CN105754902B - 一株高效去除含磷废水中磷的希瓦氏菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高效去除含磷废水中磷的希瓦氏菌及其应用，具体的，涉及一株能同时高效去除含盐废水中磷以及利用生活废水合成纳米材料的希瓦氏菌(Shewanella sp.)CF8‑6，该菌株于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号为：CCTCC M 2016154。该菌株对于含盐废水中的磷去除效率，尤其是在10％及以下盐度的废水，10小时内磷的去除率可达99％以上；而且该菌株去除废水中磷的同时可以利用废水中原料在低饱和度条件下合成金属磷酸盐沉淀，不需要额外投加化学试剂，环境友好成本低。

Description

一株高效去除含磷废水中磷的希瓦氏菌及其应用
技术领域
本发明涉及废水磷处理技术领域，具体涉及一株高效去除含磷废水中磷的希瓦氏菌及其应用。
背景技术
磷是组成生命体的一种重要元素，同时也是生物生长必不可少的营养物质，然而淡水中过量的磷会导致水体富营养化，影响水体质量与生态平衡。富营养化给我国的旅游业、工业、农业及水产业都带来了极大的危害，因此有效降低废水中磷浓度是一个急需解决的水污染问题。
通常废水中的磷多以磷酸盐、聚磷酸盐和有机磷的形式存在，根据工作机理不同，废水中磷的去除方法主要有物化除磷法、生物除磷法和人工湿地法。目前，国内外应用较多、除磷效果较好的是化学沉淀法和生物除磷法。
化学沉淀法是利用金属阳离子与磷酸根结合生成不溶性的金属磷酸盐沉淀的过程，常用的沉淀剂是钙盐、铝盐和铁盐。此方法会产生大量化学污泥造成二次污染，同时沉淀剂费用较高导致处理成本较高，残留的金属离子浓度也较高，并且化学沉淀法不适用于低磷废水的处理。
与化学沉淀法相比，生物除磷方法具有效率高，成本低及环境友好等优点。传统的生物法可以通过两种途径来实现生物除磷：一种是仅仅依靠微生物在其自身生长过程中需要磷，从而达到除磷的目的，但这种方法很难去除掉更多的磷。另一种方法则是通过控制反应器中的反应条件使得微生物能够吸收过量的超过其自身生长所需要的磷，并且以聚磷的形式储存在胞内，这需要聚磷菌的作用。依赖于聚磷菌作用的强化生物除磷系统是目前应用最广泛的生物除磷方法，然而当处理高盐度废水，如海水冲厕废水时，高盐环境会对微生物产生抑制作用，即使废水被稀释到盐度为1％时处理也很困难，且相比较硝化菌和反硝化菌而言，除磷菌对于盐度更加敏感，有文献报道当盐度从0％上升到0.4％时，盐度对氮的去除没有影响，而磷的去除率从85％下降到25％。因此传统的生物除磷方法在处理高盐废水时受到极大的限制，同时生物污泥又具有驯化周期长、启动困难等缺陷。近年有研究发现微生物金属磷酸盐沉淀是废水中磷去除的一种新的有效途径。有文献报道污水处理厂污泥诱导的羟基磷酸钙沉淀对磷的去除占好氧颗粒污泥去除总磷的45％，但继续提高其除磷效果难度大，成本高。深海金属磷酸盐沉淀菌可以通过诱导金属磷酸盐沉淀的形成来提高除磷效果，本方法操作简单，成本较低，且生成的羟基磷酸钙类材料生物有效性高。
因此，开发生长在深海等高盐环境下具有耐盐性能并且可以产生金属磷酸盐沉淀的除磷菌对于废水中磷的去除是具有重大意义的。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一株能同时高效去除含磷废水中磷以及利用生活废水合成钙磷沉淀(纳米材料)的希瓦氏菌(Shewanella sp.)CF8-6。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的一个目的在于提供一株高效去除含磷废水中磷的希瓦氏菌(Shewanellasp.)CF8-6，该菌株于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号为：CCTCC M 2016154。
该菌株分离自中国南海底泥，该菌株可在温度5-35℃，pH5.8-9.8，盐度0-12％、严格好氧的培养条件下生长，且具有较好的磷去除效果，菌体形态特征为革兰氏染色呈阴性，电子显微镜下观察为杆菌，有荚膜及鞭毛，菌株固体培养24小时菌落特征为圆形，乳白色。
使用试剂盒提取菌株CF8-6的DNA，通过PCR进行扩增16S rDNA序列，得出菌株CF8-6的16S rDNA序列，如序列表SEQ ID NO:1所示。用BLAST程序对菌株CF8-6的16S rDNA序列和GenBank中已登录的16S rNDA序列进行核苷酸同源性比较，进行系统法发育树构建，菌株CF8-6属于希瓦氏菌属(Shewanella)。
本发明的另一目的在于提供上述希瓦氏菌(Shewanella sp.)CF8-6的培养方法，包括：将菌株Shewanella sp.CF8-6在海水LB液体培养基中在25℃，200rpm的条件下培养24小时，制得活化菌液；进一步离心可收集希瓦氏菌(Shewanella sp.)CF8-6菌体。
海水LB配方为：1％蛋白胨，0.3％酵母粉，陈海水配制，海水盐度为3.5％。
本发明还提供一种菌剂，其包括上述希瓦氏菌(Shewanella sp.)CF8-6菌体或希瓦氏菌(Shewanella sp.)CF8-6的培养物。
此外，本发明还提供上述菌株或菌剂在废水除磷中的应用。
本发明所述菌株或菌剂可用于含盐废水或不含盐废水中磷去除，尤其是，本发明所述菌株或菌剂对于高盐度废水处理极为有效，比如海水冲厕废水，本发明所述高盐度废水中盐度可达15％，优选的，本发明所述菌株或菌剂用于盐度0％-10％的废水中磷的处理。
具体的，本发明涉及一种含盐废水除磷的方法，包括：
(1)培养Shewanella sp.CF8-6得到活化菌液；
(2)将活化菌液以10％(v/v)的比例接种到含盐废水进行培养除磷。
其中优选的，步骤(1)为：将菌株Shewanella sp.CF8-6在海水LB液体培养基中在25℃，200rpm的条件下培养24小时，制得活化菌液。
优选的，步骤(2)中培养条件为好氧。
本发明具有如下优点：
(1)本发明所述的菌株对环境条件有很高的适应性，可以在不含盐、高盐以及广pH、温度、营养范围内生长，而且可以高效去除废水中的磷，使废水中磷降至0.5mg/L以下，达到排放标准，尤其是本发明所述菌株对高盐度废水如海水冲厕废水具有良好的除磷净化作用，对于解决淡水资源短缺以及建立有效的海水冲厕废水利用体系，具有良好的利用价值；
(2)本发明所述菌株在去除磷的过程中只需要活化后接种到含磷废水中培养就可以，步骤简单，操作容易，成本低廉；
(3)本发明所述的菌株可以在单一好氧条件下实现磷的去除，简化了磷的去除过程，提高了除磷过程的可操作性，为生物除磷提供了新途径；
(4)本发明所述菌株是在低饱和废水体系中以金属磷酸盐(本发明体系中为钙磷沉淀)的沉淀的形式实现磷的去除的。
附图说明
图1菌株CF8-6的系统发育树
图2a CF8-6在不同盐度下的生长曲线
图2b CF8-6在不同盐度下的磷去除率
图3菌株CF8-6合成金属磷酸盐沉淀的观察，a:原子力显微镜图片(AFM)b、c:纳米颗粒透射电镜图片(TEM)
具体实施方式
实施例1除磷菌的筛选及鉴定
希瓦氏菌株(Shewanella sp.)CF8-6的筛选分离过程如下：
(1)从中国南海底泥分离到多株菌株，将部分分离自中国南海底泥的菌株接种到海水LB液体培养基中，在25℃，200rpm的条件下培养24小时，得到活化菌液；
(2)将上述步骤(1)得到的活化菌液以10％的比例接种到模拟高盐废水中，在25℃，200rpm的条件下培养，选择在12h及24h去除率均高于90％的若干株菌进行复筛；
(3)将步骤(2)所得到的菌株按照步骤(1)(2)再次筛选，增加取样时间，选择除磷速度与除磷率最优的一株菌，命名为CF8-6。
上述LB培养基成分：
蛋白胨10g/L，酵母提取物3g/L，陈海水配制，其中海水盐度为3.5％。
模拟高盐生活废水成分如下：
C6H12O6·H2O 1.5g/L，CH3COONa 0.75g/L，MgSO4·7H2O 1.18g/L，NH4Cl 0.9g/L，KH2PO4·2H2O 0.066g/L(P:10mg/L)，NaCl 30g/L。
所有培养基在使用之前均121℃高温灭菌20min。接种在洁净工作台中进行。菌种保存在1.5mL离心管中(含600uL菌液与300uL甘油)，在超低温冰箱中-80℃长期保存。
该菌株的生理生化表征：菌株CF8-6可在温度5-35℃，pH5.8-9.8，盐度0-12％、严格好氧的培养条件下生长，且具有较好的磷去除效果，菌体形态特征为革兰氏染色呈阴性，电子显微镜下观察为杆菌，有荚膜及鞭毛。菌株固体培养24小时菌落特征为圆形，乳白色。
该菌株的分子生物学鉴定：
使用试剂盒提取菌株CF8-6的DNA，通过PCR进行扩增16S rDNA序列，得出菌株CF8-6的16S rDNA序列，如序列表SEQ ID NO:1所示。用BLAST程序对菌株CF8-6的16S rDNA序列和GenBank中已登录的16S rNDA序列进行核苷酸同源性比较，得知菌株CF8-6属于希瓦氏菌属(Shewanella)，因此将该菌命名为Shewanella sp.CF8-6，该菌株的系统发育树如图1所示。
菌株CF8-6的16S rDNA序列如下：
TGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAACACAAGGGAGCTTGCTCCTGAGGTGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATACCTAGGTATCTGCCCAATCGAGGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGGAGGGGACCTTCGGGCCTTTCGCGATTGGATGAACCTAGGCGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGAGGAGGAAAGGTTGTTGGTTAATAACCAACAGCTGTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCGAACTGGCAAACTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTCGGAATTTGGTGTCTTGAACACTGGGTTCTCAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAATTCGCTAGAGATAGCTTAGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTATTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTTTAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCAAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAGCCGGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCACCAGAAGTAGATAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGTTTACCACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAG(SEQ ID NO:1)。
该希瓦氏菌(Shewanella sp.)CF8-6，于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号为：CCTCC M 2016154。
实施例2菌株Shewanella sp.CF8-6的废水除磷试验
菌株Shewanella sp.CF8-6在水处理中的应用方法如下：
(1)将菌株Shewanella sp.CF8-6在海水LB液体培养基中在25℃，200rpm的条件下培养24小时，制得活化菌液。
(2)将步骤(1)得到的活化菌液以10％的比例接种到模拟废水中不同盐度的废水中(盐度范围在0％-20％)，在25℃，200rpm的条件下培养，在不同时间测定上清液中磷的浓度以及在波长600nm处测生物量，得到菌株对磷的去除效率以及菌株在不同盐度范围下的生长曲线，水处理效果数据如图2a和图2b所示。
由图2a和图2b可以看出，本发明的菌株Shewanella sp.CF8-6对于含盐废水中的磷去除效率非常高，尤其是在10％及以下盐度的废水中，10小时内磷的去除率可达99％以上；甚至对于12％、15％盐度的废水，本发明菌株Shewanella sp.CF8-6也有极佳的磷去除率。
上述模拟废水配方与筛选菌株时废水配方除盐度值外其余成分浓度相同，磷浓度(以P计)为10mg/L。
实施例3菌株Shewanella sp.CF8-6的废水除磷过程中形成金属磷酸盐沉淀的微观形貌
(1)将菌株Shewanella sp.CF8-6在海水LB液体培养基中在25℃，200rpm的条件下培养24小时，制得活化菌液；
(2)将步骤(1)得到的菌液离心洗涤后按10％的比例接进模拟废水中，活化菌液离心参数：10000rpm条件下离心10min，在25℃，200rpm的条件下培养48小时，离心即得到菌体，离心转速为4000rpm，时间为10分钟(视菌液体积而定，重点为转速)；
(3)将步骤(2)得到的菌体用去离子水洗两遍，转速为4000rpm，时间为15分钟，处理后做透射电镜(TEM)观察。
(4)将步骤(2)得到的菌体处理后去做原子力显微镜观察。
海水LB配方为：1％蛋白胨，0.3％酵母粉，陈海水配制。
模拟废水(高盐高磷)配方：C6H12O6·H2O 1.5g/L，CH3COONa 0.75g/L，MgSO4·7H2O1.18g/L，NH4Cl 0.9g/L，甘油磷酸二钠盐(C3H6NaO7P，以P计50mg/L)，NaCl 30g/L，CaCl2(以Ca计80mg/L)，用去离子水溶解。
如图3所示，本发明所述菌株Shewanella sp.CF8-6在培养过程中，利用废水中原料合成金属磷酸盐沉淀。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (11)

1.一株高效去除含磷废水中磷的希瓦氏菌(Shewanella sp.)CF8-6，该菌株于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号为：CCTCC M 2016154。
2.权利要求1所述的希瓦氏菌(Shewanella sp.)CF8-6的培养方法，其特征在于，将菌株CF8-6在海水LB液体培养基中在25℃，200rpm的条件下培养24小时，制得活化菌液；所述海水LB液体培养基配方为：1％蛋白胨，0.3％酵母粉，陈海水配制。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，还包括进一步离心收集获得希瓦氏菌(Shewanella sp.)CF8-6菌体。
4.一种微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述希瓦氏菌(Shewanella sp.)CF8-6菌体或希瓦氏菌(Shewanella sp.)CF8-6的菌株培养物。
5.权利要求1所述菌株或权利要求4所述菌剂在废水除磷中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述菌株或菌剂用于含盐废水或不含盐废水中磷去除。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述菌株或菌剂用于高盐度废水处理。
8.根据权利要求7所述应用，所述菌株或菌剂用于海水冲厕废水处理。
9.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述菌株或菌剂用于盐度0％-10％的废水中磷的处理。
10.一种含盐废水除磷的方法，包括如下步骤：
(1)培养权利要求1所述希瓦氏菌(Shewanella sp.)CF8-6，得到活化菌液；
(2)将活化菌液接种到含盐废水进行培养除磷。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(1)为：将菌株CF8-6在海水LB液体培养基中在25℃，200rpm的条件下培养24小时，制得活化菌液；步骤(2)中培养条件为好氧。
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