CN115433690A - 一种复合微生物除臭剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合微生物除臭剂及其制备方法和应用，属于环境微生物技术领域，所述复合微生物除臭剂包含哈尔滨乳杆菌(Lactobacillusharbinensis)和类干酪乳杆菌，哈尔滨乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24253。该复合微生物除臭剂在应用24h时对宠物粪便、畜禽粪便、下水道产生的氨气处理效率可达90％以上，硫化氢处理效率可达85％以上，且除臭持久、高效并无二次污染。
Description
技术领域
本发明涉及一种复合微生物除臭剂，尤其涉及一种以哈尔滨乳杆菌和类干酪乳杆菌作为主要活性成分的复合微生物除臭剂，属于环境微生物技术领域。
背景技术
恶臭物质包括硫醇类、硫醚类、胺类、酰胺类、吲哚类及一些无机物质等。这些物质危害人的呼吸系统、循环系统、消化系统、内分泌系统和神经系统，严重影响了人们的精神状态，降低了生活质量。
除臭剂主要分为物理除臭剂、化学除臭剂、微生物除臭剂、植物型除臭剂和复合型除臭剂等。物理除臭剂主要是利用吸附和掩盖作用达到除臭的目的，这类除臭剂常用的材料有活性炭、沸石、芳香化合物等，特点是很难完全改变臭气气体的成分，对人畜、设备和环境等仍有一定程度的损害。化学除臭剂是利用化学试剂与臭气分子发生化学反应达到除臭的目的，常见的化学除臭产品原料有蓖麻油醇酸锌、大豆乙基硫酸乙酯吗啉、甲基丙烯酸脂肪醇等，其特点是反应迅速但是效果不持久，且易产生二次污染。植物除臭剂的有效成分来自于茶叶提取物、丝兰提取物、芬多精等植物，这些植物中含有的化学物质，能与臭味分子基团发生化学反应，削弱异味分子中的化合键，最后生成无味、无毒的物质，但有效成分的提取工艺复杂，生产成本较高，且除臭对象单一，还可能产生一些难以预料的化学反应。
而微生物除臭剂是利用微生物菌群的代谢或其代谢产物，有效降解挥发性脂肪酸和硫化氢等常见的臭味因子，对人畜安全无毒，无刺激性，可生物降解，通过微生物的不断繁殖，生物除臭作用较持久，无二次污染，且使用方便，成本低廉。
微生物型除臭剂由于其具有环保、可重复利用的优势，越来越受到人们的重视。但现有的微生物除臭剂生产工艺较为复杂，具有协同作用的复合菌株不易获得，且分解恶臭的效果不佳，这些都限制了微生物除臭剂的进一步应用。
发明内容
本发明针对目前市场上的微生物除臭产品所存在的不足，提供一种复合微生物除臭剂，该复合微生物除臭剂在应用24h时对宠物粪便、畜禽粪便、下水道产生的氨气处理效率可达90％以上，硫化氢处理效率可达85％以上，且除臭持久、高效并无二次污染。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种复合微生物除臭剂，包含哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis)和类干酪乳杆菌，所述哈尔滨乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.24253，保藏日期为：2022年01月05日，其16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示。
在没有特别说明的情况下，本发明中所述的哈尔滨乳杆菌均是指哈尔滨乳杆菌MD-1菌株，该菌株是从垃圾渗滤液中分离得到的，其生理生化特征为：在MRS培养基上培养时，其菌落为圆形，乳白色，不透明，凸起，表面粗糙，细胞为短杆。
本发明中所述的类干酪乳杆菌又称为副干酪乳杆菌，属于乳酸菌属中的干酪乳杆菌群。
进一步，所述哈尔滨乳杆菌与类干酪乳杆菌的活菌数之比为1：(1-2)，优选1：(1.2-1.6)。
进一步，所述复合微生物除臭剂中还包含枯草芽孢杆菌，优选的，所述哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的活菌数之比为1：(0.5-3)：(0.5-2.5)，更优选1：(0.7-2.1)：(0.9-1.5)。
进一步，所述复合微生物除臭剂中的活菌量不低于10×108CFU/mL，优选(10-50)×108CFU/mL。
本发明提供的复合微生物除臭剂中所选用的菌株特性及功能如下：
(1)哈尔滨乳杆菌和类干酪乳杆菌的生长过程中会分泌乳酸菌素，产生有机酸、酒精和二氧化碳等，可以显著抑制有害菌的生长，从而减少恶臭物质的产生；
(2)枯草芽孢杆菌能迅速消耗环境中的游离氧，促进乳酸菌的生长，并产生乳酸等有机酸类，降低环境的pH值，间接抑制其他有害菌的生长，芽孢杆菌菌体能自身合成消化酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等，这些酶对有机物有一定的分解作用，对环境有一定的净化作用。
本发明提供的复合微生物除臭剂的有益效果为：
(1)将特定比例的复合微生物除臭剂稀释30倍后喷施于鸭粪和猫砂上方，应用24h时氨气去除率可达90％以上，硫化氢去除率可达85％以上；
(2)两种或三种菌株之间协同配合发挥作用，拓宽了可处理污染物的种类，且除臭效果明显优于单一菌株，效果更稳定，除臭效果更持久。
(3)菌种数量少，成本低，仅包含两至三种菌株，且类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌可选自市场上任一厂家的产品，可合理控制成本。
上述复合微生物除臭剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)扩大培养：将哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌进行扩大培养，得到各菌株的培养液；
(2)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，分别将步骤(1)所得的哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的培养液按照5-10vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃、转速150-300rpm，哈尔滨乳杆菌和类干酪乳杆菌在通气比为1:(0.5-0.8)的条件下发酵，待pH＜4时停止发酵；枯草芽孢杆菌在通气比为1:(1-2)的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得各菌株的发酵液；
(3)制备复合微生物除臭剂，将步骤(2)所得的各菌株的发酵液按体积比混合灌装，即得复合微生物除臭剂。
优选的，所述复合微生物除臭剂的制备方法包括如下步骤：
(1)一级种子培养：无菌条件下，分别取哈尔滨乳杆菌和类干酪乳杆菌接种于MRS培养基中，枯草芽孢杆菌接种于LB培养基中，于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-48h，得到各菌株的一级种子培养液；
(2)二级种子培养：无菌条件下，分别将哈尔滨乳杆菌和类干酪乳杆菌的一级种子培养液按照1-5vol％的接种量接种于MRS培养基中，枯草芽孢杆菌的一级种子培养液按照1-5vol％的接种量接种于LB培养基中，于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-48h，得到各菌株的二级种子培养液；
(3)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，分别将步骤(2)所得的哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的二级种子培养液按照5-10vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃、转速150-300rpm，哈尔滨乳杆菌和类干酪乳杆菌在通气比为1:(0.5-0.8)的条件下发酵，待pH＜4时停止发酵；枯草芽孢杆菌在通气比为1:(1-2)的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得各菌株的发酵液；
(4)制备复合微生物除臭剂：将步骤(3)所得的各菌株的发酵液按体积比混合灌装，即得复合微生物除臭剂。
本发明中所述的通气比是指每分钟内通入发酵罐的空气体积与发酵液总体积之比。
所述MRS培养基的组成为：10g蛋白胨、10g牛肉粉、5g酵母粉、20g葡萄糖、1mL吐温80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.1g硫酸镁、0.05g硫酸锰、1000mL蒸馏水；LB培养基的组成为：5g酵母粉、10g蛋白胨、10g氯化钠、1000mL蒸馏水。
进一步，所述哈尔滨乳杆菌和类干酪乳杆菌的发酵培养基组成为：碳源40-60g/L、氮源15-30g/L、K+0.5-1.2g/L、Mg2+0.1-0.2g/L，溶剂为水，且pH＝6～7；所述枯草芽孢杆菌的发酵培养基组成为：碳源20-50g/L、氮源10-30g/L、K+0.3-0.8g/L、Mg2+0.5-1.5g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8。
优选的，所述K+的来源为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸钾、氯化钾、硝酸钾中的一种或多种，所述Mg2+的来源为硫酸镁、氯化镁中的一种或二者的复配。
进一步，所述碳源选自葡萄糖、红糖、糖蜜中的一种或多种的复配。
进一步，所述氮源选自酵母粉、蛋白胨、硫酸铵或牛肉粉中的一种或多种的复配。
本发明还要求保护使用复合微生物除臭剂去除环境中臭味的方法，包括向环境中喷洒所述复合微生物除臭剂的步骤。
本发明还要求保护上述的复合微生物除臭剂在除臭领域的应用，优选的，所述复合微生物除臭剂用于去除氨气和硫化氢，更优选的，用于去除宠物粪便、畜禽粪便和下水道所产生的氨气和硫化氢。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例中使用的类干酪乳杆菌为购自山东中科嘉亿生物工程有限公司JLPF-176型号的产品，枯草芽孢杆菌为购自山东蔚蓝生物科技有限公司生防120型号的产品。
实施例1：哈尔滨乳杆菌的筛选分离与鉴定
1、菌株的筛选分离
采集河南省商丘市某垃圾填埋场的垃圾渗滤液，采用梯度稀释法将该污水稀释至10-2、10-3和10-4，分别吸取各稀释液100μl至MRS培养基，涂布均匀后倒置于30℃条件下培养，约48h长出单菌落。挑选形态相异的单菌落转接至试管斜面分离培养基上，30℃条件下培养约48h，然后转移至4℃冰箱中保藏备用。
按上述分离方法共得到5株菌株，分别编号为：MD-1、MD-2、MD-3、MD-4和MD-5。
2、初筛效果评价
无菌环境中，将初筛得到的5株菌株分别挑取1环接种于盛有100mL MRS培养基的250mL三角瓶中，30℃、220rpm条件下培养48h，进行活化。
室温条件下，将50-100μl的氨水加入到1L实验瓶中，密封后进行磁子搅拌，使气体混合均匀，搅拌1h后，用氨气检测仪测其氨气浓度；然后分别加入筛选出的5株菌的活化液约1mL，用喷壶喷到试剂瓶中，密封，进行磁子搅拌，使气体混合均匀，搅拌1h后测其氨气浓度。设置1组对照组，用无菌水代替活化液作为对照组，各实验组设置3个平行，结果如表1所示。
表1.各菌株去除氨气的效果
根据表1的检测结果可知，与其他菌株相比，MD-1菌株在处理氨气方面表现出巨大的优势，1h处理氨气效率可达82％，除氨能力强。
3、菌株的检测鉴定
MD-1菌株的菌种斜面经过16S rDNA基因序列检测鉴定，其16S rDNA序列如SEQ IDNo:1所示，将测序结果在NCBI中比对，选择相似度最大的序列作为物种鉴定结果，鉴定结果为lactobacillus harbinensis哈尔滨乳杆菌。
实施例2：不同菌剂配方的效果评价
无菌条件下分别取哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌接种于100mL的MRS、MRS和LB培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，得到各菌株的活化液，所得哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌活化液的活菌数分别为50×108CFU/mL、80×108CFU/mL、120×108CFU/mL。
室温条件下，将50-100μl的氨水加入到1L实验瓶中，密封后进行磁子搅拌，使气体混合均匀，搅拌1h后，用氨气检测仪测其氨气浓度；然后分别加入不同配方的菌株活化液约1mL，用喷壶喷到试剂瓶中，密封，进行磁子搅拌，使气体混合均匀，搅拌1h后采用氨气检测仪测其氨气浓度。设置1组对照组，用无菌水代替活化液作为对照组，各实验组设置3个平行。具体实验安排如下：
对照组：加无菌水；
实验组1：哈尔滨乳杆菌；
实验组2：类干酪乳杆菌；
实验组3：枯草芽孢杆菌；
实验组4：哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌；
实验组5：类干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌；
实验组6：哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌；
实验组4-6中的各配方均为菌株活化液的等体积配制，最终复配得到菌剂的活菌数均为10×108-50×108CFU/mL，结果如表2所示。
表2.各菌剂去除氨气的效果
由表2中的结果可知，各实验组菌剂均有一定的除氨效果，其中不含哈尔滨乳杆菌的实验组2、3和5的效果较差，可见哈尔滨乳杆菌在复合菌剂作用中的重要性，含三个菌种的实验组6的效果最佳，1h处理氨气效率可达96％，实验组1和4的氨气处理效果也很优异，1h的氨气处理效率分别为80％和85％，由此可见，哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的单个菌种的活化液处理氨气的效率明显低于复合菌剂，各菌株之间发挥了协同配合作用。
实施例3：复合菌剂配方中各菌种不同比例的效果评价
无菌条件下分别取哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌接种于100mL的MRS、MRS和LB培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，得到各菌株的活化液，所得哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌活化液的活菌数分别为55×108CFU/mL、76×108CFU/mL、100×108CFU/mL。
室温条件下，将50-100μl的氨水加入到1L实验瓶中，密封后进行磁子搅拌，使气体混合均匀，搅拌1h后，用氨气检测仪测其氨气浓度；然后分别加入三种菌株活化液以不同比例复配所得的复合菌剂约1mL，用喷壶喷到试剂瓶中，密封，进行磁子搅拌，使气体混合均匀，搅拌1h后测其氨气浓度。设置1组对照组，用无菌水代替活化液作为对照组，各实验组分别设置3个平行。
具体实验安排如下：
对照组：加无菌水；
实验组1：哈尔滨乳杆菌50％、类干酪乳杆菌25％、枯草芽孢杆菌25％；
实验组2：哈尔滨乳杆菌43％、类干酪乳杆菌22％、枯草芽孢杆菌35％；
实验组3：哈尔滨乳杆菌40％、类干酪乳杆菌40％、枯草芽孢杆菌20％；
实验组4：哈尔滨乳杆菌36％、类干酪乳杆菌36％、枯草芽孢杆菌28％；
实验组5：哈尔滨乳杆菌33％、类干酪乳杆菌50％、枯草芽孢杆菌17％；
实验组1-5中的各复合菌剂均为三种菌株的活化液按体积比配制，最终复配得到复合菌剂的活菌数均为10×108-50×108CFU/mL，结果如表3所示。
表3.各复合菌剂去除氨气的效果
由表3中的结果可知，各实验组复合菌剂均有一定的除氨效果，1h氨气的处理效率为87-96％，其中实验组3的配方效果最佳。
实施例4：复合微生物除臭剂用于鸭粪除臭
1、复合微生物除臭剂的制备
1)一级种子液培养：无菌条件下分别取哈尔滨乳杆菌和类干酪乳杆菌接种于MRS培养基中，枯草芽孢杆菌接种于LB培养基中，于30℃、150rpm的条件下培养24h，得到各菌株的一级种子培养液；
2)二级种子液培养:无菌条件下分别将哈尔滨乳杆菌和类干酪乳杆菌的一级种子培养液按照1vol％的接种量接种于MRS培养基中，枯草芽孢杆菌的一级种子培养液按照1vol％的接种量接种于LB培养基中，于30℃、150rpm的条件下培养24h，得到各菌株的二级种子培养液；
3)发酵：在3个发酵罐中分别装入总体积60％的发酵培养基，待发酵培养基消毒完毕后，分别将步骤(2)所得的哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的二级种子培养液按照5vol％的接种量接种于3个发酵培养基中。哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌的发酵条件是：控制温度为25-35℃，通气比为1:(0.5-0.8)，转速150-300rpm，发酵24-48h，待pH＜4停止发酵；枯草芽孢杆菌的发酵条件是：控制温度为25-35℃，通气比为1:(1-2)，转速150-300rpm的条件下发酵，发酵24-36h，待溶氧开始上升时停止发酵，将上述发酵液按合适体积比进行混合后得液体复合微生物除臭剂，哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌的发酵液活菌数分别为55×108CFU/mL、90×108CFU/mL和120×108CFU/mL。
所述哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌的发酵培养基组成为：糖蜜40g/L、酵母粉15g/L、K+0.5-1.2g/L、Mg2+0.1-0.2g/L，pH＝6～7，其余为水；枯草芽孢杆菌的发酵培养基为：酵母粉10g/L、硫酸铵10g/L、蛋白胨10g/L，葡萄糖35g/L，红糖15g/L，K+0.5-1.2g/L、Mg2+0.1-0.2g/L，pH＝6.5～7，其余为水。
2、实验安排与设计
鸭粪的除臭：室温条件下，将1～2g的鸭粪(取自河北某养鸭场，鸭粪已同稻壳混合在一起)加入到1L实验瓶中，密封后静置，使气体混合均匀，1h后用氨气硫化氢检测仪测其氨气、硫化氢浓度；
设置1组对照组，用无菌水代替活化液作为对照组，设置3个实验组，其中包含2个复合菌剂和一个哈尔滨乳杆菌活化液，各实验组分别设置3个平行。
2个复合菌剂实验组的菌剂由各菌株的发酵液按如下体积比复配而成：
复合菌剂1：哈尔滨乳杆菌50％、类干酪乳杆菌50％；
复合菌剂2：哈尔滨乳杆菌40％、类干酪乳杆菌40％、枯草芽孢杆菌20％；
哈尔滨乳杆菌活化液的制备方法同实施例3，将复合菌剂1、2及哈尔滨乳杆菌活化液用自来水稀释30倍后，分别将约1mL的稀释液用喷壶喷到实验瓶中，密封，定期测其氨气、硫化氢浓度。
为测试除臭效果，每次测试从感官上进行判断(判断标准为：恶臭“++++”，较臭“+++”，微臭“++”，无明显臭感“+”)
表4.鸭粪中的氨气处理效果
表5.鸭粪中的硫化氢处理效果
表6.鸭粪中的臭味去除效果
由上述结果可知，本发明提供的复合微生物除臭剂及单一的哈尔滨乳杆菌活化液对于鸭粪都具有较好的除臭效果，但复合微生物除臭剂较单一的哈尔滨乳杆菌除臭效果更好，哈尔滨乳杆菌24h除氨气、硫化氢的效率分别为87％、71％，复合微生物菌剂2效果最优，24h除氨气、硫化氢的效率分别为94％、93％，所以复合微生物菌剂见效快，且持久。
实施例5：复合微生物除臭剂用于猫砂除臭
1、复合微生物除臭剂的制备
1)一级种子液培养：无菌条件下分别取哈尔滨乳杆菌和类干酪乳杆菌接种于MRS培养基中，枯草芽孢杆菌接种于LB培养基中，于35℃、300rpm的条件下培养12h，得到各菌株的一级种子培养液；
2)二级种子液培养：无菌条件下分别将哈尔滨乳杆菌和类干酪乳杆菌的一级种子培养液按照2.5vol％的接种量接种于MRS培养基中，枯草芽孢杆菌的一级种子培养液按照2.5vol％的接种量接种于LB培养基中，于35℃、300rpm的条件下培养12h，得到各菌株的二级种子培养液；
3)发酵：在3个发酵罐中分别装入总体积60％的发酵培养基，待发酵培养基消毒完毕后，分别将步骤(2)所得的哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的二级种子培养液按照10vol％的接种量接种于3个发酵培养基中。哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌的发酵条件是：控制温度为25-35℃，通气比为1:(0.5-0.8)，转速150-300rpm，发酵24-48h，待pH＜4停止发酵；枯草芽孢杆菌的发酵条件是：控制温度为25-35℃，通气比为1:(1-2)，转速150-300rpm的条件下发酵，发酵24-36h，待溶氧开始上升时停止发酵，将上述发酵液按合适体积比进行混合后得液体复合菌剂，哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的发酵液活菌数分别为85×108CFU/mL、100×108CFU/mL和150×108CFU/mL。
所述哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌的发酵培养基组成为：红糖20g/L、葡萄糖40g/L、酵母粉30g/L、K+0.5-1.2g/L、Mg2+0.1-0.2g/L，pH＝6～7，其余为水；枯草芽孢杆菌的发酵培养基为：葡萄糖30g/L、酵母粉10g/L、K+0.3-0.8g/L、Mg2+0.5-1.5g/L，pH＝7～8，其余为水。
2、实验安排与设计
猫砂的除臭：室温条件下，将1～2g的猫砂(取自宠物猫用过的猫砂)加入到1L实验瓶中，密封后静置，使气体混合均匀，1h后用氨气硫化氢检测仪测其氨气、硫化氢浓度；
设置1组对照组，用无菌水代替活化液作为对照组，设置3个实验组，其中包含2个复合菌剂和一个哈尔滨乳杆菌活化液，各实验组分别设置3个平行。
2个复合菌剂实验组的菌剂由各菌株的发酵液按如下体积比复配而成：
复合菌剂1：哈尔滨乳杆菌50％、类干酪乳杆菌50％；
复合菌剂2：哈尔滨乳杆菌40％、类干酪乳杆菌40％、枯草芽孢杆菌20％；
哈尔滨乳杆菌活化液的制备方法同实施例3，将复合菌剂1、2及哈尔滨乳杆菌活化液用自来水稀释30倍后，分别将约1mL的稀释液用喷壶喷到实验瓶中，密封，定期测其氨气、硫化氢浓度。
为测试除臭效果，每次测试从感官上进行判断(判断标准为：恶臭“++++”，较臭“+++”，微臭“++”，无明显臭感“+”)
表7.猫砂中的氨气处理效果
表8.猫砂中的硫化氢处理效果
表9.猫砂中的臭味去除效果
由上述结果可知，本发明提供的复合微生物除臭剂及单一的哈尔滨乳杆菌对于猫砂产生的臭味都具有较好的去除效果，但复合微生物除臭剂较单一的哈尔滨乳杆菌除臭效果更好，单一的哈尔滨乳杆菌24h除氨气、硫化氢的效率分别为85％、86％，复合微生物除臭剂2效果最优，24h除氨气、硫化氢的效率分别为94％、86％，且臭味明显感觉不到，说明该复合微生物除臭剂的除臭效果好，且持久性好。
实施例6：复合微生物除臭剂用于下水道除臭
1、复合微生物除臭剂的制备
1)一级种子液培养：无菌条件下分别取哈尔滨乳杆菌和类干酪乳杆菌接种于MRS培养基中，枯草芽孢杆菌接种于LB培养基中，于25℃、220rpm的条件下培养24h，得到各菌株的一级种子培养液；
2)二级种子液培养：无菌条件下分别将哈尔滨乳杆菌和类干酪乳杆菌的一级种子培养液按照5vol％的接种量接种于MRS培养基中，枯草芽孢杆菌的一级种子培养液按照5vol％的接种量接种于LB培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，得到各菌株的二级种子培养液；
3)发酵：在3个发酵罐中分别装入总体积60％的发酵培养基，待发酵培养基消毒完毕后，分别将步骤(2)所得的哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的二级种子培养液按照5vol％的接种量接种于3个发酵培养基中。哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌的发酵条件是：控制温度为25-35℃，通气比为1:(0.5-0.8)，转速150-300rpm，发酵24-48h，待pH＜4停止发酵；枯草芽孢杆菌的发酵条件是：控制温度为25-35℃，通气比为1:(1-2)，转速150-300rpm的条件下发酵，发酵24-36h，待溶氧开始上升时停止发酵，将上述发酵液按合适体积比进行混合后得复合微生物除臭剂，哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的发酵液活菌数分别为45×108CFU/mL、60×108CFU/mL和90×108CFU/mL。
所述哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌的发酵培养基组成为：糖蜜50g/L、酵母粉20g/L、K+0.5-1.2g/L、Mg2+0.1-0.2g/L，其余为水；枯草芽孢杆菌的发酵培养基为：葡萄糖20g/L、牛肉粉10g/L、蛋白胨20g/L，K+0.5-1.2g/L、Mg2+0.1-0.2g/L，其余为水。
2、实验设计与安排：
下水道的除臭：室温条件下，将10-20mL的生活污水进水加入到1L实验瓶中，密封后静置，使气体混合均匀，1h后用氨气硫化氢检测仪测其氨气、硫化氢浓度；然后分别加入单一的哈尔滨乳杆菌活化液及复合菌剂约1mL，用喷壶喷到试剂瓶中，密封，定期测其氨气、硫化氢浓度。
设置1组对照组，用无菌水代替活化液作为对照组，设置3个实验组，其中包含2个复合菌剂和一个哈尔滨乳杆菌活化液，各实验组分别设置3个平行。
2个复合菌剂实验组的菌剂由各菌株的活化液按如下体积比复配而成：
复合菌剂1：哈尔滨乳杆菌50％、类干酪乳杆菌50％；
复合菌剂2：哈尔滨乳杆菌40％、类干酪乳杆菌40％、枯草芽孢杆菌20％；
哈尔滨乳杆菌活化液的制备方法同实施例3。
为测试除臭效果，每次测试从感官上进行判断(判断标准为：恶臭“++++”，较臭“+++”，微臭“++”，无明显臭感“+”)
3、实验结果
表10.下水道中氨气的处理效果
表11.下水道中硫化氢的处理效果
表12.下水道中的臭味去除效果
由上述实验结果可见，本发明提供的复合微生物除臭剂及单一的哈尔滨乳杆菌活化液对于下水道臭味都具有较好的除臭效果，但复合微生物除臭剂较单一的哈尔滨乳杆菌活化液除臭效果更好，哈尔滨乳杆菌活化液24h除氨气、硫化氢的效率分别为83％、73％，而复合菌剂2的效果最优，24h除氨气、硫化氢的效率分别为90％、85％，所以复合微生物除臭剂见效快且持久，而且由于使用了复合微生物除臭剂，不仅氨气、硫化氢的处理效率高，并且通过感官评价，还能闻到类似酿酒的味道。
综上，本发明提供的哈尔滨乳杆菌无论是与类干酪乳杆菌二者复配，还是与类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌三者复配使用，都对产生恶臭的氨气和硫化氢气体具有非常好的处理作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛蔚蓝赛德生物科技有限公司
<120> 一种复合微生物除臭剂及其制备方法和应用
<130> 2
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1473
<212> DNA
<213> 哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis)
<400> 1
agggcgggtg ctataatgca gtcgaacgag gtttggtcag tttgcggtgg tgcttgcatc 60
accaattacc gatcaaaccg agtggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgccctt 120
cagcagggga taacatttgg aaacagatgc taataccgta taaccacgga gaccgcatgg 180
tctccgggta aaagatggcg caagctatca ctgaaggatg gacccgcggc gtattagcca 240
gttggtgggg taacggccta ccaaagcgat gatacgtagc cgacctgaga gggtaatcgg 300
ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 360
acaatggacg caagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggctt tcgggtcgta 420
aaactctgtt attgaagaag aacgtgtgtg acagtaactg gtcatgcagt gacggtattc 480
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ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagt gcaggcggtc ttttaagtct gatgtgaaag 600
ccttcggctt aaccgaagaa gggcatcgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaga 660
gtggaactcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag 720
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tcggggacag aatgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1080
ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatg atcagttgcc agcattcagt tgggcactct 1140
ggtcagactg ccggtgacaa accggaggaa ggcggggatg acgtcaaatc atcatgcccc 1200
ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat gggtggtaca acgagcagcg agaccgcgag 1260
gtcaagcgaa tctctaaaaa ccatcctcag ttcggattgc aggctgcaac tcgcctgcat 1320
gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1380
tgtacacacc gcccgtcaca ccatgagagt ttgtaacacc caaagccggt gagacaaccg 1440
caaggagtca gccgtctaag gtcacaaagt atg 1473
Claims (10)
1.一种复合微生物除臭剂，其特征在于，包含哈尔滨乳杆菌(Lactobacillusharbinensis)和类干酪乳杆菌，所述哈尔滨乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24253。
2.根据权利要求1所述的复合微生物除臭剂，其特征在于，所述哈尔滨乳杆菌与类干酪乳杆菌的活菌数之比为1：(1-2)，优选1：(1.2-1.6)。
3.根据权利要求1所述的复合微生物除臭剂，其特征在于，还包含枯草芽孢杆菌。
4.根据权利要求3所述的复合微生物除臭剂，其特征在于，所述哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的活菌数之比为1：(0.5-3)：(0.5-2.5)，优选1：(0.7-2.1)：(0.9-1.5)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的复合微生物除臭剂，其特征在于，所述复合微生物除臭剂中的活菌量不低于10×108CFU/mL，优选(10-50)×108CFU/mL。
6.权利要求1-5中任一项所述的复合微生物除臭剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)扩大培养：将哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌进行扩大培养，得到各菌株的培养液；
(2)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，分别将步骤(1)所得的哈尔滨乳杆菌、类干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌的培养液按照5-10vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃、转速150-300rpm，哈尔滨乳杆菌和类干酪乳杆菌在通气比为1:(0.5-0.8)的条件下发酵，待pH＜4时停止发酵；枯草芽孢杆菌在通气比为1:(1-2)的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得各菌株的发酵液；
(3)制备复合微生物除臭剂：将步骤(2)所得的各菌株的发酵液按体积比混合灌装，即得复合微生物除臭剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述哈尔滨乳杆菌和类干酪乳杆菌的发酵培养基组成为：碳源40-60g/L、氮源15-30g/L、K+0.5-1.2g/L、Mg2+0.1-0.2g/L，溶剂为水，且pH＝6～7；所述枯草芽孢杆菌的发酵培养基组成为：碳源20-50g/L、氮源10-30g/L、K+0.3-0.8g/L、Mg2+0.5-1.5g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖、红糖、糖蜜中的一种或多种的复配；
所述氮源选自酵母粉、蛋白胨、硫酸铵或牛肉粉中的一种或多种的复配。
9.一种使用权利要求1-5中任一项所述的复合微生物除臭剂去除环境中臭味的方法，包括向环境中喷洒所述复合微生物除臭剂的步骤。
10.权利要求1-5中任一项所述的复合微生物除臭剂在除臭领域的应用，优选的，所述复合微生物除臭剂用于去除氨气和硫化氢，更优选的，用于去除宠物粪便、畜禽粪便和下水道所产生的氨气和硫化氢。
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