CN111676150A - 一株高效除臭菌及其应用 - Google Patents

一株高效除臭菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高效除臭菌及其应用，属于生物工程和环境工程技术领域。所述高效除臭菌命名为HCSW‑2，经鉴定属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年08月14日，保藏编号为CGMCC No.18384。该高效除臭菌为革兰氏阴性菌，兼性厌氧，生长温度范围10‑42℃，菌体长度为1.5‑5.0μm，宽度为0.5‑1μm，呈球杆状或线状，菌体一端有单鞭毛，无芽孢。将菌株HCSW‑2进行活化培养后，具有优异的除臭效能，可用于畜禽粪便、剩余污泥、垃圾等固体废物在填埋或堆肥处理过程中强化生物除臭。

Description

一株高效除臭菌及其应用
技术领域
本发明属于生物工程和环境工程技术领域，更具体地说，涉及一株高效除臭菌及其应用。
背景技术
恶臭气体包括含硫化合物、含氮化合物、卤素及其衍生物、烃类、含氧有机物，是一类危害严重的环境污染物，除了影响人们观感和环境体验，还直接危害人体健康。恶臭会对呼吸系统、神经系统、循环系统、内分泌系统产生强烈的刺激作用。恶臭污染来源广泛，涉及工业、农牧业生产、以及城市公共设施，如畜禽养殖业产生的畜禽粪便、以及污水处理设施产生的剩余污泥。随着城市化进程和社会的不断发展，恶臭成为困扰人民工作和生活的一个重要因素，严重影响人民的身心健康，破坏城市形象。
目前，禽畜粪便及剩余污泥的生物处理方法主要有生物堆肥法、厌氧产沼气法、人工湿地法。生物堆肥法是目前应用最广泛的方法，成本较低，而且可以实现粪污的再利用，但是堆肥过程中也会产生多种恶臭性气体。生物除臭法是上世纪50年代发展起来的一种治理恶臭污染的方法，该方法是利用微生物的生理代谢活动来降解恶臭物质使之转化为无臭物质，具有处理效率高、无二次污染、便于操作、适应性广、针对性强、成本低等特点，己成为国内外恶臭防治研究与应用中的主要方法。但也仍存在着微生物活性及适应性低、微生物载体填料制备改性成本较高等缺陷，因而不能大规模应用。
微生物除臭技术关键在于高效除臭微生物的筛选，并研究其生物特性与除臭效果，为新型微生物除臭菌剂的制备奠定基础。因此，通过研发高效的微生物除臭菌剂，开发适用于畜禽养殖、城市垃圾填埋场等主要污染源的针对性恶臭气体治理技术，推广应用到更广泛的工农业生产、城市公共生活中，对于改善目前的由恶臭气体导致的环境问题具有重要的实际意义。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一株高效除臭菌。本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述的高效除臭菌的应用。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一株高效除臭菌Lactobacillus plantarum HCSW-2，所述的高效除臭菌Lactobacillus plantarum HCSW-2即植物乳杆菌HCSW-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18384，保藏日期为2019年08月14日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述的高效除臭菌Lactobacillus plantarum HCSW-2为革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧，接触酶阳性，氧化酶阴性，在pH 5.0-11.0、10-42℃条件下生长，最适生长温度为25-30℃。菌体长度为1.5-5.0μm，宽度为0.5-1μm，呈球杆状或线状，成对或短链状排列，菌体一端有单鞭毛，无芽孢；HCSW-2杆菌在固体培养基上生长为圆形乳白色半透明菌落，表面光滑，边缘整齐有隆起，能以多种有机物为碳源。
所述的高效除臭菌Lactobacillus plantarum HCSW-2在固体废物处理过程中除臭的应用。
进一步地，所述的固体废物为禽畜粪便。
进一步地，所述的禽畜粪便是猪粪。
进一步地，所述的应用的具体方法为：制备所述的高效除臭菌Lactobacillusplantarum HCSW-2的菌液，将其加在猪粪中。
进一步地，制备所述的高效除臭菌Lactobacillus plantarum HCSW-2的菌液，按体积重量比10％，将其加在猪粪中，所述菌液的含菌量为3×109/mL以上。
进一步地，制备所述的高效除臭菌的菌液的方法为：将所述的高效除臭菌Lactobacillus plantarum HCSW-2接种在液体培养基中，30℃、160r/min条件下培养。液体培养基配方为：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，吐温801.0mL/L，乙酸钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.25g/L，pH调至6.2-6.6。
进一步地，所述的除臭是去除含硫化合物或含氮化合物。
进一步地，所述的含硫化合物是H2S。
进一步地，所述的含氮化合物是NH3。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供的菌株Lactobacillus plantarum HCSW-2具有极强的除臭效能，将菌株Lactobacillus plantarum HCSW-2投入猪粪除臭试验中，经检测，其对氨气及H2S的去除率分别可达91.43％和94.55％。
附图说明
图1为菌株Lactobacillus plantarum HCSW-2的生长曲线图；
图2为菌株Lactobacillus plantarum HCSW-2的NH3去除效能结果图；
图3为菌株Lactobacillus plantarum HCSW-2的H2S去除效能结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1：除臭菌的筛选及生理生化鉴定
(1)菌株来源
本发明所用菌源来源于垃圾填埋场中的固体废物。
(2)菌株的分离
取某垃圾填埋场中固体废物10g，放入到含有灭菌玻璃珠和100mL生理盐水的三角瓶中，于30℃，160r/min震荡2h，静置20min，取上清液1mL，用灭菌生理水稀释成浓度10-1悬液，连续作10倍梯度稀释，吸取不同稀释度悬液 200μL，涂布在培养基上，30℃培养28-72h，观察菌株的生长情况，挑取单菌落进行培养。根据菌株形态及生长情况，挑取形态各异的菌株进行划线培养并低温保存。
培养基配方如下：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，吐温801.0mL/L，乙酸钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.25g/L，pH调至6.2-6.6。固体培养基需另加入1.8-2.0％的琼脂粉。培养基于112℃条件下灭菌40min，冷却至室温后使用。
(3)菌株的初筛
将100g新鲜猪粪加入到250mL带塞的锥形瓶中，按照体积重量比10％，即100g新鲜猪粪加入10mL菌液(菌液由上述培养基培养得到，菌液的含菌量要求3×109/mL以上)，接种分离到的菌株，于30℃恒温箱中培养10天，采用感官法评定臭味等级。
感官法测定恶臭等级，采用6级法划分气体臭度，见下表1：
表1臭味感官检测等级
级别 意义 符号
0 无臭味 -
1 勉强感觉到臭味 +
2 微弱臭味 ++
3 臭味明显 +++
4 臭味强烈 ++++
5 臭味难以忍受 +++++
初筛共获得38株除臭等级为“++”以上的菌株，将这些菌株进行培养，制成种子悬液，用于后续复筛。
(4)菌株的复筛
以氨气和硫化氢气体的去除率为指标进行菌株的复筛。
以10％的比例将制备的新鲜菌液喷洒到含100g新鲜粪便的塑料袋中，充分混匀。以喷洒相同积的无菌水为空白对照。每个塑料袋中放置1个装有适量硼酸吸收液的小烧杯，以及一个装有适量碱性锌氨络盐溶液的小烧杯，分别用来吸收产生的氨气和硫化氢。封口密闭，30℃静置发酵3天。分别检测发酵粪便中氨气和硫化氢的释放量。以甲基红-亚甲蓝为指示剂，采用硼酸吸收凯氏定氮法测定氨气释放量。采用锌铵络盐比色法测定硫化氢释放量。计算并比较氨气和硫化氢气体的去除率，选择其中去除氨气和硫化氢气体综合效能最好的菌株命名为 HCSW-2，其氨氮去除率比同类菌种高13.2％，其硫化氢去除率比其他菌种高8.5％。
(5)生理生化鉴定
通过对菌株HCSW-2进行一系列的生理生化实验，结果表明菌株HCSW-2 为革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧，接触酶阳性，氧化酶阴性，在pH5.0-11.0、10-42 ℃条件下生长，最适生长温度为25-30℃。菌体长度为1.5-5.0μm，宽度为0.5-1μm，呈球杆状或线状，成对或短链状排列，菌体一端有单鞭毛，无芽孢；HCSW-2杆菌在固体培养基上生长为圆形乳白色半透明菌落，表面光滑，边缘整齐有隆起，能以多种有机物为碳源。
实施例2：菌株HCSW-2的种属鉴定
通过扩增该菌株的16S rDNA，得到了长度为1527bp的16S rDNA序列，如SEQ IDNO.1所示。PCR引物采用细菌通用引物7F 5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′和1540R5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。用PCR仪进行扩增反应。
PCR反应体系(25μL)：2.5μL 10×PCR Buffer，1μL dNTPs(浓度为2.5 mmol/L)，2种引物各0.5μL，0.5μL DNA模板，0.5μL rTaq DNA聚合酶(5U/μL)，加双蒸水至25μL。
PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测。通过程序进行同源性比较，结果表明该菌株与植物乳杆菌Lactobacillus plantarum的相似性为99％，说明HCSW-2属于Lactobacillus plantarum。
实施例3：Lactobacillus plantarum HCSW-2休眠细胞的制备
制备菌株Lactobacillus plantarum HCSW-2的休眠细胞：将以实施例1中的培养基培养好的菌株Lactobacillus plantarum HCSW-2于8000r/min，4℃下离心 10min，用磷酸缓冲液洗涤3次，用同样的缓冲液重悬该沉淀，使得休眠细胞浓度为10mg/L，于4℃冻存，即制得菌株Lactobacillus plantarum HCSW-2的休眠细胞，备用，6个月内活化的方法是采用实施例1的培养基，在36摄氏度下培养36小时。
实施例4：Lactobacillus plantarum HCSW-2生长曲线测定
按照测定细菌生长曲线的标准方法对以实施例1中的培养基培养的菌株Lactobacillus plantarum HCSW-2的生长曲线进行测定，每隔8h取培养液，采用光电比浊法，在600nm波长处测定菌液OD600(Optical Density)，获得菌株 Lactobacillusplantarum HCSW-2生长曲线如图1所示。从图1中可以看出，在 0-8h时，菌株HCSW-2处于生长阶段的延迟期，其生长速度缓慢，OD600无明显变化；当8-40h时，菌株HCSW-2进入对数生长期，其生长速度达到最大， OD600显著上升；在40h以后开始进入菌株生长的稳定期及衰亡期，稳定期后期 OD600达到最大值1.521，随后以微小差距逐渐下降，但其生长状态基本维持动态平衡。
实施例5：菌株Lactobacillus plantarum HCSW-2除臭效能测定
将菌株Lactobacillus plantarum HCSW-2按照实施例1中复筛的方法进行培养，在培养的过程中，每8h检测氨气和硫化氢浓度。结果如图2和图3所示。
从图2中对照组数据能够看出，新鲜粪便所释放的NH3的浓度逐渐升高，而实验组中所释放的NH3却很低，说明菌株Lactobacillus plantarum HCSW-2对 NH3的去除效能较高，前48h，NH3的去除率一直维持在90％以上，说明菌株 Lactobacillus plantarum HCSW-2在短时间内就能达到较高的NH3去除率且维持时间也较长，在32h时除臭率最高达到91.43％。32h以后菌株Lactobacillus plantarum HCSW-2对NH3的去除效能开始下降，但依然维持在85％以上。
从图3中对照组数据能够看出，新鲜粪便所释放的H2S的浓度逐渐升高，而实验组中所释放的H2S却很低，说明菌株Lactobacillus plantarum HCSW-2对 H2S的去除效能较高，在整个试验过程中，H2S的去除率一直维持在90％以上，说明菌株Lactobacillusplantarum HCSW-2对H2S的去除能力能够维持较长时间，在16h时H2S去除率最高达到94.55％。
感官检测以上实验组，发现氨味与臭味明显减少，近闻有发酵的酸香味。
序列表
<110> 扬州市海诚生物技术有限公司
<120> 一株高效除臭菌及其应用
<130> 100
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1527
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌 HCSW-2(Lactobacillus plantarum HCSW-2)
<400> 1
agtttgatcc tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgaacga 60
actctggtat tgattggtgc ttgcatcatg atttacattt gagtgagtgg cgaactggtg 120
agtaacacgt gggaaacctg cccagaagcg ggggataaca cctggaaaca gatgctaata 180
ccgcataaca acttggaccg catggtccga gcttgaaaga tggcttcggc tatcactttt 240
ggatggtccc gcggcgtatt agctagatgg tggggtaacg gctcaccatg gcaatgatac 300
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cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg 600
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acacccaaag tcggtggggt aaccttttag gaaccagccg cctaaggtgg gacagatgat 1500
tagggtgaag tcgtaacaag gtagccg 1527

Claims (10)

1.一株高效除臭菌Lactobacillus plantarum HCSW-2，其特征在于，所述的高效除臭菌Lactobacillusplantarum HCSW-2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18384，保藏日期为2019年08月14日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的高效除臭菌Lactobacillus plantarum HCSW-2在固体废物处理过程中除臭的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的固体废物为禽畜粪便。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的禽畜粪便是猪粪。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用的具体方法为：制备所述的高效除臭菌Lactobacillus plantarum HCSW-2的菌液，将其加在猪粪中。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，制备所述的高效除臭菌Lactobacillusplantarum HCSW-2的菌液，按照体积重量比10％，将其加在猪粪中，所述菌液的含菌量为3×109/mL以上。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，制备所述的高效除臭菌Lactobacillusplantarum HCSW-2的菌液的方法为：将所述的高效除臭菌Lactobacillus plantarumHCSW-2接种在液体培养基中，在30℃、160r/min条件下培养。
8.根据权利要求2～7任一所述的应用，其特征在于，所述的除臭是去除含硫化合物或含氮化合物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的含硫化合物是H2S。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的含氮化合物是NH3。
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