CN103805529B - 一株具有异养硝化好氧反硝化功能的盐田盐单胞菌及其应用 - Google Patents
一株具有异养硝化好氧反硝化功能的盐田盐单胞菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物领域,具体地,本发明涉及一株具有异养硝化好氧反硝化功能的盐田盐单胞菌及其应用。本发明的具有异养硝化好氧反硝化功能的盐田盐单胞菌BMEN3(Halomonas?campisalis.BMEN3),其保藏编号为:CGMCC?NO.6536。根据本发明的盐田盐单胞菌BMEN3,所述盐田盐单胞菌的16S?rDNA序列如SEQ?IDNo.1所示。本发明筛选出的菌株Halomonas?campisalis.BMEN3在高盐高碱条件下仍具有异养硝化和好氧反硝化能力,而且菌株能在有氧异养条件下生长,这大大提高了菌体的生长速率,提高挂膜速度,缩短反应器启动时间,提高了脱硝效率。本发明的菌株适应的盐度及pH范围广,极值高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域,具体地,本发明涉及一种耐盐耐碱的具有异养硝化好氧反硝化功能的盐田盐单胞菌及其应用。
背景技术
随着工业的发展和城市化的不断加快,越来越多的含氮废气废水被排放到环境中,而其中许多污水不仅含氮量高,而且还有较高的盐度。含盐含氮废水主要来自海水直接利用后的废水如电力、钢铁、纺织等行业冷却用水以及用于市政的海水。另外电厂、火化厂等产生的烟道气中也含有大量的含氮化合物与氧气,这些含氮化合物的吸收及脱除也需要在含盐含氮环境中完成。采用传统的好氧硝化和厌氧反硝化工序来处理这些含盐含氮废水,常常发现水中的盐会抑制硝化和反硝化的进行。为解决这些问题,现在主要是通过两种途径进行解决,一是在含盐环境中对活性污泥进行驯化,二是从自然界的含盐环境中进行嗜盐菌的筛选。
据报道已有许多嗜盐厌氧脱硝菌株被分离出来,如Halomonasmongoliensis.spHalomonaskenyensis.sp,HalomonascampisalisT.denitrificans和Methylophagasp等被分离出来。这些菌株的发现为处理含盐含氮废水提供了可能性。
已有文献报道异样硝化和好氧反硝化可以同时进行且可以降低成本,提高脱硝效率,所以许多能进行异养硝化和好氧反硝化的菌株被筛选出来,如:PseudomonasstutzeriYZN-001、BacillussubtilisA1、BacillusmethylotrophicusstrainL7Achromobacter和Acinetobacter。但是这些菌株对盐度很敏感,能在高盐环境中进行好氧反硝化的菌株未有报道。
发明内容
本发明的目的是针对目前现有技术对含盐含氮废水及烟道气处理方面的问题,提供一株能同时高效进行异养硝化和好氧反硝化的盐田盐单胞菌菌株Halomonascampisalis.BMEN3,该菌株在好氧的条件、高盐碱的环境中能同时进行硝化和反硝化,最终将NH4 +、NO3 -、NO2 -等对环境有害的物质转化成无害的氮气。
本发明的另一个目的是提供上述盐田盐单胞菌Halomonascampisalis.BMEN3在在硝化、反硝化方面的应用。
本发明的再一个目的是提供上述盐田盐单胞菌Halomonascampisalis.BMEN3在处理含盐含氮工业废水及市政废水处理中的应用。
本发明的再一个目是提供上述盐田盐单胞菌Halomonascampisalis.BMEN3在烟道气脱硝中的应用。
本发明从采自鄂尔多斯盐碱湖的湖底泥中经过三代富集和BTB平板涂布筛选,最终筛选到一纯菌株。该菌株在BTB平板上生长时能通过反硝化作用产碱而使平板变蓝。菌落为白色,中间凸起,直经约为1~4mm。菌株革兰氏染色为阴性。该菌株的16SrDNA如SEQIDNo.1所示:
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综合对该菌株的生理生化特性以及16SrDNA基因测序结果,可以确定本发明分离纯化得到的菌株为盐田盐单胞菌Halomonascampisalis.,命名为Halomonascampisalis.BMEN3。本发明的盐田盐单胞菌Halomonascampisalis.BMEN3已于2012年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,100101),保藏编号为CGMCCNO.6536。
本发明还提供了上述盐田盐单胞菌BMEN3在硝化、反硝化方面的应用。
本发明还提供了上述盐田盐单胞菌BMEN3在含盐含氮的工业废水及市政废水处理中的应用。
本发明还提供了上述盐田盐单胞菌BMEN3在工业烟道气脱硝中的应用。
本发明的实施例从以下几个方面考察了上述异养硝化好氧反硝化盐田盐单胞菌株菌株对含盐含氮废水废气脱硝的性能:
1、以丁二酸钠做碳源考察不同NaCl浓度对菌株BMEN3的生长和脱硝速率的影响。
2、以丁二酸钠为碳源考察不同pH对菌株BMEN3的生长和脱硝速率的影响。
3、以丁二酸钠为碳源考察不同DO对菌株BMEN3的生长和脱硝速率的影响。
4、以丁二酸钠为碳源考察菌株BMEN3同时硝化反硝化效果。
5、在好氧生物滤池中进行挂膜,对烟道气进行脱硝处理。
6、反应器运行期间,每隔1d测定出水pH、COD、氧化还原电位(ORP)、生物量、NO3 -、NO2 -以及反应器上层气体中O2、N2、NO和N2O的含量。NO3 -、NO2 -采用离子色谱(ICS-900,Dionex)检测完成,O2、N2、NO和N2O由气相色谱(GC-2014AT,岛津)检测完成。
本发明与现有技术相比,有如下有益效果:
1、本发明筛选出的菌株Halomonascampisalis.BMEN3具有异养硝化和好氧反硝化能力,在好氧的条件下Halomonascampisalis.BMEN3能利用有机碳源将NH4 +转化为NO3 -和NO2 -,而NO3 -和NO2 -又会被其反硝化转化为N2。这样可以在好氧异养的条件下实现快速的同步脱硝。而且菌株能在好氧异养条件下生长,这大大提高了菌体的生长速率,提高挂膜速度,缩短反应器启动时间,提高脱硝效率。
2、本发明的菌株具有嗜盐嗜碱性,能够适应极端盐碱条件下的脱硝,适应范围分别为盐度0%~24%NaCl和pH7~12,适应的盐度及pH范围广,极值高。
3、本发明筛选的菌株主要针对高含盐含氮废水和烟道气的处理,能在12小时内,pH9~10,4%的盐度下100%脱除100mg/LNH4 +-N和140mg/LNO3 --N。
附图说明
图1为本发明的盐田盐单胞菌BMEN3在不同盐度下培养基中OD值与NOX-N浓度曲线图。
图2为本发明的盐田盐单胞菌BMEN3在不同pH值下培养基中OD值与NOX-N浓度曲线图。
图3为本发明的盐田盐单胞菌BMEN3在不同溶氧条件下培养基中OD值与NOX-N浓度曲线图。
图4为本发明的盐田盐单胞菌BMEN3同时硝化和反硝化效果图。
图5为好氧生物曝气滤池。
本发明的盐田盐单胞菌Halomonascampisalis.BMEN3已于2012年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,100101),保藏编号为CGMCCNO.6536。
具体实施方式
实施例1异养硝化和好氧反硝化菌株的筛选
1、将10mL取自鄂尔多斯盐碱湖(海拔1150米,东经109.73°,北纬39.57°)的泥样分三份接与250mL三角瓶中,其中含100mL筛选培养基(配方g/L:C4H4Na2O4·6H2O4.73,NaNO30.85,NaCl60,yeastextract1,NH4SO40.19,KH2PO41.36,5mL微量元素(g/L:Na2EDTA63.7;MnCl2·4H205·06;FeSO4·7H2O5.022;CaCl25.5;Na2MoO4·4H2O1.1;CuSO4·5H2O1.57;CoCl2·6H2O1.61;PH=7.00),用NaOH调节pH至7.5,用封口膜密封后121℃下高压蒸汽灭菌20min)。然后在30℃、180rpm调节下培养48h,测三瓶中的pH值和OD值,并观察培养基中气泡的多少,选取pH升高,OD值高且气泡较多的进行传代富集培养,如此进行三代。
2、将第三代富集培养液分别稀释10-3、10-4、10-5分别涂布于BTB筛选培养基平板(配方g/L:C4H4Na2O4·6H2O4.73,NaNO30.85,NaCl60,yeastextract1,NH4SO40.19,agar15,KH2PO41.36,BTB(1%溶于酒精)1mL,5mL微量元素),于30℃的培养箱中培养72h,挑选出菌落周围变蓝的菌株划线于新的BTB平板上,如此重复三次后得菌落形态、大小稳定的白色菌落。
实施例2筛选的菌株进行16SrDNA序列分析
提取所得菌株总DNA,然后利用16SrDNA引物进行基因扩增并测序,测序结果提交Genbank上进行Blast比较进行同源性分析。
16SrDNA基因扩增及PCR产物分析模板的制备:所得纯菌株接种于筛选培养基中培养24h,取培养液离心收集沉淀,使用基因组抽提试剂盒(基因组DNA提取方法请参见《细菌分子遗传学分类鉴定法》(上海科学技术出版社,1990年))抽提菌体总DNA,片段大小在20kbp左右,16SrDNA基因引物的设计采用通用引物27f/1492r,由广州华大基因公司提供。PCR反应体系见表1,反应条件见表2,每批次PCR反应均设立阴性参照(加入引物但不加入模板的空白对照),扩增出的基因片段大小在1440bp~1556bp之间。
表1PCR反应体系
表2PCR反应条件
委托上海美吉测序公司(北京)对扩增出的16SrDNA基因进行测序,测序结果如SEQIDNo.1所示。将测序结果在NCBI数据库进行同源性比较,采用BLAST比对方法获得结果发现该菌株与Halomonascampisalis.具有较高的同源性,命名为Halomonascampisalis.BMEN3。该菌株于2012年9月7日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,100101),其保藏号为:CGMCCNo.6536。
实施例3Halomonascampisalis.BMEN3在不同盐度下好氧反脱硝和生长曲线
分别配制NaCl浓度为0、2%、6%、12%、18%、24%、30%的脱硝培养基(与筛选培养基相比少酵母粉),pH9,100mL注入250mL三角瓶中,每个浓度三个重复,121℃灭菌20min,然后接种10%(取10mL与培养液离心洗涤三次)在37℃、180rpm条件小培养,每隔4小时取样一次,每次三个重复。取样采用分光光度计测量样品的OD600值,采用离子色谱(ICS-900,Dionex)检测NO3 -和NO2 -浓度,结果如图1。
从图1中可以看出Halomonascampisalis.BMEN3可以在0-24%的盐度下生长,从生长曲线和脱硝曲线可以看出最适生长盐度为2-6%。在4%的盐度条件下Halomonascampisalis.BMEN34h进入对数生长期,16后进入稳定期。此外Halomonascampisalis.BMEN3可以在0-6%盐度范围内12h可以完全脱除140mgNOX-N,脱除率达到280g/d.m3。从图中还可以看出Halomonascampisalis.BMEN3在高盐度下仍然具有较高的好氧反硝化能力,说明Halomonascampisalis.BMEN3能适应高盐环境,具有在高盐环境下进行好氧反硝化的能力。
实施例4Halomonascampisalis.BMEN3在不同pH值条件下的脱硝和生长曲线
配制NaCl浓度为6%的硝化培养基(与筛选培养基相比少酵母粉,NaNO3),100mL注入250mL三角瓶中,121℃灭菌20min,然后接种10%(取10mL与培养液离心洗涤三次)在pH6、7、8、9、10、11、12条件下培养,每个pH三个重复。每隔4小时取样一次,每次三个重复。测每个样品的OD600值和NO3 -和NO2 -浓度,每次三个重复,所得数据如图2。
从图2中可以看出Halomonascampisalis.BMEN3可以在pH6~12范围内生长,最适宜温度为9~10,说明Halomonascampisalis.BMEN3为嗜碱好氧反硝化细菌,因此Halomonascampisalis.BMEN3具有适应极端pH变化而进行嗜碱好氧脱硝的潜在能力与应用。
实施例5Halomonascampisalis.BMEN3在不同溶氧条件下的生长和脱硝曲线
配制NaCl浓度为6%,pH9.5,的反硝化培养基1L放于NewBrunswickBioFlo110型发酵罐中,调节空气通量和转动速度,分别使溶氧维持在1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L,每个溶氧度三个重复,以检测在不同溶氧度条件下Halomonascampisalis.BMEN3的生长和好氧反硝化能力,过程中每4h取一次样,每次三个重复。厌氧条件下的实验,用250mL三角瓶在厌氧培养箱中进行,其余相同。试验结果如图3所示。
从图3中可以看出Halomonascampisalis.BMEN3是一株好氧反硝化菌株,在溶氧度为0时几乎不生长,反硝化能力也非常弱。而在溶氧度为2~8mg/L时,细菌生长快,反硝化能力强,说明该菌株具有好氧反硝化能力。
实施例6Halomonascampisalis.BMEN3同时异养硝化和好氧反硝化
配制模拟高含盐含氮废水(配方g/L:C4H4Na2O4·6H2O4.73,NaNO30.85,NaCl60,(NH4)2SO43.82,KH2PO41.36,5mL微量元素(同实施例1),pH9),100mL注入250mL三角瓶中,三个重复,121℃灭菌20min,然后接种10%(取10mL与培养液离心洗涤三次)在37℃、180rpm条件下培养。每隔4小时取样一次,每次三个重复。测每个样品的OD值、NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N浓度,同时硝化反硝化效果如图4所示。
从图4中可以看140mg/L的硝态氮可以在4h内100%脱除,100mg/L的NH4 +-N可以在12h内完全脱除,在中间过程有NO2 -产生,但也可以在12h内完全脱除,说明Halomonascampisalis.BMEN3具有较强的同时异养硝化好氧反硝化能力。
实施例7Halomonascampisalis.BMEN3对烟道气的脱硝实验
配制烟道气脱硝培养基(配方g/L:C4H4Na2O4·6H2O4.73,Na2CO350,NaHCO310,(NH4)2SO43.8,5mL微量元素(同实施例1),pH9)。
建立如图5所示的好氧生物曝气滤池,曝气池高80cm,内径为12cm,柱内填料为多孔合成塑料。初期挂膜运行15天,挂膜完成后,开始通入工业烟道气进行脱硝,每隔1d测定出水pH值、COD值、氧化还原电位(ORP)、生物量、NO3 -、NO2 -以及反应器上层气体中O2、N2、NO和N2O的含量。NO3 -和NO2 -采用离子色谱(ICS-900,Dionex)检测,O2、N2、NO和N2O由气相色谱(GC-2014AT,岛津)检测完成。
出水中无NO2-N存在,NO3-N含量小于1.2mg/L,出水pH值维持在9.5±0.3。反应器上空气体主要组成为N2和CO2,无NO和N2O存在。说明在该工艺下,Halomonascampisalis.BMEN3具有非常好的工业烟道气脱硝效果。
Claims (5)
1.一株具有异养硝化好氧反硝化功能的盐田盐单胞菌BMEN3(Halomonascampisalis.BMEN3),其保藏编号为:CGMCCNO.6536。
2.根据权利要求1所述的盐田盐单胞菌BMEN3,其特征在于,所述盐田盐单胞菌的16SrDNA序列如SEQIDNo.1所示。
3.权利要求1所述盐田盐单胞菌BMEN3在硝化、反硝化方面的应用。
4.权利要求1所述盐田盐单胞菌BMEN3在含盐含氮的工业废水及市政废水处理中的应用。
5.权利要求1所述盐田盐单胞菌BMEN3在工业烟道气脱硝中的应用。
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Granted publication date: 20160406 Termination date: 20171114 |