h以上的无水乙醇。
本发明离心分离用的设备为TGL·16G型台式高速离心机，工作时温度为10℃。
本发明采用的无菌水为用高压蒸汽灭菌锅处理的去离子水，处理条件为在温度121℃，压力0.105Mpa的条件下维持20～30min。
本发明采用的氯仿和正丁醇纯度为分析纯。
实施例1
采用河水底泥作为菌种来源，按常规方法制备培养基，待形成单菌落后，按各单菌落所用的固体培养基配制液体培养基，按常规方法将单菌落放入液体培养基中培养，制备成微生物培养液。
对所培养的细菌进行初筛，初筛方法为：在试管中装入浓度为5g/L的高岭土悬浮液20ml，加入2～3滴培养后的微生物培养液，震荡、摇匀、静置5min，观察是否有絮团生成，将有絮团生成的细菌作为微生物絮凝剂产生菌进行培养。将获得的具有絮凝效果的细菌菌株，采用平板划线法对所培养的细菌菌株进行分离和纯化，获得纯菌株，并制备成微生物培养液，对高岭土悬浮液进行絮凝处理。
在100ml量筒中加入0.5g高岭土(平均粒度约为2μm)，加100ml水摇匀后，制备成高岭土悬浮液，加入0.01mL所得细菌菌株的微生物培养液，摇匀后静置5min，取50ml处上清液采用722分光光度计测定光密度OD550，以不加微生物培养液的高岭土悬浮液作为对比，计算絮凝率。选择絮凝率为97％以上的细菌菌株进行鉴定，经鉴定为戴尔福特食酸菌。
戴尔福特食酸菌外观特征为：该菌于生化培养箱中30℃条件下，在琼脂培养基上培养72小时后，菌落为圆形，直径0.3cm左右，光滑湿润透明，有光泽，不分泌色素，边缘规则整齐，突起0.1cm左右，正反面颜色一致，用接种环挑菌时感到粘着而有弹性；用显微镜观察细胞，该菌的菌体形状为杆状，菌体细长，半透明，无芽孢形成，有荚膜。
戴尔福特食酸菌生理生化特征见表1。
表1 戴尔福特食酸菌主要生理生化特征
| 生化特征 | 结果 | 生化特征 | 结果 |
| 细胞形态 | 杆状 | 蔗糖 | + |
| 革兰氏染色 | 阴性 | 木糖醇 | - |
| O/F试验 | 氧化 | 乙酸 | - |
| 对照 | - | 甲酸 | + |
| 氧化酶 | a-羟基丁酸 | B | |
| 糊精 | + | b-羟基丁酸 | + |
| 糖原 | - | g-羟基丁酸 | - |
| N-乙酰半乳糖胺 | + | L丙氨酰胺 | - |
| N-乙酰葡萄糖胺 | + | L-谷胺酸 | + |
| 核糖醇 | B | 甘氨酰天冬氨酸 | - |
| D-果糖 | + | 羟基脯氨酸 | - |
| D-半乳糖 | + | 尿刊酸 | + |
| 麦芽糖 | + | 苯基乙胺 | - |
| D-甘露醇 | + | 甘油 | + |
液体培养基的配制比例按可溶性淀粉10克，NaNO3 3克，K2HPO4 1.2克，MgSO4·7H2O 0.5克，KCl 0.5克放入1000mL蒸馏水中并调节pH＝6.0配制。将液体培养基和250mL锥形瓶进行高压蒸汽灭菌；以锥形瓶作为种子培养器，将50mL高压蒸汽灭菌后的液体培养基放入种子培养器中；将戴尔福特食酸菌菌株接种到装有液体培养基的种子培养器中，然后将种子培养器放入HZQ-C型空气浴震荡器中，在30℃，150r/min的条件下培养10h，获得的戴尔福特食酸菌种子培养液。
将获得的戴尔福特食酸菌种子培养液接种到装有液体培养基的微生物发酵罐中进行发酵，接种比例为种子培养液体积占液体培养基体积的10％，其中微生物发酵罐经过蒸汽充汽灭菌，装入液体培养基后再经过实罐蒸汽充汽灭菌。发酵温度为30℃，鼓入空气搅拌，鼓入空气量为0.5L/min，电机搅拌速度为150r/min，发酵45h，获得戴尔福特食酸菌发酵液。
在戴尔福特食酸菌发酵液中加入4倍体积的蒸馏水稀释，在室温条件下搅拌2h，搅拌速度为70r/min，然后将获得的液体在5000r/min条件下离心分离30min去除菌体，用旋转蒸发器将离心分离后的液体在60℃条件下蒸发浓缩至0.5倍原体积。
将浓缩后的液体放入冰箱中，在4℃条件下放置1h，然后加入2倍体积无水冷乙醇，混合均匀后，可见丝状絮凝沉淀物产生，放入冰箱，在4℃条件下下放置12h，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物。
将获得的液体部分加入等体积的质量浓度为80％的乙醇，静置1h获得絮凝沉淀物，将液体部分倒出，保留絮凝物质沉淀。
再于分离后的液体部分加入等体积的质量浓度为80％的乙醇，静置1h获得絮凝沉淀物，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物。
收集三次获得的絮凝沉淀物，以3000r/min的速度离心10min，将离心后的固相真空干燥6h，获得絮凝剂粗制品；真空干燥在温度为60℃±2，真空度为0.06Mpa的条件下进行。
将絮凝剂粗制品溶解于无菌水中，获得絮凝剂粗制品溶解液，溶解按重量比例为絮凝剂粗制品∶无菌水＝1∶100，加入氯仿和正丁醇的混合液体，加入量按体积比为絮凝剂粗制品溶解液∶氯仿/正丁醇混合液＝1∶0.5，其中氯仿/正丁醇混合液的成分按体积比为氯仿∶正丁醇＝1.25∶1，放入空气浴震荡器中，以120r/min的速度室温振荡12h以上，静置分层，下层液体为氯仿层，减压蒸馏回收，上层液体在速度为3000r/min的条件下离心30min，保存上清液，将固相重新溶解于无菌水中重复3次提取操作。
收集上清液，将上清液装入清洗后的透析袋里，用去离子水在40±2℃条件下透析24小时，其中透析内液与透析外液体积比为1∶10，每隔8小时换一次透析外液。然后将透析内液加入2倍体积的无水冷乙醇，静置1h上，产生絮凝沉淀物，放入高速离心机中以6000r/min的速度离心10min，收集固相，真空干燥4h后，获得微生物絮凝剂精制品，其中真空干燥条件为：温度为60℃±2，真空度为0.06MPa。
采用该微生物絮凝剂对抚顺市天湖啤酒厂生产废水进行处理，处理方法为：
在100ml量筒中加入95ml啤酒废水，然后加入1％CaCl2溶液5ml，0.05ml微生物絮凝剂，调pH至9.0。然后用搅拌器以200r/min快搅1min，再以70r/min慢搅10min，静止沉降5min后，测定量筒50ml处上清液的光密度OD、CODCr，分析结果絮凝率为95％，CODCr去除率达79.2％。
实施例2
戴尔福特食酸菌的获得方法同实施例1。
液体培养基的配制比例按可溶性淀粉5克，NaNO3 10克，K2HPO4 0.5克，MgSO4·7H2O 0.1克，KCl 0.1克放入1000mL蒸馏水中并调节pH＝7.0配制。将液体培养基和250mL锥形瓶进行高压蒸汽灭菌；以锥形瓶作为种子培养器，将50mL高压蒸汽灭菌后的液体培养基放入种子培养器中；将戴尔福特食酸菌菌株接种到装有液体培养基的种子培养器中，然后将种子培养器放入HZQ-C型空气浴震荡器中，在20℃，180r/min的条件下培养15h，获得的戴尔福特食酸菌种子培养液。
将获得的戴尔福特食酸菌种子培养液接种到装有液体培养基的微生物发酵罐中进行发酵，接种比例为种子培养液体积占液体培养基体积的15％，其中微生物发酵罐经过蒸汽充汽灭菌，装入液体培养基后再经过实罐蒸汽充汽灭菌。发酵温度为35℃，鼓入空气搅拌，鼓入空气量为0.8L/min，电机搅拌速度为160r/min，发酵15h，获得戴尔福特食酸菌发酵液。
在戴尔福特食酸菌发酵液中加入6倍体积的蒸馏水稀释，在室温条件下搅拌2h，搅拌速度为70r/min，然后将获得的液体在6000r/min条件下离心分离25min去除菌体，用旋转蒸发器将离心分离后的液体在55℃条件下蒸发浓缩至0.5倍原体积。
将浓缩后的液体放入冰箱中，在4℃条件下放置1h，然后加入3倍体积无水冷乙醇，混合均匀后，可见丝状絮凝沉淀物产生，放入冰箱，在4℃条件下下放置12h，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物。
将获得的液体部分加入等体积的质量浓度为80％的乙醇，静置1h获得絮凝沉淀物，将液体部分倒出，保留絮凝物质沉淀。
再于分离后的液体部分加入等体积的质量浓度为80％的乙醇，静置1h获得絮凝沉淀物，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物。
收集三次获得的絮凝沉淀物，以4000r/min的速度离心10min，将离心后的固相真空干燥5h，获得絮凝剂粗制品；真空干燥在温度为60℃±2，真空度为0.06Mpa的条件下进行。
将絮凝剂粗制品溶解于无菌水中，获得絮凝剂粗制品溶解液，溶解按重量比例为絮凝剂粗制品∶无菌水＝1∶100，加入氯仿和正丁醇的混合液体，加入量按体积比为絮凝剂粗制品溶解液∶氯仿/正丁醇混合液＝1∶1，其中氯仿/正丁醇混合液的成分按体积比为氯仿∶正丁醇＝1.5∶1，放入空气浴震荡器中，以130r/min的速度室温振荡12h以上，静置分层，下层液体为氯仿层，减压蒸馏回收，上层液体在速度为4000r/min的条件下离心25min，保存上清液，将固相重新溶解于无菌水中重复3次提取操作。
收集上清液，将上清液装入清洗后的透析袋里，用去离子水在40±2℃条件下透析32小时，其中透析内液与透析外液体积比为1∶8，每隔8小时换一次透析外液。然后将透析内液加入3倍体积的无水冷乙醇，静置1h上，产生絮凝沉淀物，放入高速离心机中以5000r/min的速度离心15min，收集固相，真空干燥5h后，获得微生物絮凝剂精制品，其中真空干燥条件为：温度为60℃±2，真空度为0.06MPa。
采用该微生物絮凝剂对沈阳市印染工业园华岳印染厂生产废水，处理方法为：
在100ml量筒中加入95ml印染废水，然后加入1％CaCl2溶液5ml，加入0.5ml微生物絮凝剂，调pH至9.0。用搅拌器以200r/min快搅1min，再以70r/min慢搅10min，静止沉降5min后，测定量筒50ml处上清液的光密度OD、CODCr。分析结果絮凝率为93％，色度去除率达98.6％，CODCr去除率达78.8％。
实施例3
戴尔福特食酸菌的获得方法同实施例1。
液体培养基的配制比例按可溶性淀粉20克，NaNO3 8克，K2HPO4 5克，MgSO4·7H2O 2克，KCl 2克放入1000mL蒸馏水中并调节pH＝8.0配制。将液体培养基和250mL锥形瓶进行高压蒸汽灭菌；以锥形瓶作为种子培养器，将50mL高压蒸汽灭菌后的液体培养基放入种子培养器中；将戴尔福特食酸菌菌株接种到装有液体培养基的种子培养器中，然后将种子培养器放入HZQ-C型空气浴震荡器中，在35℃，160r/min的条件下培养12h，获得的戴尔福特食酸菌种子培养液。
将获得的戴尔福特食酸菌种子培养液接种到装有液体培养基的微生物发酵罐中进行发酵，接种比例为种子培养液体积占液体培养基体积的13％，其中微生物发酵罐经过蒸汽充汽灭菌，装入液体培养基后再经过实罐蒸汽充汽灭菌。发酵温度为25℃，鼓入空气搅拌，鼓入空气量为1.0L/min，电机搅拌速度为150r/min，发酵30h，获得戴尔福特食酸菌发酵液。
在戴尔福特食酸菌发酵液中加入8倍体积的蒸馏水稀释，在室温条件下搅拌2h，搅拌速度为70r/min，然后将获得的液体在7000r/min条件下离心分离20min去除菌体，用旋转蒸发器将离心分离后的液体在50℃条件下蒸发浓缩至0.5倍原体积。
将浓缩后的液体放入冰箱中，在4℃条件下放置1h，然后加入4倍体积无水冷乙醇，混合均匀后，可见丝状絮凝沉淀物产生，放入冰箱，在4℃条件下下放置12h，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物。
将获得的液体部分加入等体积的质量浓度为80％的乙醇，静置1h获得絮凝沉淀物，将液体部分倒出，保留絮凝物质沉淀。
再于分离后的液体部分加入等体积的质量浓度为80％的乙醇，静置1h获得絮凝沉淀物，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物。
收集三次获得的絮凝沉淀物，以5000r/min的速度离心10min，将离心后的固相真空干燥6h，获得絮凝剂粗制品；真空干燥在温度为60℃±2，真空度为0.06Mpa的条件下进行。
将絮凝剂粗制品溶解于无菌水中，获得絮凝剂粗制品溶解液，溶解按重量比例为絮凝剂粗制品∶无菌水＝1∶100，加入氯仿和正丁醇的混合液体，加入量按体积比为絮凝剂粗制品溶解液∶氯仿/正丁醇混合液＝1∶1.5，其中氯仿/正丁醇混合液的成分按体积比为氯仿∶正丁醇＝2∶1，放入空气浴震荡器中，以140r/min的速度室温振荡12h以上，静置分层，下层液体为氯仿层，减压蒸馏回收，上层液体在速度为5000r/min的条件下离心20min，保存上清液，将固相重新溶解于无菌水中重复3次提取操作。
收集上清液，将上清液装入清洗后的透析袋里，用去离子水在40±2℃条件下透析40小时，其中透析内液与透析外液体积比为1∶12，每隔8小时换一次透析外液。然后将透析内液加入4倍体积的无水冷乙醇，静置1h上，产生絮凝沉淀物，放入高速离心机中以4000r/min的速度离心20min，收集固相，真空干燥6h后，获得微生物絮凝剂精制品，其中真空干燥条件为：温度为60℃±2，真空度为0.06MPa。
实施例4
戴尔福特食酸菌的获得方法同实施例1。
液体培养基的配制比例按可溶性淀粉15克，NaNO3 5克，K2HPO4 2.5克，MgSO4·7H2O 1.5克，KC1.5克放入1000mL蒸馏水中并调节pH＝9.0配制。将液体培养基和250mL锥形瓶进行高压蒸汽灭菌；以锥形瓶作为种子培养器，将50mL高压蒸汽灭菌后的液体培养基放入种子培养器中；将戴尔福特食酸菌菌株接种到装有液体培养基的种子培养器中，然后将种子培养器放入HZQ-C型空气浴震荡器中，在40℃，120/min的条件下培养14h，获得的戴尔福特食酸菌种子培养液。
将获得的戴尔福特食酸菌种子培养液接种到装有液体培养基的微生物发酵罐中进行发酵，接种比例为种子培养液体积占液体培养基体积的20％，其中微生物发酵罐经过蒸汽充汽灭菌，装入液体培养基后再经过实罐蒸汽充汽灭菌。发酵温度为30℃，鼓入空气搅拌，鼓入空气量为0.7L/min，电机搅拌速度为140r/min，发酵50h，获得戴尔福特食酸菌发酵液。
在戴尔福特食酸菌发酵液中加入10倍体积的蒸馏水稀释，在室温条件下搅拌2h，搅拌速度为70r/min，然后将获得的液体在6000r/min条件下离心分离15min去除菌体，用旋转蒸发器将离心分离后的液体在45℃条件下蒸发浓缩至0.5倍原体积。
将浓缩后的液体放入冰箱中，在4℃条件下放置1h，然后加入2倍体积无水冷乙醇，混合均匀后，可见丝状絮凝沉淀物产生，放入冰箱，在4℃条件下下放置12h，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物。
将获得的液体部分加入等体积的质量浓度为80％的乙醇，静置1h获得絮凝沉淀物，将液体部分倒出，保留絮凝物质沉淀。
再于分离后的液体部分加入等体积的质量浓度为80％的乙醇，静置1h获得絮凝沉淀物，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物。
收集三次获得的絮凝沉淀物，以6000r/min的速度离心10min，将离心后的固相真空干燥5h，获得絮凝剂粗制品；真空干燥在温度为60℃±2，真空度为0.06Mpa的条件下进行。
将絮凝剂粗制品溶解于无菌水中，获得絮凝剂粗制品溶解液，溶解按重量比例为絮凝剂粗制品∶无菌水＝1∶100，加入氯仿和正丁醇的混合液体，加入量按体积比为絮凝剂粗制品溶解液∶氯仿/正丁醇混合液＝1∶2，其中氯仿/正丁醇混合液的成分按体积比为氯仿∶正丁醇＝2.5∶1，放入空气浴震荡器中，以150r/min的速度室温振荡12h以上，静置分层，下层液体为氯仿层，减压蒸馏回收，上层液体在速度为6000r/min的条件下离心15min，保存上清液，将固相重新溶解于无菌水中重复3次提取操作。
收集上清液，将上清液装入清洗后的透析袋里，用去离子水在40±2℃条件下透析48小时，其中透析内液与透析外液体积比为1∶10，每隔8小时换一次透析外液。然后将透析内液加入5倍体积的无水冷乙醇，静置1h上，产生絮凝沉淀物，放入高速离心机中以3000r/min的速度离心25min，收集固相，真空干燥4h后，获得微生物絮凝剂精制品，其中真空干燥条件为：温度为60℃±2，真空度为0.06MPa。
实施例5
戴尔福特食酸菌的获得方法同实施例1。
液体培养基的配制比例按可溶性淀粉10克，NaNO3 1克，K2HPO4 3克，MgSO4·7H2O 1克，KCl 1克放入1000mL蒸馏水中并调节pH＝5.0配制。将液体培养基和250mL锥形瓶进行高压蒸汽灭菌；以锥形瓶作为种子培养器，将50mL高压蒸汽灭菌后的液体培养基放入种子培养器中；将戴尔福特食酸菌菌株接种到装有液体培养基的种子培养器中，然后将种子培养器放入HZQ-C型空气浴震荡器中，在25℃，140r/min的条件下培养13h，获得的戴尔福特食酸菌种子培养液。
将获得的戴尔福特食酸菌种子培养液接种到装有液体培养基的微生物发酵罐中进行发酵，接种比例为种子培养液体积占液体培养基体积的15％，其中微生物发酵罐经过蒸汽充汽灭菌，装入液体培养基后再经过实罐蒸汽充汽灭菌。发酵温度为30℃，鼓入空气搅拌，鼓入空气量为0.5L/min，电机搅拌速度为150r/min，发酵20h，获得戴尔福特食酸菌发酵液。
在戴尔福特食酸菌发酵液中加入5倍体积的蒸馏水稀释，在室温条件下搅拌2h，搅拌速度为70r/min，然后将获得的液体在7000r/min条件下离心分离10min去除菌体，用旋转蒸发器将离心分离后的液体在40℃条件下蒸发浓缩至0.5倍原体积。
将浓缩后的液体放入冰箱中，在4℃条件下放置1h，然后加入3倍体积无水冷乙醇，混合均匀后，可见丝状絮凝沉淀物产生，放入冰箱，在4℃条件下下放置12h，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物。
将获得的液体部分加入等体积的质量浓度为80％的乙醇，静置1h获得絮凝沉淀物，将液体部分倒出，保留絮凝物质沉淀。
再于分离后的液体部分加入等体积的质量浓度为80％的乙醇，静置1h获得絮凝沉淀物，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物。
收集三次获得的絮凝沉淀物，以3000r/min的速度离心10min，将离心后的固相真空干燥6h，获得絮凝剂粗制品；真空干燥在温度为60℃±2，真空度为0.06Mpa的条件下进行。
将絮凝剂粗制品溶解于无菌水中，获得絮凝剂粗制品溶解液，溶解按重量比例为絮凝剂粗制品∶无菌水＝1∶100，加入氯仿和正丁醇的混合液体，加入量按体积比为絮凝剂粗制品溶解液∶氯仿/正丁醇混合液＝1∶2，其中氯仿/正丁醇混合液的成分按体积比为氯仿∶正丁醇＝2.5∶1，放入空气浴震荡器中，以160r/min的速度室温振荡12h以上，静置分层，下层液体为氯仿层，减压蒸馏回收，上层液体在速度为6000r/min的条件下离心25min，保存上清液，将固相重新溶解于无菌水中重复3次提取操作。
收集上清液，将上清液装入清洗后的透析袋里，用去离子水在40±2℃条件下透析56小时，其中透析内液与透析外液体积比为1∶8，每隔8小时换一次透析外液。然后将透析内液加入6倍体积的无水冷乙醇，静置1h上，产生絮凝沉淀物，放入高速离心机中以6000r/min的速度离心10min，收集固相，真空干燥5h后，获得微生物絮凝剂精制品，其中真空干燥条件为：温度为60℃±2，真空度为0.06MPa。
实施例6
戴尔福特食酸菌的获得方法同实施例1。
液体培养基的配制比例按可溶性淀粉12克，NaNO3 4克，K2HPO4 4.6克，MgSO4·7H2O 0.5克，KCl 0.5克放入1000mL蒸馏水中并调节pH＝6.0配制。将液体培养基和250mL锥形瓶进行高压蒸汽灭菌；以锥形瓶作为种子培养器，将50mL高压蒸汽灭菌后的液体培养基放入种子培养器中；将0.5g戴尔福特食酸菌菌株接种到装有液体培养基的种子培养器中，然后将种子培养器放入HZQ-C型空气浴震荡器中，在30℃，170r/min的条件下培养11h，获得的戴尔福特食酸菌种子培养液。
将获得的戴尔福特食酸菌种子培养液接种到装有液体培养基的微生物发酵罐中进行发酵，接种比例为种子培养液体积占液体培养基体积的18％，其中微生物发酵罐蒸汽充汽灭菌，装入液体培养基后再经过实罐蒸汽充汽灭菌。发酵温度为30℃，鼓入空气搅拌，鼓入空气量为0.5L/min，电机搅拌速度为150r/min，发酵35h，获得戴尔福特食酸菌发酵液。
在戴尔福特食酸菌发酵液中加入2倍体积的蒸馏水稀释，在室温条件下搅拌2h，搅拌速度为70r/min，然后将获得的液体在8000r/min条件下离心分离15min去除菌体，用旋转蒸发器将离心分离后的液体在40℃条件下蒸发浓缩至0.5倍原体积。
将浓缩后的液体放入冰箱中，在4℃条件下放置1h，然后加入4倍体积无水冷乙醇，混合均匀后，可见丝状絮凝沉淀物产生，放入冰箱，在4℃条件下下放置12h，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物。
将获得的液体部分加入等体积的质量浓度为80％的乙醇，静置1h获得絮凝沉淀物，将液体部分倒出，保留絮凝物质沉淀。
再于分离后的液体部分加入等体积的质量浓度为80％的乙醇，静置1h获得絮凝沉淀物，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物。
收集三次获得的絮凝沉淀物，以5000r/min的速度离心10min，将离心后的固相真空干燥5h，获得絮凝剂粗制品；真空干燥在温度为60℃±2，真空度为0.06Mpa的条件下进行。
将絮凝剂粗制品溶解于无菌水中，获得絮凝剂粗制品溶解液，溶解按重量比例为絮凝剂粗制品∶无菌水＝1∶100，加入氯仿和正丁醇的混合液体，加入量按体积比为絮凝剂粗制品溶解液∶氯仿/正丁醇混合液＝1∶2，其中氯仿/正丁醇混合液的成分按体积比为氯仿∶正丁醇＝2.5∶1，放入空气浴震荡器中，以160r/min的速度室温振荡12h以上，静置分层，下层液体为氯仿层，减压蒸馏回收，上层液体在速度为6000r/min的条件下离心10min，保存上清液，将固相重新溶解于无菌水中重复3次提取操作。
收集上清液，将上清液装入清洗后的透析袋里，用去离子水在40±2℃条件下透析60小时，其中透析内液与透析外液体积比为1∶12，每隔8小时换一次透析外液。然后将透析内液加入6倍体积的无水冷乙醇，静置1h上，产生絮凝沉淀物，放入高速离心机中以5000r/min的速度离心30min，收集固相，真空干燥6h后，获得微生物絮凝剂精制品，其中真空干燥条件为：温度为60℃±2，真空度为0.06MPa。
Claims (8)
1、一种制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于：采用戴尔福特食酸菌作为制备微生物絮凝剂的菌种来源，通过以下步骤制备微生物絮凝剂：(1)液体培养基的制备；(2)菌种的发酵培养：将戴尔福特食酸菌菌株接种到种子培养器中制备种子培养液，然后接种到发酵罐中制备戴尔福特食酸菌发酵液；(3)絮凝剂粗制品的制备：将戴尔福特食酸菌发酵液稀释后离心分离，然后经过蒸发浓缩、加入乙醇获得絮凝沉淀物，将絮凝沉淀物经离心分离和真空干燥制备成絮凝剂粗制品；(4)絮凝剂精制品的制备：将絮凝剂粗制品溶解于无菌水中，获得絮凝剂粗制品溶解液，然后加入有机溶液经室温振荡和分层后，将上清液进行透析，将透析后的透析内液加入乙醇产生絮凝沉淀物，将絮凝沉淀物离心后干燥，制备成微生物絮凝剂精制品。
2、根据权利要求1所述一种制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的液体培养基：液体培养基配制按可溶性淀粉5～20克，NaNO3 1～10克，K2HPO4 0.5～5克，MgSO4·7H2O 0.1～2克，KCl 0.1～2克放入1000mL蒸馏水中，调节pH＝5.0～9.0配制。
3、根据权利要求1所述一种制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的菌种的发酵培养：将液体培养基进行高压蒸汽灭菌，然后放入经过灭菌的种子培养容器中，接种戴尔福特食酸菌菌株，在20～40℃，120～180r/min的条件下培养10～15h，获得戴尔福特食酸菌种子培养液；将戴尔福特食酸菌种子培养液接种于装有液体培养基的发酵罐中进行搅拌发酵，接种按种子培养液体积占液体培养基体积的10～20％，发酵温度为25～35℃，鼓入空气搅拌，鼓入空气量为0.5～1.0L/min，电机搅拌速度为140～160r/min，培养15～50h，获得戴尔福特食酸菌发酵液。
4、根据权利要求1所述一种制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的絮凝剂粗制品的制备：在戴尔福特食酸菌发酵液中加入2～10倍体积的蒸馏水稀释，在室温和转速为70r/min条件下搅拌2h以上，然后在5000～8000r/min条件下离心分离10～30min去除菌体；将离心分离后的液体在40～60℃条件下蒸发浓缩至0.5倍原体积；将浓缩后的液体在4℃条件下预冷1h以上，然后加入2～4倍体积无水冷乙醇，混合均匀后，在4℃条件下放置12h以上，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物；将获得的液体部分加入质量浓度为80％的乙醇，静置获得絮凝沉淀物，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物；再于分离后的液体部分加入质量浓度为80％的乙醇，静置获得絮凝沉淀物，将液体部分倒出，保留絮凝沉淀物；收集三次获得的絮凝沉淀物，以3000～6000r/min的速度离心10min，将离心后的固相真空干燥5～6h，获得絮凝剂粗制品。
5、根据权利要求1所述一种制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的絮凝剂精制品的制备：将絮凝剂粗制品溶解于无菌水中，获得絮凝剂粗制品溶解液，溶解按质量比例为絮凝剂粗制品∶无菌水＝1∶100，加入有机溶液，加入量按体积比为：絮凝剂粗制品溶解液∶有机溶液＝1∶0.5～2，以120～160r/min的速度室温振荡12h以上，静置分层，下层减压蒸馏回收，上层液体在速度为3000～6000r/min的条件下离心10～30min，保存上清液，将固相溶解于无菌水中重复3次提取操作；收集上清液，将上清液装入清洗后的透析袋里，用去离子水在40±2℃条件下透析24～60小时，透析完成后将透析袋内液体加入2～6倍体积的无水冷乙醇，静置1h以上，产生絮凝沉淀物，然后以3000～6000r/min的速度离心10～30min，收集固相，真空干燥4～6h后，得到微生物絮凝剂精制品。
6、根据权利要求3所述的一种制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于将戴尔福特食酸菌种子培养液接种于装有液体培养基的发酵罐中进行搅拌发酵前，发酵罐经过空罐灭菌，装入液体培养基后发酵罐再经过实罐灭菌。
7、根据权利要求4或5所述的一种制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的真空干燥在温度为60℃±2，真空度为0.06Mpa的条件下进行。
8、根据权利要求5所述的一种制备微生物絮凝剂的方法，其特征在于所述的有机溶液为氯仿和正丁醇的混合液体，其成分按体积比为氯仿∶正丁醇＝1.25～4∶1。
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