CN102250779B

CN102250779B - 一株应用于城市污泥生物沥浸处理的耐酸性异养菌d13

Info

Publication number: CN102250779B
Application number: CN 201110158711
Authority: CN
Inventors: 周立祥; 郑冠宇
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2011-06-14
Filing date: 2011-06-14
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2031-06-14
Also published as: CN102250779A

Abstract

本发明涉及一株应用于城市污泥生物沥浸处理的耐酸性异养菌D13，属于环境工程技术领域。该菌株单细胞呈卵圆形，直径4.5～5.5μm，一端芽殖，不产生子囊孢子，有荚膜。菌落菌落呈粘质样，白色，表面褶皱，边缘整齐，能在pH＝2的极端酸性环境下正常生长，经形态、生理生化特性以及分子生物学鉴定，该菌株属于毕赤酵母菌(Pichia spartinae)，保藏编号为CGMCC No.3035。该菌株在污泥生物沥浸环境中可快速利用污泥中水溶性小分子有机物或简单有机酸作碳源和能源，并使生物沥浸溶液中CO₂大幅升高，从而促进了污泥生物沥浸效率，使污泥重金属脱出率达到90％以上，污泥脱水性提高10多倍。

Description

一株应用于城市污泥生物沥浸处理的耐酸性异养菌D13

一、技术领域

本发明涉及一株应用于城市污泥生物沥浸处理的耐酸性异养菌D13，是一项利用异养菌与自养菌互作进行污泥生物沥浸处理的技术，属于环境工程技术领域。

二、技术背景

我国每年产生大量的、亟待处置的各类城市污泥和工业污泥等。目前仅城市污泥每年就产生约700万吨(干物质计)，工业污泥的数量也十分巨大，污泥处理处置运行成本在污水处理厂中占到30％-50％，而且这些污泥在我国目前都没有很好的处置途径。一方面污泥难浓缩脱水，且脱水污泥含水量很高(多数在80％-85％)，因此影响到诸如焚烧、填埋等处置，若采用堆肥方法，则需要大量的调理剂调节水分，十分不便。另一方面虽然污泥土地利用多年来一直被认为是处置费用低廉，并能实现污泥资源化利用的途径，但由于许多污泥都存在浓度不等种类不同的有毒重金属(特别是在我国许多工业园区的城市污水处理厂或接纳部分工业废水的城市污水处理厂，以及一些工业企业污水处理厂所产生的污泥尤其较多)，因此，在很大程度上制约了污泥的土地利用。因此，实现污泥高干度脱水和从污泥中去除重金属，是实现污泥合理处置和资源化利用的重要前提，也是化解污泥处置难题的重要技术措施。

近年来，研究发现利用生物沥浸技术(Bioleaching，以前也称为生物淋滤或生物沥滤)预处理液态污泥具有促进污泥脱水和溶出重金属的功效。本课题组自1998年开始已将该技术逐渐从实验室小试推动到生产性试验，现日处理污泥100多吨，相当于一个日处理5万吨污水的城市污水处理厂所产生的污泥，技术与规模已处于国际领先地位。

本课题组曾公开了两种高效作用于污泥的自养型生物沥浸微生物的专利(ZL02112924.X，ZL02137921.1)，即嗜酸性氧化亚铁硫杆菌LX5和氧化硫硫杆菌TS6。但在实际运行中，效果不稳定，尤其在长期处理时微生物活性会变低。这是因为氧化亚铁硫杆菌和氧化硫硫杆菌都是专性化能自养菌，对水溶性有机物有一定的敏感性，而污泥中水溶性有机物含量往往超过了它的致毒水平。因此，在以单一的硫杆菌为主导的系统中，往往难于保证效果的稳定。随后，本课题组于2004年5月31日发明了一种耐酸性红酵母菌及其用于污泥中重金属的生物脱除的方法的专利(ZL200410044843.8)，通过在污泥中同时接种以水溶性有机物为能量来源和碳源的红酵母菌R30，以大幅度降低这些有毒的小分子在污泥中的浓度，大大提高了硫杆菌在污泥生物沥浸中的活性，使污泥生物沥浸处理效率和稳定性得到进一步提高。这说明在污泥生物沥浸系统中，耐酸性异养菌的加入是非常有益的。但R30菌株最多只能在pH3的酸性环境下才能正常生长，因此，当生物沥浸系统pH小于3时会对该菌有抑制，会影响其稳定性。寻找更高效的耐更低pH的异养菌，使污泥生物沥浸系统的微生物多样性更丰富，必然有利于系统的稳定，对生物沥浸的工程化应用非常重要。

三、发明内容

技术问题本发明的目的在于提供一种耐酸性异养菌以消除污泥生物沥浸处理中对硫杆菌生长有影响的小分子有机物，并能为硫杆菌生长提供更丰富的可溶性二氧化碳(自养菌的碳源)，从而提高生物沥浸效率和长期运行的稳定性。

技术方案下面为本发明的主要内容：

本发明提供的一株在污泥生物沥浸中耐酸性的异养菌菌株D13，分离自生物沥浸酸化污泥，经过鉴定确认为毕赤酵母(Pichia spartinae)D13。该菌株于2009年4月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所，中国北京)，其保藏编号为CGMCC No.3035。菌株经PCR扩增后，其26S rRNA序列在GenBank的登录号为FJ850047。

上述菌株D13经鉴定，具有如下生物学特征：

(1)菌株的形态特征：单细胞呈卵圆形，直径4.5～5.5μm，一端芽殖，不产生子囊孢子，缺氧条件下生长可形成假菌丝，有荚膜。菌落菌落呈粘质样，白色，表面褶皱，边缘整齐，液体培养浑浊，沉淀物疏松。

(2)菌株的生理生化特征：该菌株在25～35℃条件下生长良好，易于常温下培养，其最适生长温度为30℃。在pH1～9均能生长，最适pH为2～5.5，当pH＞5.5时生长受到一定影响，当pH＜2时生长受较大抑制。试验发现在污泥生物沥浸的后期pH达到2.0～1.5时，仍能够检测到菌株D13，说明它对酸性环境的耐受能力很强。菌株D13能发酵葡萄糖而不发酵乳糖和蔗糖，能同化KNO₃和(NH₄)₂SO₄，不能利用肌醇作为唯一碳源，不形成类淀粉化合物，脲酶测试和DBB测试均成阴性。

(3)菌株的分子生物鉴定结果：菌株D13的26S rRNA的D1/D2区共测出611个碱基对，在核酸数据库GenBank(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)登录号为FJ850047。26SrRNA的序列如下：

gcatatcaat aagcggagga aaagaaacca acagggattg ccttagtaac ggcgagtgaagcggcaaaag ctcaaatttg aaatctggca tcttcggtgt ccgagttgta atttgaagaa ggtaactttggagttggctc ttgtctatgt tccttggaac aggacgtcac agagggtgag aatcccgtgc gatgagatgccaattctatg taaagtgctt tcgaagagtc gagttgtttg ggaatgcagc tctaagtggg tggtaaattccatctaaagc taaatattgg cgagagaccg atagcgaaca agtacagtga tggaaagatg aaaagaactttgaaaagaga gtgaaaaagt acgtgaaatt gttgaaaggg aagggtttaa gatcagactt ggtattttgtatggcttcct ttcggggtgg tcctctacgt tttaccgggc tagcatcagt ttggatggta ggataatggcattggaatgt gacattgctt cggtgatgtg ttatagcctt tgttgatact gcctatctag actgaggactgcgtctttga ctaggatgct ggcataatga tcttcaaccg cccgtcttga aacacggaac a

菌株D13与毕赤酵母(Pichia spartinae)相似性最高，同源性达到99％以上，因此，鉴定为毕赤酵母D13。

有益效果

该菌株与已有的同类菌株相比具有明显优点：

在污泥生物沥浸系统中，能耐受pH1的酸性环境，在pH2时能很好生长，因此，在生物沥浸中能保持较长久的活力而不需要经常添加。

该菌能快速利用污泥生物沥浸系统中溶解性有机物(DOM)，消除DOM对硫杆菌的毒害。

该菌在利用污泥中DOM或小分子有机酸时，会迅速产生较高浓度的溶解性CO₂，大大促进以CO₂为碳源的硫杆菌生长。

因此，在污泥生物沥浸中，接种毕赤酵母D13可使污泥生物沥浸时间缩短到2天，处理后污泥脱水性提高10多倍，重金属溶出率达到90％左右，具有明显的促进作用。

四、具体实施方式

下面叙述本发明的实施例。

1、菌株D13的分离与扩大培养

配制PDA培养基，成分：马铃薯200g，蔗糖或葡萄糖20g，水1000mL，pH自然，121℃，30min灭菌。用于分离耐酸性异养菌的样品取自于先前完成的城市污泥生物沥浸处理后的酸化污泥(pH值为2.0左右)。用接种环取酸化污泥液一环，在PDA平板上划线分离，将上述接种污泥悬液的平板于28℃下倒置培养3～4d，至生长出菌落。在PDA平板上分离生长较好的有代表性的单菌落做涂布镜检，若有不纯，则进一步挑取此菌落反复划线，直至获得目的菌株的纯菌，并转移斜面保存备用。液体培养条件：从斜面上取D13菌苔，接种于PDA液体培养基中，28-30℃，于180rpm往复式摇床培养2天，菌数达10⁸个/mL。形态观察和显微镜检发现，该菌株单细胞呈卵圆形，直径4.5～5.5μm，一端芽殖，不产生子囊孢子，缺氧条件下生长可形成假菌丝，有荚膜。菌落菌落呈粘质样，白色，表面褶皱，边缘整齐。菌株进一步经生理生化鉴定和分子生物学鉴定后确定为毕赤酵母D13。

2、D13最适生长的pH测定

将一定体积的PDA液体培养基按照每瓶50mL分装于一系列250mL三角瓶中。用4NH₂SO₄将培养基pH值分别调节至1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0和7.0的8个梯度，随后于121℃下灭菌15min。待冷却后分别取一环毕赤酵母D13斜面菌苔接种于上述培养基中，置于转速为180r/min摇床中28℃恒温培养36h。酵母菌的生长用培养液在600nm处的吸光值(OD)来表征，每个pH处理均设3个重复，结果见表1。

表1毕赤酵母D13在不同pH培养基中生长状况

结果表明，毕赤酵母D13能耐受pH 1.0的极端酸性环境，在该环境下仍有少量的生长。当pH达到2.0时，该菌就能很好生长，但到pH大于6.0时，生长受影响。目前能在如此低的pH下生长的异养菌并不多见。先前报道的专利(ZL200410044843.8)涉及的红酵母R30，仅在pH 3.0或以上才能很好生长。

3、D13对污泥DOM的利用及在生物沥浸溶液中CO₂浓度的测定

取5L污泥DOM(预先调节pH为5)，高温湿热灭菌后，冷却，接种酵母菌D13菌苔一环，置于7L的生物发酵罐中，于28℃下培养48h。并设置不接种酵母菌D13的对照处理，其他条件完全相同。用TOC仪测定发酵前后DOM浓度变化，用溶液CO₂探头测定溶液中CO₂浓度，结果见表2。

表2毕赤酵母对污泥DOM的利用率及溶液中CO₂浓度

结果表明，D13在48h内对污泥在DOM的利用率高达83％，而对照处理仅不到3％，说明D13可通过利用DOM而迅速将其分解，从而减少了DOM对硫杆菌的毒害。如此同时，D13在利用DOM时可产生大量的CO₂，因此又促进了以CO₂为碳源的硫杆菌的生长。

4、D13在污泥生物沥浸中的作用效果

硫杆菌Thiobacillus sp.，主要为本实验室分离的菌株Thiobacillus thiooxidans TS6(CGMCC NO.0759)。在本课题组发明的生物反应器(专利号ZL200520072316.8)中加入含水率为97％的液态城市污泥20L和0.3～10g/L单质硫，并接种3％～7％的硫杆菌，于28℃下，进行驯化培养，至污泥pH约为3时正式开始进行试验。此时，采用连续进泥，连续排泥方式处理，即泵入新的城市污泥，并同时按一天处理污泥重量的5％一次性接种D13液体发酵菌液(以后不在添加)，污泥停留时间(SRT)为2天，稳定运行1周后，采集排出的生物沥浸处理污泥，测定重金属(Cu，Zn，Cd，Cr)溶出率和污泥脱水性能，同时做不加D13的对照处理，污泥脱水性能采用测定污泥比阻(γ)来衡量，比阻值越大污泥越难脱水，测定结果见表3。

表3在接种与不接种D13的情况下污泥生物沥浸处理效果效果

结果显示，在污泥停留时间为2天的生物沥浸条件下，接种D13处理效果要提高许多，主要表现在重金属溶出率比不接种处理高出许多，重金属Cu，Zn，Cd，和Cr溶出率平均达到90％以上，比阻也有大幅度下降。与未处理的原始污泥相比，接种D13菌株的生物沥浸污泥脱水性提高13倍。很明显，该菌具有有效提高污泥生物沥浸的效果并具有很好的稳定性。

Claims

1.一株应用于城市污泥生物沥浸处理的耐酸性异养菌D13，命名毕赤酵母D13(Pichia spartinae D13)，2009年4月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3035。

2.根据权利要求1所述的应用于城市污泥生物沥浸处理的耐酸性异养菌D13，其特征在于所述的毕赤酵母D13可在pH＝2的极端酸性环境中正常生长。

3.根据权利要求1所述的应用于城市污泥生物沥浸处理的耐酸性异养菌D13，其特征在于所述的毕赤酵母D13的26S rRNA在GenBank登录号为FJ850047，它的26S rRNA序列如下：

gcatatcaat aagcggagga aaagaaacca acagggattg ccttagtaac ggcgagtgaa gcggcaaaag

ctcaaatttg aaatctggca tcttcggtgt ccgagttgta atttgaagaa ggtaactttg gagttggctc

ttgtctatgt tccttggaac aggacgtcac agagggtgag aatcccgtgc gatgagatgc caattctatg

taaagtgctt tcgaagagtc gagttgtttg ggaatgcagc tctaagtggg tggtaaattc catctaaagc

taaatattgg cgagagaccg atagcgaaca agtacagtga tggaaagatg aaaagaactt tgaaaagaga

gtgaaaaagt acgtgaaatt gttgaaaggg aagggtttaa gatcagactt ggtattttgt atggcttcct

ttcggggtgg tcctctacgt tttaccgggc tagcatcagt ttggatggta ggataatggc attggaatgt

gacattgctt cggtgatgtg ttatagcctt tgttgatact gcctatctag actgaggact gcgtctttga

ctaggatgct ggcataatga tcttcaaccg cccgtcttga aacacggaac a。

4.根据权利要求1所述的应用于城市污泥生物沥浸处理的耐酸性异养菌D13，其特征在于所述的毕赤酵母D13接种在污泥生物沥浸系统中反应2天可使污泥脱水性提高10倍以上，重金属溶出率提高到90％以上。