CN114854616B - 一株高地芽孢杆菌kxy5及其应用 - Google Patents

一株高地芽孢杆菌kxy5及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及高地芽孢杆菌KXY5及其应用，可有效解决大量氨气挥发造成的环境污染问题，其解决的技术方案是，本发明所述的高地芽孢杆菌KXY5，其分类命名为高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis），已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.24274，保藏日期为2022年2月15日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该菌株的16S rDNA基因序列如SEQ ID No.1所示，本发明高地芽孢杆菌KXY5能够有效抑制畜禽粪污中氨气挥发，解决了畜禽粪污氨气环境污染问题，具有良好的应用及推广价值。

Description

一株高地芽孢杆菌KXY5及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是一株高地芽孢杆菌KXY5及其应用。
背景技术
近年畜禽粪污排放量在有机固废中所占比重逐年增加，远超工业固体废物，粪污中有机质种类含量丰富，大量的有机氮经氮循环途径形成氨氮，在碱性粪污环境中氨氮最终转化氨气排放在大气中引发水体富营养化、大气气溶胶、环境酸化以及温室气体等诸多问题，对生物健康与生态环境极具威胁。氨气极具刺激性，长期暴露在氨气环境中，会引起结膜发炎，更甚者会导致失明；还能破坏细胞膜结构，使组织蛋白变性，降低免疫力，从而导致畜禽进食与抗病能力明显降低，严重影响畜禽的健康与生产。
目前国内外通常采用物理、化学，生物等多种处理技术抑制畜禽粪污中氨气的挥发。物理和化学方法效果明显但不持久，处理成本高；而生物法却操作简单，成本低廉，无污染，在畜禽粪污抑氨挥发方面具有广泛的应用前景，是近年来研究热门之一。Gutarowska等从废弃物中筛选获得7株菌经混合固定在珍珠岩膨润土上进行除臭实验，72h对氨气去除率为20.8％。张磊等从沼液样品分离出一株阿氏节杆菌，5d对氨氮去除率达到70％以上，20d内氨气量减少70％。黄婧等从养殖污水中得到1株特瑞特西苍白杆菌，该菌株对养殖污水中氨氮的降解率为12.3％。张宏才等筛选的硝化细菌红平红球菌，在30℃、pH 7.0以及12％接种量条件下氨气降解率可达66.73％。目前，微生物处理畜禽粪污中氨氮的相关研究还存在很多不足，马石霞等人对微生物除臭剂在畜禽养殖场的研究现状中表明畜禽养殖场粪污减排过程中除臭微生物在实际应用中耗时相对较长，复杂环境中，耐受性不强的微生物对氨氮降解效果降低，余鹏举与王茄灵等人也综述了目前已开发的除臭微生物存在的局限性等问题，包括除臭菌种的开发在逆境性能差异大、受群体组成和环境影响性能稳定性下降以及市场部分除臭产品无效等。
因此进一步筛选开发高效优良的耐受菌种潜在资源对实现经济效益、遏制粪污臭气污染具有重要意义。本发明分离出一株高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，发现其能利用等多种有机碳源生长，在4.5g/L高浓度氨氮、25-42℃的中高温、0.1-6％盐度、以及pH7.5-9.5的复杂环境中具有良好的耐受性且有效降解氨氮，在畜禽粪污排放过程中可以抑制氨气挥发，从而解决大量氨气挥发造成的环境污染问题。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一株高地芽孢杆菌KXY5及其发酵液制备方法、其作为畜禽粪污臭气治理的用途，解决大量氨气挥发造成的环境污染问题。
本发明解决的技术方案是，本发明所述的高地芽孢杆菌KXY5，其分类命名为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.24274，保藏日期为2022年1月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该菌株的16S rDNA基因序列如SEQ ID No.1所示。
所述的高地芽孢杆菌KXY5或高地芽孢杆菌KXY5发酵液在制备降解氨氮制剂中的应用。
所述的高地芽孢杆菌KXY5发酵液制备方法为：将活化后的KXY5菌种接种至LB种子培养基中活化培养，在30℃、180r/min振荡培养2d后，将种子液以4％的接种量分别接种至驯化培养基中，30℃、180r/min条件下培养3d，连续传代培养3次，即得。
所述的驯化培养基组成为：C6H5Na3O7·2H2O 10g，(NH4)2SO4 1g，K2HPO4·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，FeSO4·7H2O 0.05g，NaCl 1g，加水定容至1L，pH7.5。
本发明提供的高地芽孢杆菌KXY5可用于畜禽粪污臭气治理，在实际应用中可将菌株或高地芽孢杆菌KXY5发酵液处理畜禽粪污降解氨氮，实现抑制氨气大量挥发改善环境的目的。
其所述的高地芽孢杆菌KXY5或高地芽孢杆菌KXY5发酵液降解氨氮的浓度范围为1-4.5g/L。
所述的高地芽孢杆菌KXY5或高地芽孢杆菌KXY5发酵液降解氨氮的pH范围为5.5-9.5，优选为6.5-8.5。
所述的高地芽孢杆菌KXY5或高地芽孢杆菌KXY5发酵液降解氨氮的温度范围为20-42℃，优选为30℃。
本发明高地芽孢杆菌KXY5能够有效抑制畜禽粪污中氨气挥发，高地芽孢杆菌KXY5降解氨氮的最佳条件为：pH 7.5、接种量4％、NaCl 0.1％、培养温度30℃、培养时间3d，氨氮降解率最高为83.68％，通过高浓度氨水定性筛选与硫酸铵连续驯化的方法开发了氨氮制剂及粪污除氨微生物菌种资源库，解决了畜禽粪污氨气环境污染问题，具有良好的应用及推广价值。
附图说明
图1为本发明的氨氮溶液标准曲线图。
图2为本发明高浓度氨水为氮源筛选菌株的氨氮降解情况图。
图3为本发明硫酸铵为氮源驯化菌株的氨氮降解情况图。
图4A为本发明菌株KXY5的菌落形貌；图4B革兰氏染色镜检图。
图5为本发明菌株KXY516S rDNA PCR凝胶电泳图。
图6为本发明菌株KXY5系统发育树图。
图7为本发明菌株KXY5的生长与氨氮降解动力学曲线图。
图8为本发明温度对菌株KXY5生长及氨氮降解率的影响图。
图9为本发明pH对菌株KXY5生长及氨氮降解率的影响图。
图10为本发明接种量对菌株KXY5生长及氨氮降解率的影响图。
图11为本发明钠盐对菌株KXY5生长及氨氮降解率的影响图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不用于限制本发明。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂家购买得到。
本发明高地芽孢杆菌KXY5是从郑州市中牟县某养猪场粪污下的土壤中，通过高浓度氨水定性筛选与硫酸铵连续驯化的方法分离筛选得到的新型高效氨氮降解菌株，对效果最优的菌株进行分类鉴定，同时对其生长、氨氮降解特性以及对猪粪、鸡粪粪污抑氨应用进行了试验。相关试验资料如下：
本发明采用的培养基
营养肉汤富集培养基：蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl 5g，加水定容至1L，自然pH；
高浓度氨筛选培养基：C6H5Na3O7·2H2O 5g，K2HPO4·3H2O 2g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.02g，CaCl2·2H2O 0.005g，微量元素液1mL，加水定容至1L，自然pH，待培养基分装灭菌后，每50mL氨筛选培养基于无菌环境中补加1mL25％-28％氨水，使初始氨氮浓度约达4.5g/L，其中微量元素液：称取ZnSO4·7H2O 0.02g，CoCl2·6H2O 0.02g，MnCl2·4H2O 0.003g，CuSO4·5H2O 0.001g，加水定容至100mL。氨水使用0.22μm的无机滤膜过滤除菌，置于4℃冰箱备用；
驯化培养基：C6H5Na3O7·2H2O 10g，(NH4)2SO4 1g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O0.1g，FeSO4·7H2O 0.05g，NaCl 1g，加水定容至1L，自然pH；
LB种子培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，加水定容至1L，自然pH；营养琼脂分离培养基：蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl 5g，琼脂20g，自然pH，培养基灭菌后倒平板备用。
本发明采用的氨氮测定方法
氨氮降解率(％)＝[(C0-C1)/C0]·100％。其中：C0为0h初始的氨氮浓度，C1为末时残留的氨氮浓度。采用纳氏试剂分光光度法测定发酵液中的氨氮浓度。通过在420nm波长下测定不同质量浓度的氨氮标准溶液的吸光度，绘制吸光度(Y)与氨氮浓度(X)的标准曲线。建立的回归方程为Y＝79.41X-0.00446，相关系数R2＝0.9996。所得氨氮溶液标准曲线见图1。
实施例1
高地芽孢杆菌KXY5的筛选、鉴定和保藏，包括如下步骤：
(1)取5g采集到的土样加至45mL无菌水中，在30℃、180r/min下振荡培养30min。取2mL菌悬液接入至50mL富集培养基中，于30℃、180r/min条件下振荡培养3d，得到菌原液A。取1mL菌原液A，以10-3、10-4、10-5、10-6、10-7浓度梯度稀释，分别移取100μL稀释液划线涂布至分离培养基上，30℃倒置培养3d。挑选不同形态的单菌落作进一步筛选。
(2)挑取步骤(1)中不同形态的单菌落分别接种至种子培养基中活化培养，在30℃、180r/min振荡培养2d后，将种子液以2％的接种量分别接种至高浓度氨筛选培养基中定性筛选培养3d，传代培养3次。在OD600nm处测定发酵液的吸光度，采用[00033]至[00034]的方法计算各菌株的氨氮降解率。挑选能够生长且氨氮降解率连续提升的菌株作进一步筛选。初步氨氮降解菌筛选结果见表1：
表1高浓度氨水为氮源筛选菌株的氨氮降解情况
初步氨氮降解菌筛选表明：从菌原液A中分离挑选的单菌落分别接种至高浓度氨筛选培养基中，定性筛选氨氮降解菌株(图2)，初始氨氮浓度为4.5g/L时，有7株菌能在高浓度氨筛选培养基中生长，依次编号为KXY1-KXY7，且7株菌对氨氮的降解性能呈现稳定提升的趋势，其中菌株KXY3与KXY5在高浓度氨氮环境中耐受性较强，对氨氮的降解性能提升较大，筛选后降解率分别为64.3％和75.18％，较初始筛选时降解率均提高了2.5倍。
(3)将步骤(2)中保存的菌株分别接至种子培养基中活化培养，在30℃、180r/min振荡培养2d后，将种子液以4％的接种量分别接至驯化培养基中，30℃、180r/min条件下培养3d，连续传代培养3次。采用[00033]至[00034]的方法计算各菌株的氨氮降解率。挑选能够生长且降解率最高的菌株于甘油管中-80℃保存。高效氨氮降解菌筛选结果见表2：
表2硫酸铵为氮源驯化菌株的氨氮降解情况
高效氨氮降解菌筛选结果表明：初始氨氮含量在1g/L时，驯化完7株菌的氨氮降解能力均有提升(图3)，菌株KXY1、KXY2、KXY3、KXY5在传代培养过程中整体保持较高的降解氨氮率，降解率均在65％之上。其中在筛选驯化过程中菌株KXY5对氨氮的降解率一直表现高效且稳定的优势，最终降解率高达80.29％，高地芽孢杆菌KXY5降解氨氮的浓度范围为1-4.5g/L，优选为1g/L。下一步对菌株KXY5进行鉴定与保藏。
对菌株KXY5进行平板划线，培养后观察菌落形态特征，对其进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察菌株形态。同时对菌株分子生物学鉴定：菌株的16S rDNA PCR扩增引物采用通用引物，正向引物27F：5’－AGAGTTTGATCCT-GGCTCAG－3’，反向引物1541R：5’－AAGGAGGTGATC-CAGCCGCA－3’。PCR反应体系(25μL)：2×Taq Master mix 12.5μL，ddH2O9.5μL，27F 1μL，1541R 1μL，离心混匀后加入DNA模板1μL。PCR反应程序：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃90s，共35个循环；72℃10min。PCR扩增完成后进行测序。DNA序列同源性采用NCBI(National Centre for Biotechnology)网站中的Blast软件进行检索，将搜索到的同源序列用Clustal X软件进行排序，用MEGA7软件构建系统进化树进行系统发育分析。
菌株KXY5在营养琼脂培养基平板上菌落形貌如图4A所示，菌落呈灰白色，表面湿润，菌落中间凸起褶皱，菌落类圆形，边缘不规则。电子显微镜下观察菌株KXY5呈球形、短杆状两种不同形态，革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性菌(图4B)。
菌株KXY5的分子生物学鉴定表明：如图5所示，菌株KXY5的16S rDNA基因PCR扩增产物在1500bp附近处出现一条明亮的特异性条带，经Blast比对与系统发育树分析，如图7所示，鉴定菌株KXY5为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，在2022年2月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.24274，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该菌株的16S rDNA基因序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2
所述的高地芽孢杆菌KXY5发酵液的制备
菌种活化
将[0040]中保藏的菌种接至种子培养基中，在30℃、180r/min振荡培养2d，具体地所述的菌种活化使用的种子培养基包括氯化钠、蛋白胨、酵母粉中的一种或多种。
一级种子液制备
将[0048]中活化的菌种接至驯化培养基中，在30℃、180r/min振荡培养3d，具体地，所述的一级种子液制备使用的驯化培养基包括柠檬酸三钠，硫酸铵，磷酸氢二钾，硫酸镁，硫酸亚铁，氯化钠中的一种或多种。
发酵液制备
将[0050]中一级种子液接至驯化培养基中，在30℃、180r/min振荡培养3d，传代三次。具体地，所述的发酵液制备使用的驯化培养基包括柠檬酸三钠，硫酸铵，磷酸氢二钾，硫酸镁，硫酸亚铁，氯化钠中的一种或多种。
本发明提供的高地芽孢杆菌KXY5在发酵过程中可利用碳氮源种类广，发酵工艺简单，能够实现工业化生产。
实施例3
菌株KXY5的生长曲线与氨氮降解动力学曲线测定
将挑选的高效降解菌株以4％接种量接种至驯化培养基中，30℃、180r/min条件下培养80h，每4h定点取样，3次重复。利用全波长扫描式多功能读数仪分别在600nm处测定上清液的吸光度，绘制光密度值与培养时间的关系曲线，在420nm处测定上清液吸光度，根据吸光度计算菌液中剩余氨氮含量，绘制剩余氨氮含量与培养时间的动力学曲线。
菌株KXY5的生长与氨氮降解动力学曲线如图7所示，结果表明：以4％接种量、30℃、180r/min条件下培养菌株80h，菌株KXY5的生物量与氨氮降解速率整体上呈现先增加后减少的趋势。菌株KXY5的氨氮降解速率和降解率在0-24h期间随生物量的增长呈现同步提高。在24-32h阶段，氨氮降解速率与菌体生长速度趋势表现不同，菌株在平稳期生长速度最快时，氨氮降解速率并未提升至最大值，反而在32h平稳期结束进入衰亡期时，氨氮降解速率到最大值0.01892g·L-1·h-1。随后该菌的生物量与氨氮降解速率整体表现迅速降低的趋势。72h后，生物量与降解率逐渐趋于平稳。此时氨氮含量从初始1.103g/L降至最低0.278g/L，氨氮降解率最高达74.80％。选取72h作为菌株KXY5的最佳培养时间。
不同条件下菌株KXY5降解氨氮效果
温度对菌株KXY5降解氨氮效果：以驯化培养基为基础，分别设置不同温度梯度20℃、25℃、30℃、37℃、42℃下180r/min培养72h后测定菌液的生物量与氨氮降解率，3次重复。温度对菌株KXY5生长情况与氨氮降解的影响结果见表3：
表3温度对菌株KXY5生长情况与氨氮降解的影响
温度对菌株KXY5的影响研究表明，菌株KXY5在25-42℃间具有良好的适应性和氨氮降解性能(图8)。在25-40℃下培养，菌株KXY5的氨氮降解率均达到60％之上。当培养温度30℃时，菌株KXY5的氨氮降解率最高达到83.68％。23-30℃时，温度提升使菌株KXY5的生长周期缩短，加速了氮源消耗，菌体生物量随温度提升反而逐渐降低，氨氮降解率却随温度的提升而升高；温度超过30℃时，菌株KXY5受温度影响，温度的提升使菌株KXY5的生长周期延长，氮源消耗减少，菌体生长速度减慢，生物量降低，氨氮降解率因菌体生物量不足受到一定程度上影响。由此可知，高地芽孢杆菌KXY5降解氨氮的温度范围为20-42℃，优选为25-42℃，最佳为30℃。
pH对菌株KXY5降解氨氮效果：以驯化培养基为基础，分别调整驯化培养基pH为：5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，维持其他培养条件不变进行试验，30℃下180r/min培养72h后测定菌液的生物量与氨氮降解率，3次重复。pH对菌株KXY5生长情况与氨氮降解的影响结果见表4：
表4温度对菌株KXY5生长情况与氨氮降解的影响
pH对菌株KXY5的影响试验结果如图9所示，在pH6.5-8.5之间菌株KXY5对氨氮均的降解性能具备良好稳定性，降解率在74-84％。pH7.5时，菌株对氨氮降解性能最优，降解率为83.68％。pH5.5时，在酸性环境下，菌株KXY5生长速度变慢，生物量达到高浓度时，降解率还未到达最大值；pH9.5时，测定结果发现氨氮初始浓度为0.505g/L，比自然pH下培养基中的氨氮浓度降低了一倍，此时菌株KXY5的氨氮降解率降低至38.95％，推测可能是氨氮在碱性环境下极易挥发，微生物生长所需氮源流失过多，碳氮比例失衡导致菌株KXY5生长过慢，氨氮降解率过低。由此可知高地芽孢杆菌KXY5降解氨氮的pH范围为5.5-9.5，优选为6.5-8.5，最佳为7.5。
接种量对菌株KXY5降解氨氮效果：以驯化培养基为基础，分别接种2％、4％、6％、8％、10％接种量的种子液接种至驯化培养基中，30℃下180r/min培养72h后测定菌液的生物量与氨氮降解率，3次重复。接种量对菌株KXY5生长情况与氨氮降解的影响结果见表5：
表5接种量对菌株KXY5生长情况与氨氮降解的影响
接种量对菌株KXY5的影响结果表明(如图10所示)，4％接种量接种培养菌株降解氨氮的效果最好，3d内氨氮降解率达到84％。在2％-10％的接种量区间，过高或过低的接种量接种菌株对氨氮的降解能力均有一定程度的减弱，接种量在10％时，氨氮降解率最低为68.04％，比最高时降低了18.68％。由此可知，高地芽孢杆菌KXY5降解氨氮的接种量范围为2-10％，优选为2-8％，最佳为4％。
盐度对菌株KXY5降解氨氮效果：以驯化培养基为基础，将各组驯化培养基盐度(即NaCl的浓度)分别调至为0.5％、1％、3％、6％、9％，30℃下180r/min培养72h后测定菌液的生物量与氨氮降解率，3次重复。盐度对菌株KXY5生长情况与氨氮降解的影响结果见表6：
表6钠盐对菌株KXY5生长情况与氨氮降解的影响
菌株KXY5在不同盐度下的耐受性，结果表明(图11)，0.1-6％NaCl时，菌株KXY5对降解氨氮具有一定的耐受性。随着盐度的提高，菌株KXY5的氨氮降解率逐渐降低；在低盐度0.1-0.5％NaCl时，菌株对氨氮的降解能力表现稳定，0.1％ NaCl时菌株KXY5的氨氮降解率最高为81.57％；3-6％NaCl情况下菌株KXY5的氨氮降解率分别为49.2％和36.11％，发酵液中菌体的OD值分别为0.822和0.096，可以看出盐度的提升，减缓了菌株的KXY5的生长速度，从而影响了菌株KXY5对氨氮的降解；当NaCl调整至9％时，菌体几乎无生长，此时菌株KXY5的氨氮降解率仅为5.92％。由此可知，高地芽孢杆菌KXY5降解氨氮的盐度范围为0.1-9％，优选为0.1-0.5％，最佳为0.1％。
碳源选择对菌株降解氨氮性能的影响：以驯化培养基为基础，通过分别添加蔗糖、葡萄糖、尿素、羧甲基纤维素钠、可溶性淀粉代替驯化培养基中的柠檬酸三钠，30℃下180r/min培养72h后测定菌液的生物量与氨氮降解率，3次重复。碳源选择对菌株KXY5生长情况与氨氮降解的影响结果见表7：
表7碳源类型对菌株KXY5生长情况与氨氮降解的影响
畜禽粪污有机质含量种类丰富，考察菌株对各种碳源的选择性，有利于菌株在实际中应对各种复杂的环境。结果由表7可知，菌株KXY5可利用多种碳源进行生长降解氨氮。当C/N为7:1时，菌株对柠檬酸盐的利用程度最高，氨氮降解率为80.28％。起始氮源含量相同情况下，通过利用可溶性淀粉与羧甲基纤维素钠等大分子多糖为碳源降解氨氮，与利用葡萄糖和蔗糖相比，碳源添加量更低，氨氮降解率均在12％左右，由此可见在一定程度上菌株KXY5对大分子多糖利用程度更高。表7中菌株OD值均不高，结合菌株KXY5的生长与降解特性分析，在上述条件培养时，菌株KXY5利用以上有机碳源培养时，均比利用柠檬酸盐的生长周期长，氨氮降解率整体偏低，对其他碳源的利用还需进一步的驯化。
实施例4
高地芽孢杆菌在猪粪鸡粪粪污中的降氨试验
分别称取鸡粪、猪粪各100g于1L烧杯中，加入50mL无菌水，以接入无菌水作为空白对照组，分别以4％接种量将高地芽孢杆菌KXY5接至各个烧杯中拌匀，密封。30℃、180r/min下分别培养3、5、7d，培养完成后采用硫酸吸收法吸收各组烧杯中的氨气，通过测定各组硫酸溶液中的氨氮含量，测定高地芽孢杆菌KXY5对各粪污中的氨氮降解率。菌株KXY5对畜禽粪污氨氮降解的情况见表8：
表8不同时间菌株KXY5对畜禽粪污氨氮降解的情况
菌株KXY5对畜禽粪污氨氮降解结果显示，当培养时间为5d时，高地芽孢杆菌KXY5对畜禽粪污氨氮降解效果最佳，对猪粪氨氮降解率高达68.68％，对鸡粪的氨氮降解率高达65.17％。
序列表
<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司
<120> 一株高地芽孢杆菌KXY5及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1415
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaagggagct tgctcccgga tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc 60
ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg gagctaatac cggatagttc cttgaaccgc 120
atggttcaag gatgaaagac ggtttcggct gtcacttaca gatggacccg cggcgcatta 180
gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga 240
tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc 300
ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat 360
cgtaaagctc tgttgttagg gaagaacaag tgcaagagta actgcttgca ccttgacggt 420
acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca 480
agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg 540
aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag 600
gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc 660
gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg 720
attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg 780
ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact 840
gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 900
gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aaccctagag atagggcttt 960
cccttcgggg acagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1020
tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca 1080
ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg 1140
ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacag aacaaagggc tgcgagaccg 1200
caaggtttag ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact 1260
gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg 1320
gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgcaa cacccgaagt cggtgaggta 1380
acctttatgg agccagccgc cgaaggtggg gcaga 1415

Claims (4)

1.一株高地芽孢杆菌KXY5，其特征在于，其分类命名为高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis），已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.24274，该菌株的16S rDNA 基因序列如SEQ ID No.1 所示。
2.权利要求1所述的高地芽孢杆菌KXY5或高地芽孢杆菌KXY5发酵液在制备降解氨氮制剂中的应用，其特征在于，所述的高地芽孢杆菌KXY5发酵液的制备方法为：将活化后的KXY5菌种接种至LB种子培养基中活化培养，在30 ℃、180 r/min振荡培养2d后，将种子液以4 %的接种量分别接种至驯化培养基中，30 ℃、180 r/min条件下培养3 d，连续传代培养3次，即得；所述的驯化培养基组成为：C6H5Na3O7·2H2O 10 g，(NH4)2SO4 1 g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.1 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，NaCl 1 g，加水定容至1 L，pH 7.5。
3.根据权利要求2所述的高地芽孢杆菌KXY5或高地芽孢杆菌KXY5发酵液在畜禽粪污臭气治理中的应用，其特征在于，选用高地芽孢杆菌KXY5或高地芽孢杆菌KXY5发酵液处理畜禽粪污中的氨氮，实现抑制氨气大量挥发改善环境的目标；所述的高地芽孢杆菌KXY5或高地芽孢杆菌KXY5发酵液降解氨氮的浓度范围为1-4.5 g/L；pH范围为5.5-9.5；温度范围为20-42℃。
4.根据权利要求3所述的高地芽孢杆菌KXY5或高地芽孢杆菌KXY5发酵液在畜禽粪污臭气治理中的应用，其特征在于，所述的pH范围为6.5-8.5；温度为30℃。
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