CN113278561B

CN113278561B - 植物乳杆菌sd36及其禽畜粪便除臭的应用

Info

Publication number: CN113278561B
Application number: CN202110710485.3A
Authority: CN
Inventors: 谢远红; 张红星; 霍子晨; 金君华
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing University of Agriculture
Priority date: 2021-06-25
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2041-06-25
Also published as: CN113278561A

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体而言，提供了一种植物乳杆菌SD36及其禽畜粪便除臭的应用。本发明提供的植物乳杆菌SD36由发明人首次从天然发酵泡菜中分离得到，该菌株的发酵液可以实现禽畜粪便中H₂S和NH₃的有效去除。此外，可以实现禽畜粪便中有害微生物生长的抑制。

Description

植物乳杆菌SD36及其禽畜粪便除臭的应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种植物乳杆菌SD36及其禽畜粪便除臭的应用。

背景技术

随着我国养殖业的高速发展，大量畜禽粪便在堆放过程中会不断发酵产生NH₃、H₂S等有害气体，长期接触会对人畜的健康造成危害，对环境造成严重危害。因此，减少NH₃、H₂S等有害气体的排放，是解决目前粪便除臭问题的研究热点之一。

截至目前，国内外对于畜禽粪便中NH₃和H₂S的治理技术可分为三大类：

物理除臭工艺较为成熟，但是对要处理的气体和环境要求高，处理成本高，不能从根本上去除异味成分。

化学除臭方法虽然具有良好的除臭效果，但由于其适用范围有限、整套体系运行价格昂贵、反应程序复杂、极易造成自然环境二次污染等缺点，故不易推广。

微生物除臭法是一种利用微生物自身的新陈代谢进而降解NH₃和H₂S的方法，其主要特点是具有低成本、高效率、适用范围广且无二次污染的优点，已成为目前处理臭气的主要方法。

微生物除臭技术的关键是筛选出具有高效的除臭菌株。长期以来，我国科研人员一直在筛选具有高效的除臭菌株。但是，由于筛选方法的限制和菌株的特异性，所筛选的除臭菌株具有适应性较差、作用较为单一、除臭效率低、除臭时间过长等多方面的问题。一些研究表明，复合菌株的除臭效果明显好于单一菌株，不过微生物除臭技术的目的之一就是为了降低除臭所带来的成本问题，过多的采用复合菌剂虽能提高除臭效率，但除臭成本也随之提高。因此，筛选单一且具有短时高效的除臭菌剂，在控制低成本的同时能够达到复合菌剂的效果，这一点具有重要意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种植物乳杆菌SD36。

本发明的第二目的在于提供植物乳杆菌的应用。

本发明的第三目的在于提供一种禽畜粪便除臭剂及其制备方法。

本发明的第四目的在于提供一种禽畜粪便除臭方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种植物乳杆菌SD36，保藏编号为CGMCC No.22004。

植物乳杆菌SD36在禽畜粪便除臭中的应用。

进一步地，除臭包括去除H₂S和/或NH₃。

进一步地，所述禽畜粪便为牛粪。

植物乳杆菌SD36在抑制单核细胞增生李斯特氏菌，粪肠球菌，大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，痢疾志贺氏菌，金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌至少一种中的应用。

一种禽畜粪便除臭剂，包括植物乳杆菌SD36。

进一步地，所述禽畜粪便除臭剂为植物乳杆菌SD36的发酵上清液；

优选地，禽畜粪便除臭剂的pH为3.5-3.7。

禽畜粪便除臭剂的制备方法，利用MRS培养基培养植物乳杆菌SD36至对数期并且发酵液pH为3.5-3.7后，得到禽畜粪便除臭剂。

进一步地，MRS培养基包括胰蛋白胨9-11g、酵母浸粉4-6g、葡萄糖18-22g、无水乙酸钠4-6g、MgSO₄ 0.4-0.6g、牛肉膏9-11g、K₂HPO₄ 1-3g、吐温80 0.8-1.2mL、硫酸锰0.2-0.3g和柠檬酸铵1-3g，pH 6.7-6.9；

优选地，培养结束后去除植物乳杆菌SD36，得到禽畜粪便除臭剂。

一种禽畜粪便除臭方法，将本发明的禽畜粪便除臭剂与禽畜粪便按照(0.8-1.2mL)：1g混匀处理。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的植物乳杆菌SD36由发明人首次从天然发酵泡菜中分离得到，该菌株的发酵液可以实现禽畜粪便中H₂S和NH₃的有效去除，具体地，1小时内能够降低73％，6小时能够降低90％的NH₃含量。同时，对于部分革兰氏阳性菌(单核细胞增生李斯特氏菌，粪肠球菌，)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，痢疾志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌)均有一定的抑制作用，且对鼠伤寒沙门氏菌和单增生李斯特菌的抑菌效果尤为显著。植物乳杆菌SD36在吸收转化已有NH₃的同时，可以抑制禽畜粪便中尿素分解产生NH₃的途径，两方面同时进行，实现对禽畜粪便中的NH₃起到有效的去除和抑制作用。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

本发明提供的植物乳杆菌SD36，于2021年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.22004，拉丁名为Lactobacillus plantarum。

该菌株发酵液可以实现禽畜粪便中H₂S和NH₃的有效去除，具体地，1小时内能够降低73％，6小时能够降低90％的NH₃含量。同时，对于部分革兰氏阳性菌(单核细胞增生李斯特氏菌，粪肠球菌，)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，痢疾志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌)均有一定的抑制作用，且对鼠伤寒沙门氏菌和单增生李斯特菌的抑菌效果尤为显著，可以实现禽畜粪便中有害微生物生长的抑制。植物乳杆菌SD36在吸收转化已有NH₃的同时，可以抑制禽畜粪便中尿素分解产生NH₃的途径，两方面同时进行，实现对禽畜粪便中的NH₃起到有效的去除和抑制作用。

本发明提供的植物乳杆菌SD36是一款可应用于畜禽养殖厂内的可高效除臭、价格低廉、对环境无二次污染，同时还可以抑制粪便中有害微生物生长的单一微生物除臭菌剂，为解决畜禽养殖业恶臭气体污染问题提供科学的依据以及解决方法。

在一些实施方式中，禽畜粪便为牛粪。

本发明提供一种禽畜粪便除臭剂，其有效菌种包括植物乳杆菌SD36，也可以仅为植物乳杆菌SD36，具体为植物乳杆菌SD36发酵液或其发酵上清液，除臭剂优选为植物乳杆菌SD36的发酵上清液，pH优选为3.5-3.7。

将本发明提供的植物乳杆菌SD36在MRS培养基中培养发酵，至对数期并且发酵液pH为3.5-3.7后，得到禽畜粪便除臭剂。

在一些实施方式中，MRS培养基包括胰蛋白胨9-11g、酵母浸粉4-6g、葡萄糖18-22g、无水乙酸钠4-6g、MgSO₄ 0.4-0.6g、牛肉膏9-11g、K₂HPO₄1-3g、吐温80 0.8-1.2mL、硫酸锰0.2-0.3g和柠檬酸铵1-3g，pH 6.7-6.9。

在优选地实施方式中，培养结束后去除植物乳杆菌SD36，得到的发酵上清液即为禽畜粪便除臭剂。

在禽畜粪便除臭过程中，将本发明提供的禽畜粪便除臭剂与禽畜粪便按照(0.8-1.2mL)：1g混匀处理即可。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实验牛粪采自北京农业机械化科学研究院奶牛养殖场，且养殖奶牛均未使用抗生素。

枯草芽孢杆菌C3、绿色木霉DK1、里氏木霉XH1、克鲁维酵母M3、罗伊氏乳杆菌GS23、植物乳杆菌YWA24、植物乳杆菌YWA21均来自实验室菌库，植物乳杆菌SD36分离自四川大凉山农家泡菜。

MRS培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖20g，无水乙酸钠5g，MgSO₄0.5g，牛肉膏10g，K₂HPO₄ 2g，吐温80 1mL，硫酸锰0.25g，柠檬酸铵2g，pH 6.8(固体培养基加入琼脂15-20g)。

LB培养基配方：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH 7.0(固体培养基加入琼脂15-20g)。

PDA培养基配方：马铃薯浸粉5g，葡萄糖15g，蛋白胨10g，氯化钠15g(固体培养基加入琼脂15-20g)。

BPY培养基配方：蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，氯化钠5g，酵母浸粉5g，葡萄糖5g，琼脂12g，pH值7.0。

营养琼脂配方：蛋白胨10g、牛肉膏粉3g、氯化钠5g、琼脂15g，pH值7.0±0.2。

所用的菌株及培养条件如下表1所示。所有菌株培养后均处于对数生长期，8000rpm离心5分钟，收集发酵上清液备用。

表1

实施例1植物乳杆菌SD36的筛选

称取5g取样自四川大凉山农家自然发酵泡菜样品放入无菌均质袋中，加入45mL无菌生理盐水拍打混匀后，梯度稀释，分别吸取稀释倍数为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的样品100μL，涂布于含2.5％CaCO₃的MRS和M17平板上，37℃培养24h。挑取长势良好，溶钙圈明显的菌落，通过平板划线分离法反复分离纯化，编号-80℃甘油保藏。

根据细菌基因组DNA提取试剂盒说明操作提取菌株基因组DNA，以基因组DNA为模版进行16S r RNA基因的PCR扩增。扩增引物使用通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，SEQ ID NO.1和1492R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'，SEQ ID NO.2。其中PCR反应体系：DNA 1μL，27F 1μL，1492R 1μL，Premix Ex Taq 12.5μL，ddH₂O9.5μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，34次循环；最后72℃延伸5min。将提取的基因组和PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析检测后，将PCR产物进行DNA测序(上海生工生物工程有限公司)。测序序列结果在NCBI数据库中用Blast软件搜索近似序列。

从天然发酵泡菜中分离得到一株乳酸菌，经革兰氏染色观察染色结果为紫色，呈阳性，其细胞形状为杆状，为乳杆菌。进一步的16s rDNA序列测序结果表明，其16s rDNA序列(SEQ ID NO.3)与植物乳杆菌的同源性高达99％。因此，将其命名为植物乳杆菌SD36。并提交中国微生物菌种保藏中心专利保藏(保藏号：CGMCC 22004)。

TGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGACAGAGTTT(SEQ ID NO.3)。

实施例2不同微生物发酵上清液对牛粪H₂S的影响

准确称取2kg新鲜牛粪，装入容积为15L的整理箱内。处理组将植物乳杆菌SD36、枯草芽孢杆菌C3、克鲁维酵母M3、里氏木霉XH1、绿色木霉DK1的发酵上清培养液按10％的接种量(即200mL菌体)分别均匀喷洒于新鲜的牛粪表面，多次搅拌使新鲜牛粪与发酵上清液充分混合，达到固液混匀状态，对照组以等量的MRS液体培养基作为阴性对照。H₂S的测定于每间隔1h时处进行。H₂S测定使用PNT400便携式气体检测报警器。结果如下表2所示。H₂S并不是牛粪中主要的有害气体，含量均不超过2ppm。从微生物发酵上清液对H₂S降低效果来看，植物乳杆菌SD36和里氏木霉的去除效果较好，其他三种微生物发酵上清液效果不明显。

表2 H₂S含量检测结果(单位：ppm)

时间	SD36	C3	M3	XH1	DK1	阴性对照
							0h	1.15	1.25	1.36	1.28	1.35	1.27
1h	0.96	2.78	1.05	0.77	0.83	1.22
							2h	0.66	2.98	1.12	0.66	0.85	1.31
3h	0.49	2.14	0.91	0.59	0.65	1.05
							4h	0.42	1.25	0.92	0.52	0.68	0.85
5h	0.34	0.69	0.68	0.45	0.59	0.63
							6h	0.32	0.65	0.62	0.39	0.48	0.54

实施例3不同微生物发酵上清液去除NH₃的作用效果

准确称取2g新鲜牛粪，装入容积为50mL的尖底离心管，处理组将植物乳杆菌SD36、枯草芽孢杆菌C3、克鲁维酵母M3、里氏木霉XH1、绿色木霉DK1的发酵上清培养液按100％的接种量(即2mL菌体)分别均匀喷洒于新鲜的牛粪表面，多次搅拌使新鲜牛粪与发酵上清液充分混合，达到固液混匀状态，对照组以等量的MRS液体培养基作为阴性对照。NH₃的测定于每间隔1h时处进行。NH₃测定使用PNT400便携式气体检测报警器。结果如下表3所示。NH₃为牛粪中最主要的有害气体成分，五种微生物发酵上清液均能显著降低牛粪中NH₃含量，其中植物乳杆菌SD36发酵上清液效果最好，而且见效时间短，1小时内能够降低73％，6小时能够降低90％的NH₃含量。

表3 NH₃含量检测结果(单位：ppm)

时间

SD36

C3

M3

XH1

DK1

阴性对照

0h

19.24±1.2

19.58±1.48

20.57±1.52

18.76±1.56

21.54±1.67

20.69±1.62

1h

3.94±0.22

17.51±1.42

14.97±1.39

12.02±1.32

19.53±1.58

18.88±1.54

2h

3.47±0.32

15.91±1.37

12.47±1.05

14.22±1.39

16.39±1.49

18.55±1.67

3h

2.35±0.24

13.44±1.29

11.62±1.01

11.56±1.15

13.27±1.30

15.63±1.31

4h

2.26±0.15

12.58±1.03

12.32±1.13

11.39±1.13

13.15±1.27

16.27±1.37

5h

1.99±0.09

10.42±0.97

11.79±1.09

9.81±0.82

12.16±1.12

16.37±1.42

6h

2.04±0.04

10.77±1.02

10.84±0.92

10.04±0.9

11.35±1.03

18.13±1.58

实施例4不同乳酸菌发酵上清液去除NH3的作用效果

准确称取4g新鲜牛粪，装入容积为50mL的尖底离心管，处理组将植物乳杆菌SD36、罗伊氏乳杆菌GS23、植物乳杆菌-YWA24、植物乳杆菌-YWA21发酵培养上清液按100％的接种量(即4mL菌体)分别均匀喷洒于新鲜的牛粪表面，多次搅拌使新鲜牛粪与发酵上清液充分混合，达到固液混匀状态，对照组以等量的MRS液体培养基作为阴性对照。NH₃的测定于每间隔1h时处进行。NH₃测定使用PNT400便携式气体检测报警器。结果如表4所示。不同乳酸菌对NH₃的去除效果不同。随着乳酸菌发酵上清液pH的升高，NH₃的去除效果呈现逐渐减弱的趋势，6h的去除率由96％下降至86％，证明NH₃的去除效果与发酵上清液的酸性有关，酸性越低，去除效果越显著。

表4 NH₃含量检测结果(单位：ppm)

实施例5排除MRS培养基的酸性对NH₃去除影响的测定结果

准确称取2g新鲜牛粪，装入容积为50mL的尖底离心管，将植物乳杆菌SD36发酵培养上清液按照100％浓度的接种量均匀喷洒于新鲜的牛粪表面，多次搅拌使新鲜牛粪与发酵上清液充分混合，达到固液混匀状态，对照组以pH调为6.8的MRS培养基。NH₃的测定于每间隔1h时处进行。NH3测定使用PNT400便携式气体检测报警器。结果如表5所示。pH调为6.8的阴性对照组去除NH₃的效果较植物乳杆菌SD36发酵液组差异显著。证明pH调为6.8的阴性对照组并不会对NH₃含量的下降起显著作用，起主导作用的可确定为植物乳杆菌SD36发酵液中的物质。

表5 NH₃含量检测结果(单位：ppm)

实施例6不同浓度植物乳杆菌SD36发酵上清液去除NH₃的作用效果

准确称取2g新鲜牛粪，装入容积为50mL的尖底离心管，将植物乳杆菌SD36发酵培养上清液按10％(0.2mL发酵上清液+1.8mL水)、30％(0.6mL发酵上清液+1.4mL水)、50％(1mL发酵上清液+1mL水)、80％(1.6mL发酵上清液+0.4mL水)和100％(2mL发酵上清液)浓度的接种量均匀喷洒于新鲜的牛粪表面，后多次搅拌混合均匀，再将2mL的pH为6.8的MRS培养基均匀喷洒于新鲜牛粪表面，多次搅拌使新鲜牛粪与发酵液充分混合，达到固液混匀状态，对照组以等量的MRS液体培养基作为阴性对照。NH₃的测定于每间隔1h时处进行。NH₃测定使用PNT400便携式气体检测报警器。结果如表6所示。不同浓度的植物乳杆菌发酵上清液均能有效去除牛粪挥发的NH₃含量，随着浓度的升高，对NH₃的去除量呈现逐渐上升态势，其中100％浓度的在1小时内能够去除90％以上的NH₃。证明发酵液浓度越高，NH₃的去除效果越好。

表6 NH₃含量检测结果(单位：ppm)

时间

10％

30％

50％

80％

100％

阴性对照

0h

38.14±1.57

36.25±1.49

37.46±1.58

44.34±1.98

36.75±1.82

34.43±1.76

1h

17.72±1.43

6.41±1.25

4.57±0.93

2.84±0.44

2.12±0.47

19.24±1.42

2h

9.14±1.41

5.45±1.17

3.29±0.91

1.97±0.42

1.27±0.33

19.04±1,47

3h

9.78±1.53

6.16±1.35

3.61±0.84

1.54±0.45

1.25±0.35

15.82±1.51

4h

9.07±1.37

7.14±1.32

3.91±0.79

2.09±0.37

1.27±0.32

11.42±1.42

5h

9.81±1.33

7.54±1.29

3.81±0.62

2.43±0.40

1.05±0.29

10.61±1.39

6h

8.73±1.26

9.27±1.47

5.31±0.64

2.85±0.36

1.10±0.21

12.55±1.32

实施例7植物乳杆菌SD36发酵培养时间对去除NH₃的作用效果

在MRS培养基中接入接种量为1％的植物乳杆菌SD36，于37℃分别培养12，16，20，24小时，8000rpm离心5min，收集发酵液。准确称取4份各2g新鲜牛粪，分别装入4个容积为50mL的尖底离心管，将不同培养时间的植物乳杆菌SD36发酵培养上清液按100％的接种量(即2mL菌体)均匀喷洒于新鲜的牛粪表面后多次搅拌混合均匀，对照组以等量MRS培养基作为空白对照，1h后使用PNT400便携式气体检测仪对离心管中NH₃含量进行测定。结果如表7所示。随着培养时间的增加，发酵上清液对牛粪中NH₃的去除率逐渐升高，当培养时间达到20h和24h时NH₃去除率分别达到94.4％和94.6％。综合考虑时间因素，选用培养20h的发酵上清液。

表7不同培养时间对去除NH₃的作用结果

培养时间(h)	NH<sub>3</sub>去除率(％)
		12	62.7±0.90
16	86.2±1.22
		20	94.4±0.45
24	94.6±0.36

实施例8植物乳杆菌SD36发酵上清液对粪便中病原微生物的抑菌作用

使用表1中相应指示菌的培养条件和培养基对指示菌进行活化，并接种于相应的固体培养基上使指示菌终浓度约为10⁴cfu/mL，制作成为指示菌平板。

将发酵20h的植物乳杆菌SD36发酵上清液采用管碟法在含有不同指示菌的固体平板上做抑菌试验，根据抑菌圈的大小确定植物乳杆菌SD36发酵上清液对各种病原微生物的抑菌作用。结果如表8所示。植物乳杆菌SD36发酵上清液对部分革兰氏阳性菌(单核细胞增生李斯特氏菌，粪肠球菌，)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，痢疾志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌)均有一定的抑制作用。其中对鼠伤寒沙门氏菌和单增生李斯特菌的抑菌效果尤为显著。

表8植物乳杆菌SD36发酵上清液对部分病原微生物的抑菌作用

菌株及编号	抑菌圈大小
		大肠杆菌ATCC 43888	+
大肠埃希氏菌CMCC 44110	+
		鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028	+++
金黄色葡萄球菌CMCC 26001	++
		单增李斯特菌CMCC 54003	+++
痢疾志贺氏菌CMCC 51105	++
		粪肠球菌ATCC 29212	+

实施例9 pH值对植物乳杆菌SD36发酵上清液除NH₃作用的影响

准确称取2g新鲜牛粪，装入容积为50mL的尖底离心管，处理组①将植物乳杆菌SD36发酵上清液按100％的接种量(即2mL菌体)均匀喷洒于新鲜牛粪表面，多次搅拌使新鲜牛粪与发酵液充分混合，达到固液混匀状态，处理组②重复实验组①的步骤但将植物乳杆菌SD36发酵上清液pH调为6.8，对照组以等量pH为6.8的MRS培养基作为阴性对照。NH₃的测定于每间隔1h时处进行。NH₃测定使用PNT400便携式气体检测报警器。结果如表9所示。pH6.8植物乳杆菌发酵上清液组与pH6.8的阴性对照组NH₃含量下降速率大体一致，未调pH植物乳杆菌发酵上清液组下降速率明显高于pH6.8植物乳杆菌发酵上清液组，证明是植物乳杆菌发酵上清液中酸的作用导致氨气浓度下降。

表9 NH₃含量检测结果(单位：ppm)

时间	SD36(pH3.62)	SD36(pH6.8)	阴性对照(pH 6.8)
				0h	18.16±1.18	25.49±1.49	26.62±1.58
1h	4.10±0.32	9.73±1.10	6.49±1.42
				2h	2.99±0.38	11.03±1.17	10.27±1.55
3h	2.99±0.32	13.73±1.24	12.26±1.49
				4h	2.31±0.29	12.58±1.28	13.44±1.50
5h	1.20±0.38	12.14±1.31	13.42±1.57

实施例10对已产生NH₃去除作用研究

准确称取70g新鲜牛粪，装入容积为50mL的塑料烧杯，封口膜将其密封，在封口膜出剪出50mL尖底离心管口径大小的开口，将50mL离心管扣在开口处用以收集牛粪挥发出的气体，静置24h后取下离心管并密封。24h后进行管内NH₃初始浓度的测定，测量后将4mLSD36发酵上清液接入50mL离心管内，再次密封离心管静置，分别于1h与4h后使用PNT400便携式气体检测仪测量离心管中NH₃浓度。同时，分别于1h与4h取SD36发酵液测定无机氮含量(方法参考Y/T 1116-2014)。结果如表10所示。植物乳杆菌SD36发酵上清液有效降低已经生成NH₃的浓度，1小时可降低95％，证明植物乳杆菌SD36发酵液可以有效去除已经生成的NH₃。

表10 NH3含量检测结果(单位：ppm)

时间	SD36
		0h	48.04±1.76
1h	2.80±0.30
		2h	2.24±0.26

向收集氨气容器中加入植物乳杆菌SD36发酵上清液的组别中，硝态氮、铵态氮均显著高于阴性对照组，证明植物乳杆菌发酵液可有效吸收NH3，并转化为无机氮。结果如表11所示。

表11发酵液中无机氮含量检测结果(单位：％)

指标	SD36	阴性对照	空白
				硝态氮	0.678±0.03	0.305±0.03	0.1±0.01
铵态氮	0.223±0.02	0.092±0.01	0.021±0.01

实施例11产NH₃抑制作用的研究

准确称取3份各4g新鲜牛粪，分别装入3个容积为50mL的尖底离心管，氮吹机吹净管中氨气，处理组将植物乳杆菌SD36发酵上清液按100％的接种量(即4mL菌体)均匀喷洒于新鲜牛粪表面，多次搅拌使新鲜牛粪与发酵液充分混合，达到固液混匀状态，对照组以等量MRS培养基作为阴性对照，分别静置1h、6h后取出固液混合物，检测混合物中脲酶活性及尿素含量。

脲酶活性测定选用脲酶(UE)活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

尿素含量测定选用尿素氮(BUN)检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

结果如表12和13所示。随着植物乳杆菌SD36发酵上清液与MRS液体培养基的加入，1h与6h两个时间点的脲酶活性均有下降，加入植物乳杆菌SD36发酵上清液组脲酶活性下降效果显著，显著低于MRS组。证明植物乳杆菌SD36发酵上清液可有效抑制粪便样品中脲酶活性。

随着植物乳杆菌SD36发酵上清液与MRS液体培养基的加入，1h与6h两个时间点样品中尿素氮含量均有下降，植物乳杆菌SD36发酵上清液组中尿素氮含量显著高于MRS液体培养基组，证明植物乳杆菌SD36发酵上清液能够有效抑制底物尿素的进一步反应。

表12脲酶含量检测结果(单位：U/mL)

时间	SD36	阴性对照
			0h	2.367±0.47	2.192±0.41
1h	0.529±0.03	1.345±0.17
			6h	0.521±0.03	1.546±0.21

表13尿素氮含量检测结果(单位：μg/g)

时间	SD36	阴性对照
			0h	2.917±0.48	2.162±0.52
1h	1.587±0.37	0.566±0.05
			6h	1.468±0.22	0.629±0.05

由于粪便样品中氨气的生成途径是由脲酶催化尿素产生氨气，因此，加入植物乳杆菌SD36发酵上清液组的粪便样品中脲酶活性受到显著抑制，从而抑制了粪便样品中尿素分解产生NH₃，导致植物乳杆菌发酵上清液组尿素氮显著高于对照组。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京农学院

<120> 植物乳杆菌SD36及其禽畜粪便除臭的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tacggctacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1452

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌SD36 16s rDNA

<400> 3

tgcaagtcga acgaactctg gtattgattg gtgcttgcat catgatttac atttgagtga 60

gtggcgaact ggtgagtaac acgtgggaaa cctgcccaga agcgggggat aacacctgga 120

aacagatgct aataccgcat aacaacttgg accgcatggt ccgagcttga aagatggctt 180

cggctatcac ttttggatgg tcccgcggcg tattagctag atggtggggt aacggctcac 240

catggcaatg atacgtagcc gacctgagag ggtaatcggc cacattggga ctgagacacg 300

gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacga aagtctgatg 360

gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa aactctgttg ttaaagaaga 420

acatatctga gagtaactgt tcaggtattg acggtattta accagaaagc cacggctaac 480

tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt 540

aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cttcggctca accgaagaag 600

tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg 660

tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact 720

gacgctgagg ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccatacc 780

gtaaacgatg aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gctaacgcat 840

taagcattcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900

ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagctac gcgaagaacc ttaccaggtc 960

ttgacatact atgcaaatct aagagattag acgttccctt cggggacatg gatacaggtg 1020

gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080

acccttatta tcagttgcca gcattaagtt gggcactctg gtgagactgc cggtgacaaa 1140

ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200

tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga actcgcgaga gtaagctaat ctcttaaagc 1260

cattctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat 1320

cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380

catgagagtt tgtaacaccc aaagtcggtg gggtaacctt ttaggaacca gccgcctaag 1440

gtgacagagt tt 1452

Claims

1.一种植物乳杆菌SD36，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.22004。

2.权利要求1所述的植物乳杆菌SD36在禽畜粪便除臭中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，除臭是去除H₂S和/或NH₃。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述禽畜粪便为牛粪。

5.权利要求1所述的植物乳杆菌SD36在抑制单核细胞增生李斯特氏菌，粪肠球菌，大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，痢疾志贺氏菌，金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌至少一种中的应用。

6.一种禽畜粪便除臭剂，其特征在于，包括权利要求1所述的植物乳杆菌SD36。

7.根据权利要求6所述的禽畜粪便除臭剂，其特征在于，所述禽畜粪便除臭剂为植物乳杆菌SD36的发酵上清液；

禽畜粪便除臭剂的pH为3.5-3.7。

8.权利要求6或7所述的禽畜粪便除臭剂的制备方法，其特征在于，利用MRS培养基培养植物乳杆菌SD36至对数期并且发酵液pH为3.5-3.7后，得到禽畜粪便除臭剂。

9.权利要求7所述的禽畜粪便除臭剂的制备方法，其特征在于，MRS培养基包括胰蛋白胨9-11g、酵母浸粉4-6g、葡萄糖18-22g、无水乙酸钠4-6g、MgSO₄ 0.4-0.6g、牛肉膏9-11g、K₂HPO₄ 1-3g、吐温80 0.8-1.2mL、硫酸锰0.2-0.3g和柠檬酸铵1-3g，pH 6.7-6.9；

培养结束后去除植物乳杆菌SD36，得到禽畜粪便除臭剂。

10.一种禽畜粪便除臭方法，其特征在于，将权利要求6或7所述的禽畜粪便除臭剂与禽畜粪便按照（0.8-1.2mL）：1g混匀处理。