CN115074267B

CN115074267B - 一种具有硫氧化功能的盐单胞菌及应用

Info

Publication number: CN115074267B
Application number: CN202210517102.5A
Authority: CN
Inventors: 梁军锋; 张克强; 于淑豪; 翟中葳; 王风; 赵润
Original assignee: Agro Environmental Protection Institute Ministry of Agriculture
Current assignee: Agro Environmental Protection Institute Ministry of Agriculture
Priority date: 2022-05-13
Filing date: 2022-05-13
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2042-05-13
Also published as: CN115074267A

Abstract

本发明提供了一株具有硫氧化功能的盐单胞菌，其特征在于：名称为AEB2，分类命名为：蒙古盐单胞菌(Halomonas mongoliensis)，保藏编号为CGMCC No.24425，保藏日期为：2022年2月23日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明在实验室条件研究了蒙古盐单胞菌(Halomonas mongoliensis)AEB2对硫化物的氧化特征、氧化产物以及对于畜禽粪污中硫化氢气体的减控特征，为该菌株在恶臭气体减控、面源污染治理等领域的应用提供了科学依据。

Description

一种具有硫氧化功能的盐单胞菌及应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其是一株具有高效硫氧化功能的盐单胞菌及其应用。

背景技术

我国是畜禽养殖大国，据报道2020年我国生猪、牛、羊出栏量分别为52704万头、4565万头、31941万头，养殖当量居世界首位。如此庞大的畜禽养殖规模，引发了一系列的环境问题。其中养殖场产生的恶臭气体是重要的污染之一，严重影响场区周边空气质量。据2021年生态环境部的统计信息，2020年全年畜牧业占全部恶臭/异味的比例为12.7％，居所有投诉行业首位，这些恶臭气体排放不仅对畜禽本身的生长有影响，对周边的环境及人类的健康也是一种危害。畜禽养殖产生的恶臭问题，已经成为急需解决的问题。

畜禽养殖场的恶臭气体来源于畜禽的养殖与粪污处理过程，如动物呼吸、动物粪尿、废水处理及粪便处理等。其所带来的恶臭成份复杂多样，按照其成份可以大致归为以下几种：氨和挥发性胺类、吲哚和酚类、含硫化合物、挥发性脂肪酸等。其中硫化氢因其嗅阈值低、排放量大而受到广泛关注。Trabue等研究发现硫化氢是猪粪贮存过程中排放的主要致臭气体，占比达到65％以上；沈玉君等的研究表明硫化氢是猪粪好氧发酵过程中的主要致臭因子之一。除了具备强烈恶臭以外，硫化氢还具有一定毒性，高浓度硫化氢对人畜均会产生不利影响。

目前针对养殖场硫化氢除臭技术主要有物理法、化学法、生物法等。其中生物除臭因成本低、无二次污染、设备简单等逐渐成为治理恶臭的主要方法。生物除臭技术中发挥除臭效果的主体是具有除臭功能的微生物菌株，目前应用于去除硫化氢恶臭气体的细菌主要为硫氧化菌(Sulfur-oxidizingbacteria，SOB)，其是指能够氧化硫化物、硫单质、硫代硫酸盐、亚硫酸盐等功能微生物。目前生物去除硫化氢的研究多集中在自养菌中，但自养菌的生长速度缓慢、硫氧化周期长等局限，使得其在实际应用中受到一定限制，并未实现大范围应用。因此，寻找其他类型新的高效硫氧化菌株依然收到极大的关注。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种具有高效硫氧化功能的盐单胞菌及应用。

本发明解决技术问题所采用的一种具有高效硫氧化功能的盐单胞菌及应用，名称AEB2，分类命名为：蒙古盐单胞菌(Halomonas mongoliensis)，保藏编号为CGMCCNo.24425，保藏日期为：2022年2月23日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

进一步地，所述菌株生长速度较快，易培养，培养13h对1000mg/L的硫化物的降解率高达99.6％。

进一步地，所述菌株AEB2的16S rDNA序列为SEQ ID NO.1。

包含如上所述的一种具有高效硫氧化功能的盐单胞菌及应用的菌剂。

进一步地，所述硫氧化降解菌剂还包括培养基，所述培养基含丁二酸钠、磷酸二氢钾、氯化镁、氯化铵、碳酸氢钠、氯化钠。

如上所述的硫氧化菌剂的制备方法，步骤如下：

用接种环，用接种环，从斜面保藏菌株中挑取蒙古盐单胞菌(Halomonasmongoliensis)

AEB2菌体，接种于灭菌液体培养液中，于30℃恒温摇床上200r/min培养20h，菌剂中活菌数为10⁹个/mL以上，即得硫氧化菌剂。

其中，所述培养基的配方为：丁二酸钠10g，KH₂PO₄0.5g，MgCl₂0.2g，NH₄CL0.6g，NaHCO₃3g，NaCl 5g，用去离子水溶解并定容于至1L。

如上所述的具有高效硫氧化功能的盐单胞菌在硫氧化方面中的应用。

本发明取得的有益效果是：

1、本发明提供了一种具有高效硫氧化功能的盐单胞菌(Halomonasmongoliensis)AEB2，该菌株具有生产速率快、易培养，13h可对1000mg/L的硫化物去除率高达99.6％，优于已报道菌株(CN112551692A)，在恶臭气体防控、面源污染治理等方面具有广泛的应用前景。

2、本发明蒙古盐单胞菌(Halomonas mongoliensis)AEB2可以应用于农业资源环境领域，可以用于氧化硫化物，优选得到的蒙古盐单胞菌Halomonas mongoliensisAEB2，生产速度快，易培养，作为单一菌株以4％接种量处理1000mg/L的硫化物，培养13h后硫化物氧化率达99.6％d，且产物为不含腐蚀含金属的处理设施，优于已报道的细菌菌株。

3、本发明从奶牛场污水贮存池筛选得到高效硫氧化菌株，对硫化物具有较高的降解作用，在恶臭气体减控、面源污染治理等方面具有很大的应用前景，对于农业环境保护具有重要意义。

附图说明

图1为本发明中蒙古盐单胞菌Halomonas mongoliensisAEB2在平板培养基上的菌落形态图、显微形态图、扫描电镜形态图；其中，左图为菌落形态图，中图为革兰氏染色图，右图为扫描电镜图。

图2为菌株AEB2进化树。

图3为本发明蒙古盐单胞菌Halomonas mongoliensisAEB2对不同浓度硫化物氧化特征图。

图4为菌株AEB2对于硫酸盐的氧化速率。

图5为菌株AEB2对粪污中硫化氢及氨气的减排效果。

图6不同条件对菌株AEB2硫化物氧化性能的影响。

图7优化前后硫化物去除效果对比.

具体实施方式：

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。

一种具有高效硫氧化功能的盐单胞菌，名称为AEB2，分类命名为：蒙古盐单胞菌(Halomonas mongoliensis)，保藏编号为CGMCC No.24425，保藏日期为：2022年2月23日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述菌株生长速度较快，易培养，培养13h对1000mg/L的硫化物的降解率高达99.6％。所述硫氧化降解菌剂还包括培养基，所述培养基含丁二酸钠、磷酸二氢钾、氯化镁、氯化铵、碳酸氢钠、氯化钠。

所述菌株AEB2的16S rDNA序列为SEQ ID NO.1。

上述硫氧化菌剂的制备方法，可以采用如下步骤：

⑴用接种环，用接种环，从斜面保藏菌株中挑取蒙古盐单胞菌(Halomonasmongoliensis)

AEB2菌体，接种于灭菌液体培养液中中，于30℃恒温摇床上200r/min培养20h，菌剂中活菌数为10⁹个/mL以上，即得硫氧化菌剂。

如上所述的具有高效硫氧化功能的盐单胞菌在硫化物氧化方面中的应用。

本发明从奶牛场氧化塘污水中筛选一株盐单胞菌(Halomonas mongoliensis)AEB2，分别进行了形态学和分子生物学方法鉴定。形态学鉴定包括平板培养特征、显微特征特征、扫描电子显微镜形态特征，分子生物学方法选择细菌基因组中的16S rRNA基因扩增测序，结果显示，与蒙古盐单胞菌(Halomonas mongoliensis)同源性较高。菌株名称为AEB2，分类命名为：蒙古盐单胞菌(Halomonas mongoliensis)，保藏号为CGMCC No.24425，保藏日期为：2022年2月23日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明在实验室条件研究了蒙古盐单胞菌(Halomonas mongoliensis)AEB2对硫化物的氧化特征、氧化产物以及对于畜禽粪污中硫化氢气体的减控特征，为该菌株在恶臭气体减控、面源污染治理等领域的应用提供了科学依据。

实施例1

蒙古盐单胞菌(Halomonas mongoliensis)AEB2上述菌株筛选及确认

(1)菌株的分离

样品采集于天津市某奶牛场氧化塘污水。采集的污水于无菌塑料广口瓶中，低温带回实验室。取采集的样品5g加入到装有95ml无菌水的三角瓶中，恒温摇床上震荡30min，取5mL摇匀后的溶液接种至扩繁培养基中，摇床培养三天后将菌液接种至富集培养基进行菌株的富集，共富集三次，间隔周期为72h。在富集过程中依次调整培养基中硫化钠含量(100、150、200mg/L)，摇床条件保持一致设置为30℃、150r/min。富集完成后，取富集后的菌液，在由分离培养基制成的平板中进行多次划线分离，观察平板上菌落生长情况，并挑取菌株作斜面保存。

富集培养基采用丁二酸钠培养基其组分为(g/L)：丁二酸钠10，KH₂PO₄0.5，MgCl₂0.2，NH₄CL 0.6，NaHCO₃3，NaCl 5，Na₂S·H₂O 0.8，用去离子水溶解并定容于至1L。分离培养基采用丁二酸钠琼脂培养基：基础成分同富集培养基，按20g/L比例添加琼脂。(九水硫化钠添加方法：取适量九水硫化钠溶于少量无菌水中，用无菌注射器吸取溶液，并用0.22um灭菌微孔滤膜过滤除菌，缓慢加入到经高压蒸汽灭菌后冷却至50℃的培养基中，摇动混匀备用)。扩繁培养基采用营养肉汤培养基。

(2)菌株的筛选

取保存的菌株接种至扩繁培养基中培养3d进行菌株的活化，定量移取5mL活化后的菌液接种至富集培养基，于30℃、150r/min摇床中培养120h，同时设置不接菌对照处理，定期从三角瓶中取样测定反应液中的S^2-与SO₄ ^-2浓度。

生长曲线测定：将活化后的菌液用无菌水调整OD值为1.0按5％接种量接种富集培养基中，每2h进行一次取样，共培养120h，取样间隔随培养时间适当延长，测定菌液的OD600值，以此表征菌株的生长情况。

(3)菌株鉴定

菌株的16S rRNA测序鉴定：取足量菌液在4℃和8000r/min条件下离心，并用无菌水清洗三次以获得测序菌体。利用DNA提取试剂盒提取菌株基因组作为模板，采用细菌通用引物F27(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和R1492(GGTTACCTTGTTACGACTT)进行扩增反应。通过NCBI数据库对测序结果进行序列比对，在MEGA 7.0软件中运用邻接法(Neighbor-JoiningMethod)构建系统进化发育树，进化树拓扑结构经过1000次的引导重复取样检验。菌株的鉴定采用皿内菌落特征、革兰氏染色、扫描电子显微特征观测与16S rDNA分子生物学共同鉴定，命名为蒙古盐单胞菌(Halomonas mongoliensis)AEB2，到保藏中心进行保藏。

(4)菌剂的制备

其中，所述培养基的配方为：丁二酸钠10，KH₂PO₄0.5g，MgCl₂0.2g，NH₄CL0.6g，NaHCO₃3g，NaCl 5g，用去离子水溶解并定容于至1L。

实施例2

菌株的硫氧化特性

1、接种量对S^2-的去除效果影响

不同接种量对S^2-的去除效果如图6a所示。由图6a可知，S^2-的去除率随着接种量的增加而提高，呈现出先快速增长后期增速减缓的趋势。当接种量为1％-4％时S^2-去除率呈快速增长趋势，为11.6-98.2％；当接种量为4％-10％时，S^2-去除率的增长趋势减缓，为98.2-99.9％。方差分析结果表明4％-10％三个接种量处理下S^2-的去除率与1％、2％处理差异显著(p＜0.05)。OD₆₀₀的变化规律呈现出与S^2-去除率相同的趋势。由此可见，当接种量大于4％时，即可快速启动S^2-的去除，减少微生物生长的迟滞期。S^2-对于细菌具有一定毒理性功能，这会对细菌的生理产生一定的抑制作用。初始菌浓度增加后，S^2-对细菌的抑制作用减弱，这缩短了S^2-去除的迟缓期；其二是初始菌浓度不同导致的细菌的生长速率差异，高接种量下细菌的生长速率较快，从细菌生长量的结果来看，越高的接种量OD₆₀₀增量越大，因此S^2-去除效果更强。

2、温度对S^2-的氧化效果影响

不同温度对S^2-的去除效果如图6b所示。由图6b可知，当温度从15℃上升至40℃时，S^2-去除率与OD₆₀₀均呈先升后降趋势。其中温度为30℃时S^2-的去除率最高，为98.5％。当培养温度从15℃上升至30℃时，S^2-去除率由54.8％逐步升高至98.5％，培养温度由30℃升高至40℃时，S^2-去除率由98.5％降至92.69％。方差分析结果表明，菌株AEB2在25℃～35℃的生长状况差异不显著，同时在20℃～40℃区间内，S^2-去除率均保持在80％以上，这说明菌株AEB2具有较广的温度适应性。

3、摇床转速对S^2-的氧化效果影响

摇床转速不同影响溶液中溶解氧含量，进而影响微生物的生长及对S^2-的氧化能力。不同摇床转速对S^2-的去除率如图6c所示。由图6c可知，菌株AEB2在不同摇床转速下对于S^2-的去除效果不同。当摇床转速为低速时(0～90r/min)，随着摇床转速的提高S^2-的去除率快速提高，为18～70％；当转速在90r/min-210r/min时，转速的提高对于S^2-的去除率提升不大，为70.0％-78.0％。这说明在90r/min以上已经满足AEB2的硫氧化氧气需求，其中摇床转速为180r/min时，菌株AEB2的OD₆₀₀与S^2-的去除率均最高，表明菌株AEB2在180r/min时的生长状况与硫氧化能力最优。

4、初始pH对S^2-的氧化效果影响

pH是影响微生物生长的重要因素之一，不同初始pH对S^2-的去除效果如图6d所示。由图6d可知，S^2-去除率随初始pH升高呈先升后降趋势。初始pH为6时S^2-去除率仅为4.3％，当初始pH值由6提高为7时，S^2-去除率升高至81.3％，呈快速增长趋势；当初始pH值为8～9.5时去除率缓慢下降，由98.7％下降至93.2％。其中初始pH为8时，S^2-去除率及OD₆₀₀均为最高，方差分析结果表明，初始pH在7～9.5区间内S^2-的去除率差异不显著，反应液中OD₆₀₀表现类似结果。以上结果表明菌株AEB2在中性偏碱的环境中硫氧化能力较好。pH对S^2-的影响较大，这主要是由H₂S的自身特性所决定的，H₂S溶于水中会以解离形式(HS^-、S₂ ^-)及未解离形式(H₂S)存在，pH值的升高会降低未解离形式(H₂S)所占的比例，从而减少H₂S逃逸到气象的比例，因此H₂S在碱性介质中的吸收更加高效，在pH值较高的体系中S^2-占主导地位。同时这也是S^2-对微生物生长产生抑制作用的根源，它可以通过细胞膜扩散，抑制内部的细胞活性。

实施例3

菌株AEB2对不同浓度硫化物的氧化特征实验

将制备所得的菌液接种至含不同浓度硫化物(100、200、500、1000mg/L)的富集培养基中，并用经0.22um灭菌微孔滤膜过滤除菌后的HCL溶液调整培养基pH为8.2，在30℃、210r/min条件下培养2h测定反应液中硫化物含量。

实施例4

菌株AEB2对畜禽粪污中硫化氢气体的减排实验

从天津市某牧场污水贮存池中采集粪水样品进行试验。试验装置为广口玻璃容器，容积为2.5L。取800mL粪水样品于装置内中，将菌液按1％的接种量接种，搅拌均匀后在装置内放置两个分别装有硼酸吸收液和锌铵络盐吸收液的小烧杯，用以吸收氨气和硫化氢，并用塑料薄膜进行密封，同时设置不接菌对照处理，每处理组3个重复。将上述装置放在恒温培养箱中30℃下培养3d后测定氨气、硫化氢排放量。

试验结果显示菌株AEB2对浓度为100mg/L、200mg/L、500mg/L、1000mg/L的硫化物的氧化率菌均在99％以上，且氧化速率较快，分别为2h、4h、7h、13h；接种菌株可降低畜禽污水中的硫化氢排放量的45％。

本实验中菌株对粪污中硫化氢气体的减排效果：从天津市某牧场污水贮存池中采集污水样品进行试验，样品基本理化性质为：pH 6.8、干物质含量3.8％、总氮1193.8mg/L、总磷156.05mg/L。

本发明在最优条件下探究了菌株AEB2对S^2-去除的效果，并与未优化前效果进行比较，结果表明，在相同时间下优化后去除率均高于优化前，其中优化后1.5h时去除率即可达到96.5％，较未优化前提升28.2％，表明在32.5℃、210r/min、初始pH 8.2的反应条件下，菌株AEB2硫氧化能力明显增加，在100～1000mg/L的S^2-负荷下去除率均能保持在99％以上，

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 农业农村部环境保护科研监测所

<120> 一种具有高效硫氧化功能的盐单胞菌及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1438

<212> DNA

<213> DNA序列(Unknown)

<400> 1

tgcaagtcga gcggaaacga tggaagcttg cttccaggcg tcgagcggcg gacgggtgag 60

taatgcatgg gaatctgccc gatagtgggg gataacctgg ggaaacccag gctaataccg 120

catacgtcct acgggagaaa gcgggggatc ttcggacctt gcgctatcgg atgagcccat 180

gtcggattag cttgttggtg aggtaatggc tcaccaaggc gacgatccgt agctggtctg 240

agaggatgat cagccacatc gggactgaga cacggcccga actcctacgg gaggcagcag 300

tggggaatat tggacaatgg gcgaaagcct gatccagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg 360

ccctcgggtt gtaaagcact ttcagtgggg aagaaagcct tgaggttaat accttcgagg 420

aaggacatca cccacagaag aagcaccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg 480

gagggtgcga gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg cgcgtaggcg gtctgataag 540

ccggttgtga aagccccggg ctcaacctgg gaacggcatc cggaactgtc aggctagagt 600

gcaggagagg aaggtagaat tcccggtgta gcggtgaaat gcgtagagat cgggaggaat 660

accagtggcg aaggcggcct tctggactga cactgacgct gaggtgcgaa agcgtgggta 720

gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcgact agccgttggg 780

gtccttgaga cctttgtggc gcagttaacg cgataagtcg accgcctggg gagtacggcc 840

gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 900

aattcgatgc aacgcgaaga accttaccta cccttgacat cgagagaact tggcagagat 960

gccttggtgc cttcgggaac tctcagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg 1020

tgaaatgttg ggttaagtcc cgtaacgagc gcaacccttg tccttatttg ccagcgcgta 1080

atggcgggaa ctctaaggag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gacgacgtca 1140

agtcatcatg gcccttacgg gtagggctac acacgtgcta caatggacgg tacaaagggt 1200

tgcaaagccg cgaggtggag ctaatcccag aaagctgttc tcagtccgga tcggagtctg 1260

caactcgact ccgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtga atcagaatgt cacggtgaat 1320

acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtggactg caccagaagt 1380

ggttagccta acttcggagg gcgatcacca cggtgtggtt catgactggg gtgaagtc 1438

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Unknown)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Unknown)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

1.一株具有硫氧化功能的盐单胞菌，其特征在于：名称为AEB2，分类命名为：蒙古盐单胞菌(Halomonas mongoliensis)，保藏编号为CGMCC No.24425，保藏日期为：2022年2月23日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.一株权利要求1所述的具有硫氧化功能的盐单胞菌AEB2的培养方法，其特征在于：步骤如下：用接种环从斜面保藏菌株中挑取蒙古盐单胞菌(Halomonas mongoliensis)AEB2菌体，接种于灭菌液体培养液中，于30℃恒温摇床上200r/min培养20h，菌剂中活菌数为10⁹个/mL以上，即得硫氧化菌剂；

其中，液体培养液的配方为：丁二酸钠10g，KH₂PO₄0.5g，MgCl₂0.2g，NH₄CL 0.6g，NaHCO₃3g，NaCl 5g，用去离子水溶解并定容于至1L。