CN104593282B - 一种铁氧菌及利用其去除土体中重金属的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种铁氧菌及利用其去除土体中重金属的方法。本发明涉及铁氧菌S1969呈红色杆状，表面粗糙，边缘不整齐，为革兰氏阳性菌，通过制备标准培养液、菌液、吸附土中重金属。本发明克服了土壤重金属污染的常规修复方法如物理修复法、化学修复法、植物修复法和微生物修复法等各自存在的缺陷。本发明S1969菌株来源于国内一般土壤，从土壤中分离筛选出的微生物，适应性强，能去除重金属，且其来源丰富，易于培养，经S1969菌液灌注后，土体中Pb2+、Cd2+、Cr3+、Cu2+、Zn2+等重金属离子的生物有效性明显降低。故可利用S1969菌液对重金属的吸附和沉淀作用来固定污染土中的重金属，降低其进入植物体、生物体和水体的能力，从而减轻他们对生态环境的危害。

Description

一种铁氧菌及利用其去除土体中重金属的方法
技术领域
本发明涉及环境科学与岩土工程领域，具体涉及微生物技术及其土中重金属固化技术应用，特别涉及一种铁氧菌及利用其去除土体中重金属的方法。
背景技术
近年来，高强度人类活动对土壤环境的影响越来越明显，随着工业、城市污染的加剧和使用农用化学物质种类、数量的增加，土壤环境中的重金属污染问题日趋严重，特别是在我国资源相对紧缺、经济快速发展的长江三角洲地区，土壤重金属污染问题不容忽视。土壤重金属污染具有污染物在土壤中移动性差、滞留时间长、难以被微生物降解等特点，并可经水、植物等介质最终影响人类健康。因此，寻求土壤重金属污染的有效对策，已成为当务之急。
目前，土壤重金属污染的常规修复方法主要有物理修复法、化学修复法、植物修复法和微生物修复法等。物理修复主要包括电动修复、电热修复、土壤淋洗等3种修复技术。化学修复法包括化学沉淀法、离子交换法、溶剂萃取法等，这些方法在一定条件下可取得效果，但普遍存在工艺流程冗长、原材料成本较高、易造成二次污染等缺点。植物修复主要包括植物提取、植物固定、植物挥发、植物过滤等，但该方法技术存在影响深度小、修复周期长、植物受区域影响限制、处理效果难以保证等缺点，所以适用条件受限。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺陷，研制一种铁氧菌及利用其去除土体中重金属的微生物技术修复方法。
本发明的技术方案是：
一种铁氧菌，其主要技术特征在于铁氧菌S1969呈红色杆状，表面粗糙，边缘不整齐，为革兰氏阳性菌。
本发明的另一技术方案是：
一种利用铁氧菌去除土体中重金属的方法，其主要技术步骤在于：
(1)制备标准培养液
每升培养液含有柠檬酸铁铵10g，含结晶水的硫酸镁0.5g，硫酸亚铁铵0.5g，磷酸氢二钾0.5g，氯化钙0.2g，硝酸钠0.5g，pH值控制为6.8～7；
(2)制备菌液
将分离得到的S1969接入标准培养液中，放入30℃恒温摇床中震荡培养48h，得到的S1969菌液，该菌液在30℃下继续培养24h～48h后，灌浆试样中产生生物黏泥；
(3)土中重金属吸附
将培养48h的S1969菌液灌入土中，菌液与土样的体积比大于1.2∶1，在18℃～35°条件下静置3～15天。菌液中被氧化的铁离子络合物在沉淀过程中吸附游离重金属离子，形成不溶于水的絮状团聚体共沉，完成重金属离子吸附和沉淀。
所述S1969菌液在30℃下继续培养24h～48h后，灌浆试样中产生生物黏泥。
本发明的优点和效果在于S1969菌株来源于国内一般土壤，经S1969菌液灌注后，土体中Pb2+、Cd2+、Cr3+、Cu2+、Zn2+等重金属离子的生物有效性明显降低。故可利用S1969菌液对重金属的吸附和沉淀作用来固定污染土中的重金属，降低其进入植物体、生物体和水体的能力，从而减轻他们对生态环境的危害。
本发明还具有如下优点：
1、从土壤中分离筛选出的微生物，适应性强，能去除重金属，且其来源丰富，易于培养；
2、所用的微生物培养液的成本较低；
3、本发明中所利用的微生物为土壤中本身存在的微生物，对环境造成的二次污染小；
4、经过吸附后的重金属离子浓度明显降低。
5、与传统的处理技术相比，生物技术修复法具有环保生态、投资成本较低、设备简单、处理量大、能耗较小的优点，可保证土壤的生态健康和环境的可持续发展。
本发明利用铁氧菌将Fe2+氧化形成铁基络合物，铁基络合物在沉淀过程中吸附重金属离子，形成不溶于水的絮状团聚体，通过铁离子络合物和重金属离子的共沉作用，降低污染土中有效态重金属的含量。
本发明的其他具体优点和效果将在下面继续说明。
附图说明
图1——菌株代谢产物导致Fe2+被氧化形成铁基络合沉积物的沉积前后的图片，其中(a)菌液培养1天的沉积形态，(b)菌液放置5天后的沉积形态。
图2——菌株代谢产物导致铁基络合物与重金属共沉前后的图片，其中(a)Pb(NO3)2溶液与菌液混合1天后，(b)Pb(NO3)2溶液与菌液混合5天后，(c)CuSO4·5H2O溶液与菌液混合1天后，(d)CuSO4·5H2O溶液与菌液混合5天后，(e)Zn(NO3)2溶液与菌液混合1天后，(f)Zn(NO3)2溶液与菌液混合5天后。
图3——重金属离子去除率图。
图4——沉积物的SEM电镜图，其中(a)纯菌液中产生的沉积物VIC，(b)铁基络合物与铅(Pb2+)共沉后的沉积物IC。
图5——沉积物的XRD图谱，其中(a)纯菌液中产生的沉积VIC，(b)铁基络合物与铅(Pb2+)共沉后的沉积物IC，(c)铁基络合物与镉(Cd2+)共沉后的沉积物IIC，(d)铁基络合物与铬(Cr2+)共沉后的沉积物IIIC，(e)铁基络合物与铜(Cu2+)重金属共沉后的沉积物IVC，(f)铁基络合物与锌(Zn2+)共沉后的沉积物VC。
本发明提及的铁氧菌，其代号为S1969(Arthrobacter defluvii)，已于2013年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院)，保藏编号分别为CGMCC No.8523。
具体实施方式
本发明的技术思路是：
本发明的目的在于提供可使Fe2+氧化的铁氧菌株及利用铁氧菌沉积土中重金属离子的方法。铁氧菌株可将Fe2+氧化Fe3+，生成的铁基络合物具有较高反应活性和吸附性，在沉积过程中吸附周围环境中的金属离子，从而有效降低土壤中重金属的水溶性、扩展性和生物有效性，从而降低其进入植物体、生物体和水体的能力，减轻他们对生态环境的危害。
微生物技术修复法是指利用土壤中某些特异微生物的新陈代谢活动，降低土壤重金属污染物的生物有效性或减少土壤中重金属污染物的浓度，使得土中重金属有效态的质量浓度低于相应的标准值。
下面具体说明本发明。
实施例1：S1969菌株的获得
采集土壤，用纯净水溶解，稀释涂布铁氧菌固体培养基上，置28℃培养箱中培养3～7d，根据菌落形态、颜色等挑取单菌落，纯化后保存。筛选出的代号为S1969的菌株，代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定，产生的红色黏泥较多，并能耐受较高浓度的重金属离子。如图1和图2所示，图1为菌株代谢产物导致Fe2+被氧化，最终形成铁基络合沉积物的图片；图2为菌株代谢产物导致铁基络合物与重金属共沉前后的图片。
实施例2：S1969菌株的鉴定、保藏
按生工SK1201提取菌株S1969的DNA和进行16SrDNA序列扩增。扩增采用细菌通用引物7F(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，SEQ ID NO.1)和154OR(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，SEQ ID NO.2)。扩增产物回收纯化后送上海生工生物工程有限公司测序，将测序结果与rep数据库中的已知序列进行比较，确定了菌株的分类地位。
菌株S1969的菌落呈红色，表面粗糙，边缘不整齐，为革兰氏阳性菌，适宜在pH＝6.8～7、培养温度在30℃左右的环境下生长。
菌株S1969于2013年11月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分别分类命名为Arthobacter defluvii，保藏编号为CGMCC No.8523。
实施例3：菌液的制备
配置菌液：每升培养液含有柠檬酸铁铵10g，含结晶水的硫酸镁0.5g，硫酸亚铁铵0.5g，磷酸氢二钾0.5g，氯化钙0.2g，硝酸钠0.5g，pH值控制为6.8～7，将100mL培养液装入300mL小口三角瓶中，121℃灭菌30min。将S1969接种于培养液中，在30℃温度下培养，转速为200r/min，培养48h后得到茵液。
实施例4：重金属的吸附
为了验证本发明的效果，对模拟污染土样进行修复，并采用原子吸收分光光度计测定处理前后土中有效态重金属的含量。
(1)供试土壤采用扬州沿江粉土模拟污染后得到，原试验土样的初始主要性质指标见下表1和表2。将土样清洗烘干待用。表2所示的为原土样的主要性能指标；表3所示为原土样的主要性能指标。
表1 原土样的主要性能指标
表2 原试验土样的颗粒组成
(2)污染土采用粉土内分别均匀掺入重金属溶液制得。土中各重金属的含量根据国家《土壤环境质量标准》(GB15618-1995)三级标准放大1.5～2倍，并考虑菌种对各重金属的耐受性取值，表3所示的为原土样有效态重金属含量。
表3 原试验土样中有效态重金属含量
污染土制备方法如下：
含Pb2+污染土的制备：将4克的Pb(NO3)2溶于500ml的纯净水，配成Pb2+溶液A，含从中取100ml掺入500g的烘干土样中，充分搅拌均匀后风干，制成有效态Pb2+总含量为1003.278mg/kg的污染土。
含Cd2+污染土的制备：将3克的Cd(NO3)2溶于500ml的纯净水，配成Cd2+溶液B，从中取5ml溶液稀释至1000ml，取100ml掺入500g的烘干土样中，充分搅拌均匀后风干，制成有效态Cd2+总含量为2.893mg/kg的污染土。
含Cr3+污染土的制备：将10克的Cr(NO3)3·9H2O溶于500ml的纯净水，配成Cr3+溶液C，从中取100ml溶液掺入500g的烘干土样中，配成有效态Cr2+总含量为543.179mg/kg的污染土。
含Cu2+污染土的制备：将8克的CuSO4·5H2O溶于500ml的纯净水，配成Cu2+溶液D，从中取100ml溶液掺入500g的烘干土样中，充分搅拌均匀后风干，制成有效态Cu2+总含量为825.95mg/kg的污染土。
含Zn2+污染土的制备：将11克的Zn(NO3)2·6H2O溶于500ml的纯净水，配成Zn2+溶液E，从中取100ml溶液掺入500g的烘干土样中，充分搅拌均匀后风干，制成有效态Zn2+总含量为985.546mg/kg的污染土。
(3)每组污染土均取250g进行试验，向每组污染土的(a)土样中灌入300ml的纯培养液，(b)土样中灌入250ml的S1969菌液，置恒温振荡器中以200r/min、30℃下间歇振荡72h，再在18℃～35°条件下静置3～15天(所需天数与温度的关系如表4所示)
表4 温度与所需天数的关系
静置若干天后，掺菌液的试样中出现上清液，但掺纯培养液试样中未出现上清液，说明铁氧菌可将培养液中的二价铁离子氧化为三价铁离子，铁的氢氧化物和其他有机物在沉积过程中，与其它重金属形成团聚体共沉降，从而去除土中有效态重金属。
(4)采用KIIM6型原子吸收分光光度计测定处理后每份土体中的有效态重金属的含量，表5所示为重金属的测定结果，并且由附图3可以看出，在培养基浓度相同的条件下，S1969对这5种离子的去除率大小顺序为：Pb2+＞Cu2+＞Zn2+＞Cd2+＞Cr3+。
表5 重金属测定结果
实施例5：重金属的沉积机理分析
为分析重金属的沉积机理，进行了液体培养试验，利用电子扫描显微镜和XRD衍射仪分析液体培养下的沉积物，观察观测沉积物的微观形态，分析沉积物的物相组成。
选取500ml锥形瓶若干，分别编号为I～VI，其中I～V中分别装入250的菌悬液和50ml实施例5中配成的重金属溶液，如表6所示，为瓶号、溶液类型及对应的沉积物一览表。混合静置数天后，溶液中产生共沉的沉积物IC～VC，VI中装入300的菌悬液静置数天后，产生铁基沉积物VIC，对应的产生沉积物类型见表6。
表6 瓶号、溶液类型及对应的沉积物一览表
试验瓶编号 溶液类型 沉积物 对应的图片
I 250ml的菌悬液+50mlPb2+溶液 IC 图2(a)、图2(b)、图4(b)、图5(b)
II 250ml的菌悬液+50mlCd2+溶液 IIC 图5(c)
III 250ml的菌悬液+50mlCr3+溶液 IIIC 图5(d)
IV 250ml的菌悬液+50mlCu2+溶液 IVC 图2(c)、图2(d)、图5(e)
V 250ml的菌悬液+50mlZn2+溶液 VC 图2(e)、图2(f)、图5(f)
VI 300ml的菌悬液 VIC 图1(a)、图1(b)、图4(a)、图5(a)
图4为沉积物的SEM图片。由图4(a)纯菌液中产生的铁基沉积物VIC的图片看出，沉积物呈片状分布，分布较松散，主要成分应为铁基络合物；由图4(b)铁基络合物与铅离子共沉作用的产物IC图片可见，其表观与沉积物VIC差别较大，片状大颗粒表面附着较多细小颗粒，这些细小的颗粒晶型较差，填充了铁基络合物表面和孔隙，形成原铁基络合物和重金属离子团聚结合体。
图5为沉积物IC～VICXRD图谱。由图5(a)可见纯菌液中产生的铁基沉积物以无定型物为主，并含有少部分具有优异絮凝效能、稳定性好的碱式磷酸铁(Fe5(PO4)4(OH)3·2H2O)等晶型物，而由图5(b)～5(f)可见，共沉作用的产物IC～VC均以无定型物为主。可以推测沉积过程与铁基菌株的代谢过程相关，在此过程中产生的铁基络合物吸附了重金属阳离子及菌丝等多糖产物，形成了团聚结合体，通过共沉作用实现了对污染土中重金属的固定。

Claims (2)

1.一种利用保藏编号为CGMCC No.8523的铁氧菌S1969去除土体中重金属的方法，其步骤在于：
(1)制备标准培养液
每升培养液含有柠檬酸铁铵10g，含结晶水的硫酸镁0.5g，硫酸亚铁铵0.5g，磷酸氢二钾0.5g，氯化钙0.2g，硝酸钠0.5g，pH值控制为6.8～7；
(2)制备菌液
将分离得到的保藏编号为CGMCC No.8523的铁氧菌S1969接入标准培养液中，放入30℃恒温摇床中震荡培养48h，得到铁氧菌S1969菌液；
(3)土中重金属吸附
将培养48h的所述铁氧菌S1969菌液灌入土中，所述铁氧菌S1969菌液与土样的体积比大于1.2∶1，在18℃～35℃条件下静置4～15天，菌液中被氧化的铁离子络合物在沉淀过程中吸附游离重金属离子，形成不溶于水的絮状团聚体共沉，完成重金属离子吸附和沉淀。
2.根据权利要求1所述的利用保藏编号为CGMCC No.8523的铁氧菌S1969去除土体中重金属的方法，其特征在于，步骤(2)所述铁氧菌S1969菌液在30℃下继续培养24h～48h后，灌浆试样中产生生物黏泥。
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