CN114395515B - 一种哈尔滨乳杆菌、包含其的微生物除臭剂及二者的应用 - Google Patents

一种哈尔滨乳杆菌、包含其的微生物除臭剂及二者的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis)、包含其的微生物除臭剂及二者在除臭领域的应用，该哈尔滨乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24253。该菌株对于垃圾渗滤液、动物粪便产生的恶臭有良好的去除作用，同时该菌株可以对垃圾渗滤液中的有害有机物进行分解，减少恶臭的产生，并容易定植，除臭持久。

Description

一种哈尔滨乳杆菌、包含其的微生物除臭剂及二者的应用
技术领域
本发明涉及一种哈尔滨乳杆菌、包含该哈尔滨乳杆菌的微生物除臭剂以及该菌株和微生物除臭剂在除臭方面的应用，属于环境微生物技术领域。
背景技术
随着社会的快速发展，由污水、生活垃圾、畜禽养殖业等产生的恶臭导致的环境污染和人体健康问题愈显突出。恶臭气体主要是一些含硫化合物和含氮化合物等，如硫化氢、甲硫醇、硫醚、氨气等，具有强烈的刺激性异味，对人体的危害极大，可经呼吸道、眼、皮肤等不同途径进入人体，使人头昏、难受，若长期置身其中，对人体的神经系统损害极大。因此，有效处理恶臭污染，减少恶臭污染对生态环境及人类的影响已经成了一个迫切解决的社会问题。
根据作用机理的不同，目前常用的除臭剂分为物理除臭剂、化学除臭剂、生物除臭剂和植物除臭剂。物理除臭剂主要是利用吸附和掩盖作用达到除臭的目的，这类除臭剂常用的材料有活性炭、沸石、芳香化合物等，特点是很难完全改变臭气气体成分，对人畜、设备和环境等仍有一定程度的损害。化学除臭剂是利用化学试剂与臭气分子发生化学反应达到除臭的目的，常见的化学除臭产品原料有蓖麻油醇酸锌、大豆乙基硫酸乙酯吗啉、甲基丙烯酸脂肪醇等，其特点是反应迅速但是效果不持久，且易产生二次污染。植物除臭剂的有效成分来自于茶叶提取物、丝兰提取物、芬多精等植物，这些植物中含有的化学物质，能与臭味分子基团发生化学反应，削弱异味分子中的化合键，最后生成无味、无毒的物质，但有效成分的提取工艺复杂，生产成本较高，且除臭对象单一，还可能产生一些难以预料的化学反应。而生物除臭剂是利用微生物菌群的代谢或其代谢产物，有效降解挥发性脂肪酸和硫化氢等常见臭味因子，对人畜安全无毒，无刺激性，可生物降解，通过微生物的不断繁殖，生物除臭作用较持久，无二次污染，且使用方便，成本低廉。
正是由于生物除臭方法所存在的天然优势，使得该方法越来越受到业内人士的关注，但国内外市场上目前的生物除臭产品普遍存在处理效率低、有效活菌数少等问题。此外，有不少产品未考虑菌株之间的协同作用及适当比例，导致产品质量和使用效果不稳定。因此筛选以及构建高效、协同、廉价、抗逆性强、使用安全的高性能生物制剂，使各种微生物发挥协同作用，拓宽可处理污染物的种类，提高处理效率是环保生物制剂开发生产的发展方向。
发明内容
本发明针对目前市场上的生物除臭产品所存在的不足，提供一种对恶臭环境适应性强、成本低的哈尔滨乳杆菌以及包含该哈尔滨乳杆菌的微生物除臭剂，该微生物除臭剂对垃圾、粪便产生的氨气处理效率可达93％以上，硫化氢处理效率可达85％以上，且除臭持久、高效且无二次污染。
一种哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis)MD-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.24253，保藏日期为：2022年01月05日，其16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示，在没有特别说明的情况下，本发明中所述的哈尔滨乳杆菌均是指哈尔滨乳杆菌MD-1菌株。
该菌株是从垃圾渗滤液中分离得到，其生理生化特征为：在MRS培养基上培养时，其菌落为圆形，乳白色，不透明，凸起，表面粗糙，细胞为短杆。
该菌株能够去除氨气、硫化氢的原理为：该菌株的生长过程中会分泌乳酸菌素，产生有机酸、酒精和二氧化碳等，可与挥发性脂肪酸、氨气和硫化氢等常见臭味因子发生反应进而将其降解掉，并显著抑制有害菌的生长，从而减少恶臭物质的产生。
本发明提供的哈尔滨乳杆菌的有益效果是：
1)将其发酵液稀释30倍后喷施于鸭粪和猫砂的上方，24h氨气去除率可达83％以上，硫化氢去除率可达73％以上，感官臭味也大大降低，除臭持久；2)该菌株对于垃圾渗滤液、动物粪便产生的恶臭有较好的去除作用，同时该菌株可以对垃圾渗滤液中的有害有机物进行分解，减少恶臭的产生，并容易定植，除臭持久。
本发明还要求保护包含上述哈尔滨乳杆菌的微生物除臭剂。
进一步，所述微生物除臭剂还包含植物乳杆菌或巴斯德毕赤酵母(又称毕赤酵母Pichia pastoris，以下简称毕赤酵母)中的一种或两种的复配。
进一步，当仅包含哈尔滨乳杆菌和植物乳杆菌时，哈尔滨乳杆菌与植物乳杆菌的活菌数之比为1:(0.8-1.2)；当仅包含哈尔滨乳杆菌和毕赤酵母时，哈尔滨乳杆菌与毕赤酵母的活菌数之比为1:(0.2-0.3)，当包含哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和毕赤酵母时，哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和毕赤酵母的活菌数之比为1:(0.1-3):(0.05-1)。
进一步，当包含哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和毕赤酵母时，哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和毕赤酵母的活菌数之比为1:(0.3-2.25):(0.08-0.7)，最优选1:0.75:0.083。
进一步，所述微生物除臭剂中的活菌量不低于10×108CFU/ml，优选(10-50)×108CFU/ml。
本发明微生物除臭剂中所选用的菌株特性及功能如下：
(1)哈尔滨乳杆菌和植物乳杆菌的生长过程中会分泌乳酸菌素，产生有机酸、酒精和二氧化碳等，可与挥发性脂肪酸、氨气和硫化氢等常见臭味因子发生反应进而将其降解掉，并显著抑制有害菌的生长，从而减少恶臭物质的产生；
(2)毕赤酵母能迅速消耗环境中的游离氧，促进乳杆菌的生长，分解利用环境中的糖类、硫化氢、氨气等，代谢过程中产生的酸性物质，可有效抑制有害微生物生长并具有抑制有机物急剧腐败分解的作用；
(3)毕赤酵母的菌体可作为其他复合菌的营养物质，有利于复合菌群的快速增殖。
本发明提供的微生物除臭剂的有益效果为：
(1)将特定比例的微生物除臭剂稀释30倍后喷施于鸭粪和猫砂上方，24h氨气去除率可达93％以上，硫化氢去除率可达85％以上；
(2)两种或三种菌株之间协同配合发挥作用，拓宽了可处理污染物的种类，且除臭效果明显优于单一菌株，效果更稳定，除臭效果持久。
(3)菌种数量少，成本低，仅包含两至三种菌种，且植物乳杆菌可选自市场上任一厂家的产品，毕赤酵母也可购买到，可合理控制成本。
本发明还要求保护上述微生物除臭剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)扩大培养：将哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和毕赤酵母进行扩大培养，得到各菌株的培养液；
(2)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，分别将步骤(1)所得的哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和毕赤酵母的培养液按照5-10vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃、转速150-300rpm，哈尔滨乳杆菌和植物乳杆菌在通气比为1:(0.5-0.8)的条件下发酵，毕赤酵母在通气比为1:(1-2)的条件下发酵，待pH＜4时停止发酵，得各菌株的发酵液；
(3)制备微生物除臭剂：将步骤(2)所得的各菌株的发酵液与其他组分分别按体积比混合灌装，即得微生物除臭剂。
优选的，所述微生物除臭剂的制备方法包括如下步骤：
(1)一级种子培养：无菌条件下，分别取哈尔滨乳杆菌和植物乳杆菌接种于MRS培养基中，毕赤酵母接种于YPD培养基中，于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-48h，得到各菌株的一级种子培养液；
(2)二级种子培养：无菌条件下，分别将哈尔滨乳杆菌和植物乳杆菌的一级种子培养液按照1-5vol％的接种量接种于MRS培养基中，毕赤酵母的一级种子培养液按照1-5vol％的接种量接种于YPD培养基中，于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-48h，得到各菌株的二级种子培养液；
(3)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，分别将步骤(2)所得的哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和毕赤酵母的二级种子培养液按照5-10vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃、转速150-300rpm，哈尔滨乳杆菌和植物乳杆菌在通气比为1:(0.5-0.8)的条件下发酵，毕赤酵母在通气比为1:(1-2)的条件下发酵，待pH＜4时停止发酵，得各菌株的发酵液；
(4)制备微生物除臭剂：将步骤(3)所得的各菌株的发酵液及其他组分按体积比混合灌装，即得微生物除臭剂。
本发明中所述的通气比是指每分钟内通入发酵罐的空气体积与发酵液总体积之比。
所述MRS培养基的组成为：10g蛋白胨、5g牛肉粉、4g酵母粉、2g葡萄糖、1ml吐温80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰、15g琼脂粉、1000ml蒸馏水；YPD培养基(又称酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)的组成为：1wt％酵母膏、2wt％蛋白胨、2wt％葡萄糖，溶剂为蒸馏水。
进一步，所述哈尔滨乳杆菌和植物乳杆菌的发酵培养基组成为：碳源40-60g/L、氮源15-30g/L、K+0.5-1.2g/L、Mg2+0.1-0.2g/L，溶剂为水，pH＝6～7；所述毕赤酵母的发酵培养基组成为：碳源10-30g/L、氮源20-40g/L、K+0.5-1.2g/L、Mg2+0.1-0.2g/L，溶剂为水，pH＝6～7。
优选的，所述K+的来源为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸钾、氯化钾、硝酸钾中的一种或多种，所述Mg2+的来源为硫酸镁、氯化镁中的一种或多种。
进一步，所述碳源选自葡萄糖、红糖、糖蜜中的一种或多种的复配。
进一步，所述氮源选自酵母粉、蛋白胨、硫酸铵或牛肉粉中的一种或多种的复配。
本发明还要求保护使用上述哈尔滨乳杆菌的活化液或微生物除臭剂去除环境中臭味的方法，包括向环境中喷洒哈尔滨乳杆菌的活化液或微生物除臭剂的步骤。
本发明还要求保护上述的哈尔滨乳杆菌和微生物除臭剂在除臭领域的应用。
优选的，所述哈尔滨乳杆菌和微生物除臭剂用于去除氨气和硫化氢，更优选的，用于去除垃圾渗滤液、动物粪便所产生的氨气和硫化氢。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：哈尔滨乳杆菌的筛选分离与鉴定
1、菌株的筛选分离
采集河南省商丘市某垃圾填埋场的垃圾渗滤液，采用梯度稀释法将该污水稀释至10-2、10-3和10-4，分别吸取各稀释液100μl至MRS培养基，涂布均匀后倒置于30℃条件下培养，约48h长出单菌落。挑选形态相异的单菌落转接至试管斜面分离培养基上，30℃条件下培养约48h，然后转移至4℃冰箱中保藏备用。
按上述分离方法共得到5株菌株，分别编号为：MD-1、MD-2、MD-3、MD-4和MD-5。
2、初筛效果评价
无菌环境中，将初筛得到的5株菌株分别挑取1环接种于盛有100ml MRS培养基的250ml三角瓶中，30℃、220rpm条件下培养48h，进行活化。
室温条件下，将50-100μl的氨水加入到1L实验瓶中，密封后进行磁子搅拌，使气体混合均匀，搅拌1h后，用氨气检测仪测其氨气浓度；然后分别加入筛选出的5株菌的活化液约1ml，用喷壶喷到试剂瓶中，密封，进行磁子搅拌，使气体混合均匀，搅拌1h后测其氨气浓度。设置1组对照组，用无菌水代替活化液作为对照组，各实验组设置3个平行，结果如表1所示。
表1.各菌株去除氨气的效果
根据表1的检测结果可知，与其他菌株相比，MD-1菌株在处理氨气方面表现出巨大的优势，1h处理氨气效率可达82％，除氨能力强。
3、菌株的检测鉴定
MD-1菌株的菌种斜面经过16S rDNA基因序列检测鉴定，其16S rDNA序列如SEQ IDNo:1所示，将测序结果在NCBI中比对，选择相似度最大的序列作为物种鉴定结果，鉴定结果为lactobacillus harbinensis哈尔滨乳杆菌。
实施例2：不同菌剂配方的效果评价
无菌条件下分别取哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和毕赤酵母接种于100ml MRS培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，得到各菌株的活化液，所得哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌、毕赤酵母活化液的活菌数分别为50×108cfu/ml、60×108cfu/ml、12×108cfu/ml，实施例2中所使用的植物乳杆菌购自山东吉驰生物工程有限公司，货号026，毕赤酵母购自宁波明舟生物科技有限公司，货号：BMZ131975。
室温条件下，将50-100μl的氨水加入到1L实验瓶中，密封后进行磁子搅拌，使气体混合均匀，搅拌1h后，用氨气检测仪测其氨气浓度；然后分别加入不同配方的菌株活化液约1ml，用喷壶喷到试剂瓶中，密封，进行磁子搅拌，使气体混合均匀，搅拌1h后采用氨气检测仪测其氨气浓度。设置1组对照组，用无菌水代替活化液作为对照组，各实验组设置3个平行。具体实验安排如下：
对照组：加无菌水；
实验组1：哈尔滨乳杆菌；
实验组2：植物乳杆菌；
实验组3：毕赤酵母；
实验组4：哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌；
实验组5：哈尔滨乳杆菌、毕赤酵母；
实验组6：植物乳杆菌、毕赤酵母；
实验组7：哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌、毕赤酵母；
实验组4-7中的各配方均为不同种类菌株活化液的等体积配制，最终复配得到复合菌剂的活菌量均为10×108-50×108cfu/ml，结果如表2所示。
表2.各菌剂去除氨气的效果
由表2中的结果可知，各实验组菌剂均有一定的除氨效果，其中不含哈尔滨乳杆菌的实验组2、3和6的效果较差，可见哈尔滨乳杆菌在菌剂作用中的重要性，含三个菌种的实验组7的效果最佳，1h处理氨气效率可达97％，实验组1、4和5的氨气处理效果也很优异，1h的氨气处理效率分别为80％、86％和89％，哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和毕赤酵母的单个菌种的活化液处理氨气的效率明显低于复合菌剂，由此可见，各菌株之间发挥了协同配合作用。
实施例3：菌剂配方中各菌种不同比例的效果评价
无菌条件下分别取哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌、毕赤酵母接种于100ml MRS培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，得到各菌株的活化液，哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌、毕赤酵母的活化液活菌数分别为80×108cfu/ml、60×108cfu/ml和10×108cfu/ml，实施例3中所使用的植物乳杆菌购自山东吉驰生物工程有限公司，货号030，毕赤酵母购自宁波明舟生物科技有限公司，货号：BMZ131975。
室温条件下，将50-100μl的氨水加入到1L实验瓶中，密封后进行磁子搅拌，使气体混合均匀，搅拌1h后，用氨气检测仪测其氨气浓度；然后分别加入三种菌株活化液以不同比例复配的微生物除臭剂约1ml，用喷壶喷到试剂瓶中，密封，进行磁子搅拌，使气体混合均匀，搅拌1h后测其氨气浓度。设置1组对照组，用无菌水代替活化液作为对照组，各实验组设置3个平行。
具体实验安排如下：
对照组：加无菌水；
实验组1：哈尔滨乳杆菌33.3％、植物乳杆菌33.3％、毕赤酵母33.3％；
实验组2：哈尔滨乳杆菌25％、植物乳杆菌25％、毕赤酵母50％；
实验组3：哈尔滨乳杆菌34％、植物乳杆菌17％、毕赤酵母49％；
实验组4：哈尔滨乳杆菌11％、植物乳杆菌33％、毕赤酵母56％；
实验组5：哈尔滨乳杆菌37.5％、植物乳杆菌37.5％、毕赤酵母25％；
实验组1-5中的各微生物除臭剂均为三种菌株的活化液按体积比配制，最终复配得到各微生物除臭剂的活菌量均为10×108-50×108cfu/ml，结果如表3所示。
表3.各微生物除臭剂去除氨气的效果
由表3中的结果可知，各实验组的微生物除臭剂均有一定的除氨效果，1h氨气的处理效率为92-98％，其中实验组5由三个菌种复配的微生物除臭剂效果最佳。
实施例4：微生物除臭剂用于垃圾渗滤液除臭
1、微生物除臭剂的制备
1)一级种子液培养：无菌条件下分别取哈尔滨乳杆菌和植物乳杆菌接种于MRS培养基中，毕赤酵母接种于YPD培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，得到各菌株的一级种子培养液；
2)二级种子液培养:无菌条件下分别将哈尔滨乳杆菌和植物乳杆菌的一级种子培养液按照1vol％的接种量接种于MRS培养基中，毕赤酵母的一级种子培养液按照1vol％的接种量接种于YPD培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养24h，得到各菌株的二级种子培养液；
3)发酵：在3个发酵罐中分别装入总体积60％的发酵培养基，待发酵培养基消毒完毕后，分别将步骤(2)所得的哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和毕赤酵母的二级种子培养液按照5vol％的接种量接种于3个发酵培养基中。哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌的发酵条件是：控制温度为25-35℃，通气比为1:(0.5-0.8)，转速150-300rpm，发酵24-48h，待pH＜4停止发酵；毕赤酵母的发酵条件是：控制温度为25-35℃，通气比为1:(1-2)，转速150-300rpm的条件下发酵，发酵24-36h，待pH＜4停止发酵，将上述发酵液按合适体积比进行混合后得微生物除臭剂，哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌、毕赤酵母的发酵液活菌数分别为65×108cfu/ml、78×108cfu/ml、16×108cfu/ml。实施例4中所使用的植物乳杆菌购自山东吉驰生物工程有限公司，货号026，毕赤酵母购自宁波明舟生物科技有限公司，货号：BMZ131975。
所述哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌的发酵培养基组成为：糖蜜50g/L、酵母粉20g/L、K+0.5-1.2g/L、Mg2+0.1-0.2g/L，其余为水；毕赤酵母的发酵培养基为：葡萄糖20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L，K+0.5-1.2g/L、Mg2+0.1-0.2g/L，其余为水。
2、实验设计与安排：
垃圾渗滤液的除臭：室温条件下，将10-20ml的垃圾渗滤液加入到1L实验瓶中，密封后静置，使气体混合均匀，1h后用氨气硫化氢检测仪测其氨气、硫化氢浓度；然后分别加入单一的哈尔滨乳杆菌活化液及微生物除臭剂约1ml，用喷壶喷到试剂瓶中，密封，定期测其氨气、硫化氢浓度。
设置1组对照组，用无菌水代替活化液作为对照组，设置4个实验组，其中3个微生物除臭剂和一个哈尔滨乳杆菌活化液，各实验组各设置3个平行。
3个实验组的微生物除臭剂由各菌株的活化液按如下体积比组成：
微生物除臭剂1：哈尔滨乳杆菌50％、植物乳杆菌50％；
微生物除臭剂2：哈尔滨乳杆菌50％、毕赤酵母50％；
微生物除臭剂3：哈尔滨乳杆菌37.5％、植物乳杆菌37.5％、毕赤酵母25％；
哈尔滨乳杆菌活化液的制备方法同实施例3。
为测试除臭效果，每次测试从感官上进行判断(恶臭“++++”，较臭“+++”，微臭“++”，无明显臭感“+”)
3、实验结果
表4.垃圾渗滤液中氨气的处理效果
表5.垃圾渗滤液中硫化氢的处理效果
表6.垃圾渗滤液中的臭味去除效果
由上述实验结果可见，本发明提供的微生物除臭剂及单一的哈尔滨乳杆菌活化液对于垃圾渗滤液都具有较好的除臭效果，但微生物除臭剂较单一的哈尔滨乳杆菌活化液除臭效果更好，哈尔滨乳杆菌活化液24h除氨气、硫化氢的效率分别为83％、70％，而微生物除臭剂3效果最优，24h除氨气、硫化氢的效率分别为98％、96％，所以微生物除臭剂见效快且持久，而且由于使用了微生物除臭剂，不仅氨气、硫化氢的处理效率高，并且通过感官评价，还能闻到类似酿酒的味道。
实施例5：微生物除臭剂用于鸭粪除臭
1、微生物除臭剂的制备
1)一级种子液培养：无菌条件下分别取哈尔滨乳杆菌和植物乳杆菌接种于MRS培养基中，毕赤酵母接种于YPD培养基中，于25℃、150rpm的条件下培养48h，得到各菌株的一级种子培养液；
2)二级种子液培养:无菌条件下分别将哈尔滨乳杆菌和植物乳杆菌的一级种子培养液按照5vol％的接种量接种于MRS培养基中，毕赤酵母的一级种子培养液按照5vol％的接种量接种于YPD培养基中，于25℃、150rpm的条件下培养48h，得到各菌株的二级种子培养液；
3)发酵：在3个发酵罐中分别装入总体积60％的发酵培养基，待发酵培养基消毒完毕后，分别将步骤(2)所得的哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和毕赤酵母的二级种子培养液按照5vol％的接种量接种于3个发酵培养基中。哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌的发酵条件是：控制温度为25-35℃，通气比为1:(0.5-0.8)，转速150-300rpm，发酵24-48h，待pH＜4停止发酵；毕赤酵母的发酵条件是：控制温度为25-35℃，通气比为1:(1-2)，转速150-300rpm的条件下发酵，发酵24-36h，待pH＜4停止发酵，将上述发酵液按合适体积比进行混合后得液体的微生物除臭剂，哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌、毕赤酵母的发酵液活菌数分别为75×108cfu/ml、60×108cfu/ml、15×108cfu/ml，实施例5中所使用的植物乳杆菌购自山东吉驰生物工程有限公司，货号030，毕赤酵母购自宁波明舟生物科技有限公司，货号：BMZ131975。
所述哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌的发酵培养基组成为：糖蜜40g/L、酵母粉30g/L、K+0.5-1.2g/L、Mg2+0.1-0.2g/L，其余为水；毕赤酵母的发酵培养基为：葡萄糖10g/L、牛肉粉20g/L、K+0.5-1.2g/L、Mg2+0.1-0.2g/L，其余为水。
2、实验安排与设计
鸭粪的除臭：室温条件下，将1～2g的鸭粪(取自河北某养鸭场，鸭粪已同稻壳混合在一起)加入到1L实验瓶中，密封后静置，使气体混合均匀，1h后用氨气硫化氢检测仪测其氨气、硫化氢浓度；
设置1组对照组，用无菌水代替活化液作为对照组，设置4个实验组，其中3个微生物除臭剂和一个哈尔滨乳杆菌活化液，各实验组各设置3个平行。
3个实验组的微生物除臭剂由各菌株的发酵液按如下体积比组成：
微生物除臭剂1：哈尔滨乳杆菌50％、植物乳杆菌50％；
微生物除臭剂2：哈尔滨乳杆菌50％、毕赤酵母50％；
微生物除臭剂3：哈尔滨乳杆菌37.5％、植物乳杆菌37.5％、毕赤酵母25％；
哈尔滨乳杆菌活化液的制备方法同实施例3，将微生物除臭剂1-3及哈尔滨乳杆菌活化液用自来水稀释30倍后，分别将约1ml用喷壶喷到实验瓶中，密封，定期测其氨气、硫化氢浓度。
为测试除臭效果，每次测试从感官上进行判断(恶臭“++++”，较臭“+++”，微臭“++”，无明显臭感“+”)
表7.鸭粪中的氨气处理效果
表8.鸭粪中的硫化氢处理效果
表9.鸭粪中的臭味去除效果
由上述结果可知，本发明提供的微生物除臭剂及单一的哈尔滨乳杆菌活化液对于鸭粪都具有较好的除臭效果，但微生物除臭剂较单一的哈尔滨乳杆菌除臭效果更好，哈尔滨乳杆菌24h除氨气、硫化氢的效率分别为82％、73％，微生物除臭剂3效果最优，24h除氨气、硫化氢的效率分别为93％、85％，所以微生物除臭剂见效快且持久。
实施例6：微生物除臭剂用于猫砂除臭
1、微生物除臭剂的制备
1)一级种子液培养：无菌条件下分别取哈尔滨乳杆菌和植物乳杆菌接种于MRS培养基中，毕赤酵母接种于YPD培养基中，于35℃、300rpm的条件下培养12h，得到各菌株的一级种子培养液；
2)二级种子液培养：无菌条件下分别将哈尔滨乳杆菌和植物乳杆菌的一级种子培养液按照2.5vol％的接种量接种于MRS培养基中，毕赤酵母的一级种子培养液按照2.5vol％的接种量接种于YPD培养基中，于35℃、300rpm的条件下培养12h，得到各菌株的二级种子培养液；
3)发酵：在3个发酵罐中分别装入总体积60％的发酵培养基，待发酵培养基消毒完毕后，分别将步骤(2)所得的哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和毕赤酵母的二级种子培养液按照10vol％的接种量接种于3个发酵培养基中。哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌的发酵条件是：控制温度为25-35℃，通气比为1:(0.5-0.8)，转速150-300rpm，发酵24-48h，待pH＜4停止发酵；毕赤酵母的发酵条件是：控制温度为25-35℃，通气比为1:(1-2)，转速150-300rpm的条件下发酵，发酵24-36h，待pH＜4停止发酵，将上述发酵液按合适体积比进行混合后得液体的微生物除臭剂，哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌、毕赤酵母的发酵液活菌数分别为68×108cfu/ml、70×108cfu/ml、18×108cfu/ml，实施例6中所使用的植物乳杆菌购自山东吉驰生物工程有限公司，货号026，毕赤酵母购自宁波明舟生物科技有限公司，货号：BMZ131975。
所述哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌的发酵培养基组成为：红糖20g/L、葡萄糖40g/L、酵母粉15g/L、K+0.5-1.2g/L、Mg2+0.1-0.2g/L，其余为水；毕赤酵母的发酵培养基为：葡萄糖30g/L、酵母粉20g/L、硫酸铵20g/L，K+0.5-1.2g/L、Mg2+0.1-0.2g/L，其余为水。
2、实验安排与设计
猫砂的除臭：室温条件下，将1～2g的猫砂(取自宠物猫用过的猫砂)加入到1L实验瓶中，密封后静置，使气体混合均匀，1h后用氨气硫化氢检测仪测其氨气、硫化氢浓度；
设置1组对照组，用无菌水代替活化液作为对照组，设置4个实验组，其中3个微生物除臭剂和一个哈尔滨乳杆菌活化液，各实验组各设置3个平行。
3个实验组的微生物除臭剂由各菌株的发酵液按如下体积比组成：
微生物除臭剂1：哈尔滨乳杆菌50％、植物乳杆菌50％；
微生物除臭剂2：哈尔滨乳杆菌50％、毕赤酵母50％；
微生物除臭剂3：哈尔滨乳杆菌37.5％、植物乳杆菌37.5％、毕赤酵母25％；
哈尔滨乳杆菌活化液的制备方法同实施例3，将微生物除臭剂1-3及哈尔滨乳杆菌活化液用自来水稀释30倍后，分别将约1ml用喷壶喷到实验瓶中，密封，定期测其氨气、硫化氢浓度。
为测试除臭效果，每次测试从感官上进行判断(恶臭“++++”，较臭“+++”，微臭“++”，无明显臭感“+”)
表10.猫砂中的氨气处理效果
表11.猫砂中的硫化氢处理效果
表12.猫砂中的臭味去除效果
由上述结果可知，本发明提供的微生物除臭剂及单一的哈尔滨乳杆菌对于猫砂都具有较好的除臭效果，但微生物除臭剂较单一的哈尔滨乳杆菌除臭效果更好，单一哈尔滨乳杆菌24h除氨气、硫化氢的效率分别为86％、78％，微生物除臭剂3效果最优，24h除氨气、硫化氢的效率分别为93％、95％，且臭味明显感觉不到，说明该微生物除臭剂的除臭效果好，持久性好。
综上，本发明提供的哈尔滨乳杆菌无论单独使用还是与植物乳杆菌、毕赤酵母复配混合使用，都对产生恶臭的氨气和硫化氢气体具有非常好的处理作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛蔚蓝赛德生物科技有限公司
<120> 一种哈尔滨乳杆菌、包含其的微生物除臭剂及二者的应用
<130> 2
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1473
<212> DNA
<213> 哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis)
<400> 1
agggcgggtg ctataatgca gtcgaacgag gtttggtcag tttgcggtgg tgcttgcatc 60
accaattacc gatcaaaccg agtggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgccctt 120
cagcagggga taacatttgg aaacagatgc taataccgta taaccacgga gaccgcatgg 180
tctccgggta aaagatggcg caagctatca ctgaaggatg gacccgcggc gtattagcca 240
gttggtgggg taacggccta ccaaagcgat gatacgtagc cgacctgaga gggtaatcgg 300
ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 360
acaatggacg caagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggctt tcgggtcgta 420
aaactctgtt attgaagaag aacgtgtgtg acagtaactg gtcatgcagt gacggtattc 480
aatcagaaag tcacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 540
ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagt gcaggcggtc ttttaagtct gatgtgaaag 600
ccttcggctt aaccgaagaa gggcatcgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaga 660
gtggaactcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag 720
gcggctctct ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc gtgggtagca aacaggatta 780
gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gaatactaag tgttggaggg tttccgccct 840
tcagtgctgc agctaacgca ttaagtattc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa 900
ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa 960
cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatct tctgccaggc tgagagatca gctgttccct 1020
tcggggacag aatgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1080
ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatg atcagttgcc agcattcagt tgggcactct 1140
ggtcagactg ccggtgacaa accggaggaa ggcggggatg acgtcaaatc atcatgcccc 1200
ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat gggtggtaca acgagcagcg agaccgcgag 1260
gtcaagcgaa tctctaaaaa ccatcctcag ttcggattgc aggctgcaac tcgcctgcat 1320
gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1380
tgtacacacc gcccgtcaca ccatgagagt ttgtaacacc caaagccggt gagacaaccg 1440
caaggagtca gccgtctaag gtcacaaagt atg 1473

Claims (14)

1.一种哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis)，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.24253。
2.一种微生物除臭剂，其特征在于，有效成分包含权利要求1所述的哈尔滨乳杆菌。
3.根据权利要求2所述的微生物除臭剂，其特征在于，有效成分还包含植物乳杆菌或巴斯德毕赤酵母中的一种或两种的复配。
4.根据权利要求3所述的微生物除臭剂，其特征在于，当仅包含哈尔滨乳杆菌和植物乳杆菌时，所述哈尔滨乳杆菌与植物乳杆菌的活菌数之比为1:(0.8-1.2)，当仅包含哈尔滨乳杆菌和巴斯德毕赤酵母时，所述哈尔滨乳杆菌与巴斯德毕赤酵母的活菌数之比为1:(0.2-0.3)，当包含哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和巴斯德毕赤酵母时，所述哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和巴斯德毕赤酵母的活菌数之比为1:(0.1-3):(0.05-1)。
5.根据权利要求4所述的微生物除臭剂，其特征在于，当包含哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和巴斯德毕赤酵母时，所述哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和巴斯德毕赤酵母的活菌数之比为1:(0.3-2.25):(0.08-0.7)。
6.根据权利要求5所述的微生物除臭剂，其特征在于，当包含哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和巴斯德毕赤酵母时，所述哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和巴斯德毕赤酵母的活菌数之比为1:0.75:0.083。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的微生物除臭剂，其特征在于，所述微生物除臭剂中的活菌量不低于10×108CFU/ml。
8.根据权利要求7所述的微生物除臭剂，其特征在于，所述微生物除臭剂中的活菌量为(10-50)×108CFU/ml。
9.权利要求3-8中任一项所述的微生物除臭剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)扩大培养：将哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和巴斯德毕赤酵母进行扩大培养，得到各菌株的培养液；
(2)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，分别将步骤(1)所得的哈尔滨乳杆菌、植物乳杆菌和巴斯德毕赤酵母的培养液按照5-10vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃、转速150-300rpm，哈尔滨乳杆菌和植物乳杆菌在通气比为1:(0.5-0.8)的条件下发酵，巴斯德毕赤酵母在通气比为1:(1-2)的条件下发酵，待pH＜4时停止发酵，得各菌株的发酵液；
(3)制备微生物除臭剂：将步骤(2)所得的各菌株的发酵液与其他组分分别按体积比混合灌装，即得微生物除臭剂。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，
所述哈尔滨乳杆菌和植物乳杆菌的发酵培养基组成为：碳源40-60g/L、氮源15-30g/L、K+0.5-1.2g/L、Mg2+0.1-0.2g/L，溶剂为水，pH＝6～7；
所述巴斯德毕赤酵母的发酵培养基组成为：碳源10-30g/L、氮源20-40g/L、K+0.5-1.2g/L、Mg2+0.1-0.2g/L，溶剂为水，pH＝6～7；
所述碳源选自葡萄糖、红糖、糖蜜中的一种或多种的复配；
所述氮源选自酵母粉、蛋白胨、硫酸铵或牛肉粉中的一种或多种的复配。
11.一种使用权利要求1所述的哈尔滨乳杆菌的活化液或权利要求2-8中任一项所述的微生物除臭剂去除环境中臭味的方法，包括向环境中喷洒所述哈尔滨乳杆菌的活化液或微生物除臭剂的步骤，所述活化液为无菌条件下取哈尔滨乳杆菌接种于100ml MRS培养基中，于30℃、180rpm的条件下培养24h得到。
12.权利要求1所述的哈尔滨乳杆菌和权利要求2-8中任一项所述的微生物除臭剂在除臭领域的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述哈尔滨乳杆菌和微生物除臭剂用于去除氨气和硫化氢。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述哈尔滨乳杆菌和微生物除臭剂用于去除垃圾渗滤液、动物粪便所产生的氨气和硫化氢。
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家禽粪便除臭复合菌剂的应用研究;周美君;杨绍斌;;湖北农业科学(第22期);第71-75页 *
猪粪除臭菌的筛选、复配以及培养条件的优化;韩保安;凌超;李扬;鲍大林;赵鸿涛;胡子全;赵海泉;;家畜生态学报(第12期);第61-67页 *

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CN114395515A (zh) 2022-04-26

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