CN109504617B - 一种哈尔滨乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种哈尔滨乳杆菌及其应用。该哈尔滨乳酸菌(Lactobacillus harbinensis M1)的保藏号为GDMCC No.60305，保藏于广东省微生物菌种保藏中心；本发明保护该哈尔滨乳酸菌作为益生菌的应用。哈尔滨乳酸菌对抗生素氨苄西林、四环素和氯霉素等敏感，安全性符合EFSA的要求，其上清液对单增李斯特菌、溶血链球菌以及金黄色葡萄球菌等抑制效果显著。本发明还保护哈尔滨乳酸菌在发酵豆乳中的应用；利用该菌株单独发酵豆乳产酸能力强、活菌数高，豆腥味物质含量降低甚至完全消失，发酵牛奶特征性香气成分含量明显提升，极大地改善了发酵豆乳的感官风味，是大豆等富含植物低聚糖基质的优选发酵剂。

Description

一种哈尔滨乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及益生菌应用领域，具体涉及一种哈尔滨乳酸菌(Lactobacillusharbinensis M1)及其应用，该哈尔滨乳酸菌可以作为益生菌，并可以作为发酵剂应用于发酵豆乳中。
背景技术
益生菌是指给予一定数量(通常在106CFU/g以上)时能对宿主健康产生有益作用的活的微生物。只有那些能耐受胃肠道消化、能粘附和定植在小肠上皮细胞，并能抑制病源微生物生长的微生物才能对宿主健康发挥有益作用。常用益生菌主要包括乳杆菌类、双歧杆菌类和革兰阳性球菌类，如嗜热链球菌等，其益生功能主要体现在增强免疫力、调节肠道菌群和改善胃肠道功能、抗氧化和延缓衰老、降低胆固醇和改善血脂等方面。
大豆含有丰富的优质蛋白、不饱和脂肪酸以及低聚糖、异黄酮和皂苷等功能性成分，具有环境友好、健康经济等特点，是我国传统意义上重要的植物蛋白资源，具有重要的经济价值和社会价值。应用益生菌发酵大豆所制备的大豆蛋白饮品不仅含有大量活的益生菌，还通过生物转化作用使异黄酮成为易于吸收的苷元型、使大豆蛋白降解形成多肽和氨基酸，同时生成γ-氨基丁酸、B族维生素等功能因子，因此益生菌发酵豆乳正受到食品科学工作者和现代消费者的广泛关注。但该类产品目前还存在一些感官品质上的缺陷，如与发酵牛乳相比，益生菌发酵豆乳在口感和风味方面还有较大的差距，其中豆腥味比较突出，严重影响了产品的可接受性，制约了其产业化应用。
大豆食品的豆腥味主要来自于脂肪氧化酶催化生成的正己醛、壬醛、1-辛烯-3-醇等挥发性的脂肪氧化降解产物，目前主要有灭酶、氧隔离和生物转化等处理方法来降低该不良风味。其中，应用益生菌发酵降低豆腥味的效果与菌种关系密切。由于现有商业化应用的乳酸菌大多数来源于发酵乳制品，将这些菌种应用于发酵豆乳时往往适应性不佳，主要体现在发酵性不好和产品风味不良。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术存在的问题，提供一种适用于发酵食品，特别是发酵大豆食品的哈尔滨乳酸菌(Lactobacillus harbinensis)M1，该菌株具有很好的安全性和益生功能，并能够有效利用大豆中的各种低聚糖，显著改善和提高豆类食品的感官风味。
豆腐黄浆水是豆腐制作过程中产生的黄色沥水，由于黄浆水中仍然含有丰富的营养物质，非常适宜于微生物的生长和繁殖，因此在存放的过程中会自然酸化。我国部分地方，有利用酸浆水作凝固剂制备豆腐的习惯，由于这种酸浆豆腐滋味鲜美、风味独特，近年来受到了越来越多消费者的喜爱。酸浆水中的微生物由于长期的训化，对豆类成分如棉子糖、水苏糖和异黄酮等具有很强的利用能力，且具有良好的风味。本发明在深入研究豆腐酸浆水的基础上，筛选到1株在大豆基质中发酵性能优良的哈尔滨乳杆菌，该菌株具有潜在益生功能及重要的应用价值。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种哈尔滨乳酸菌(Lactobacillus harbinensis M1)，该菌株的保藏号为GDMCCNo.60305，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地点为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2017年12月20日。
所述哈尔滨乳酸菌作为益生菌的应用。
所述哈尔滨乳酸菌对抗生素氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素敏感，安全性符合EFSA的要求。
所述哈尔滨乳酸菌的上清液对单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌、溶血链球菌以及金黄色葡萄球菌抑制效果显著。
所述哈尔滨乳酸菌对胃液、肠液及胆盐的耐受，可定植在小肠上皮细胞上。
所述哈尔滨乳酸菌在发酵豆乳中的应用。
所述哈尔滨乳酸菌对蔗糖、水苏糖和棉籽糖的利用率与对葡萄糖的利用率相当。
所述哈尔滨乳酸菌使豆乳中的豆腥味成分正己醛完全消失。
所述哈尔滨乳酸菌增加了牛奶香气成分丁二酮和乙偶姻。
本发明中哈尔滨乳酸菌(Lactobacillus harbinensis M1)是使用无菌采样瓶现场采集自然发酵而成的酸浆水样品，通过稀释平板法筛选获得。该菌株的生物活性特征如下：在MRS固体培养基平板上菌落突起，呈圆形，直径一般为1-3mm，灰白色，不透明，湿润光滑；菌体为革兰氏染色阳性无芽孢杆菌，呈细短杆状，成对或堆状排列；葡萄糖异型发酵，生长温域宽(20-45℃可正常生长)，生长速度快；常规生理生化实验结果表明菌株M1为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、非运动性。进一步对16S rDNA序列进行分析，并通过BLAST比对，鉴定其为哈尔滨乳酸菌(Lactobacillus harbinensis)。
本发明中哈尔滨乳杆菌M1符合益生菌特性，该菌株在模拟胃液以及模拟肠液中显示出较好的耐受性，并且能够粘附于小肠上皮细胞Caco-2。该菌株能够有效抑制食源性致病菌如单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌、溶血链球菌以及金黄色葡萄球菌等的繁殖。同时，该菌株的生长能够有效利用蔗糖、水苏糖和棉籽糖，适用于发酵富含植物低聚糖食品的生产。利用该菌株制备的发酵豆乳具有较高的活菌数和酸度，且挥发性风味成分中豆腥味成分降低，牛奶香气成分丁二酮和乙偶姻增加，有效地提升了产品的感官风味。
本发明相对于已有的商业菌株，具有以下的优点和有益效果：
(1)本发明菌株Lactobacillus harbinensis M1对胃肠道有很好的耐受性，能活着到达小肠并在上皮细胞上粘附与定植，且对多种食源性致病菌有很强的抑制作用，具有在肠道中成为优势菌的潜力，可以为宿主提供良好的益生效应。
(2)本发明菌株对棉子糖、水苏糖、蔗糖等低聚糖的利用率非常高，能够在大豆等富含此类低聚糖的植物性原料中生长繁殖，为发酵大豆等植物类食品的生产提供了新的适应性菌种。
(3)本发明菌株能够降低发酵豆乳中正己醛、壬醛、1-辛烯-3-醇等豆腥味物质含量，增加丁二酮和乙偶姻等香气成分，赋予发酵豆乳特有的奶香味，显著改善发酵豆乳感官风味。
(4)本发明菌株生长温域宽，生长速度快，培养条件简单，易于工业化生产和管理，开发应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明Lactobacillus harbinensisM1菌株的菌落形态图；
图2为本发明Lactobacillus harbinensisM1菌株的菌体形态图。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但实施例不对本发明保护范围构成任何限定。
以下实施例中：
(1)革兰氏染色、形状观察及常用生理生化鉴定培养基参考凌代文主编的《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》(1999年版)。
(2)改良MRS液体培养基(g/L)(用于乳酸菌的培养)：
牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖20g，吐温-80 1mL，K2HPO4·3H2O 2g，NaAc·3H2O 5g，柠檬酸三铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g；蒸馏水1L，pH 6.4±0.2(MRS固体培养基在液体培养基的基础上添加0.7-2％的琼脂)，121℃灭菌15min。
(3)耐药性分析
根据欧洲食品安全局规定的细菌耐药性判定标准(2012版)，采用抗生素氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素，配制浓度为5120μg/mL的抗菌药物贮存液，临用时按稀释液配制法稀释至所需浓度的使用液，并按比例加入到相应培养基中。将改良MRS琼脂培养基取9.0mL分装于大试管中在121℃灭菌15min后，置于水浴锅(50℃)中保温备用。吸取1.0mL抗菌药物稀释液于该大试管中，立即涡旋混匀，倒入无菌平皿中，待凝固，即制得一定药物浓度(μg/mL)的抑菌平板。每种药物都按照二倍稀释法制得8个浓度梯度的抑菌平板。同时制备不加药物的对照平板。分别蘸取菌悬液1μL(109CFU/mL)接种至平板表面于37℃恒温箱培养16-20小时，同时，用不接种的空白平皿作对照。观察琼脂平板上菌株不生长的临界浓度(MIC值)并做记录，实验设置3个平行。乳酸菌药敏结果的判定参照相关标准如下表1：
表1
Figure BDA0001836576770000041
(4)对胃液、肠液和胆盐的耐受性分析
胃肠液耐受性：取100mL三角瓶，加入50mL改良MRS液体培养基，121℃灭菌15min，冷却后接种乳酸菌，37℃培养过夜，作为种子培养液备用。模拟胃液：0.27g胃蛋白酶稀释于90mL无菌磷酸缓冲溶液PBS中，用盐酸调整pH至3，0.22μm一次性针头滤器过滤除菌备用。模拟肠液：0.1g胰蛋白酶稀释于100mL无菌磷酸缓冲溶液PBS中，采用氢氧化钠调整pH至8.0，0.22μm一次性针头滤器过滤除菌备用。把培养好的乳酸菌以109CFU/mL接种到模拟胃液(pH＝3)中，分别在0h-3h每小时取样用稀释涂布法计算活菌数；3小时后转接到模拟肠液(pH＝8)中，分别在0h-12h每小时取样用稀释涂布法计算活菌数，实验设置3个平行。
模拟胆盐耐受性：0.3g猪胆盐加入100mL改良MRS液体培养基，121℃灭菌15min，冷却至37℃。把培养好的乳酸菌以109CFU/mL接种到含0.3％猪胆盐的MRS液体培养基中，分别在0h-11h每小时取样在620nm下读取吸光值，实验设置3个平行。细菌的存活率计算公式如下：X(％)＝*100％
(5)牛津杯扩散法测试抑菌活性
将菌株用MRS培养基活化2-3代。致病菌用LB培养基活化2-3代后备用。10000r/min、4℃离心含菌株的MRS液体培养基5min，取上清液，分成两等份，一份不处理，另一份调pH至7.0。上清液均经0.22μm一次性针头滤器过滤，滤液抑菌活性检测采用牛津杯扩散法。将含1％致病菌(单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌、溶血链球菌以及金黄色葡萄球菌)悬液(108CFU/mL)倾倒入灭菌的平皿中，待其凝固后，用灭菌的牛津杯放置在琼脂平板上。将滤液60μL注射入牛津杯中，37℃培养24小时，记录抑菌圈大小，实验设置3个平行。
(6)对Caco-2细胞的粘附作用
将菌株接种到MRS培养基中，37℃培养24小时，离心收集菌体后，用无菌溶液洗涤两次，最后再重悬于溶液中，于600nm下测量吸光度，调整菌体浓度为109CFU/mL(OD600＝0.57)，离心(6000g,5min)，弃去上清液，加入与弃去等体积的无双抗的DMEM+10％牛血清，混匀。Caco-2细胞使用DMEM+10％胎牛血清为基础培养基，接种至细胞培养板中，于37℃、5％CO2培养10天。当细胞聚合度达90％-100％，用无菌PBS洗涤三次，加入上述1mL乳酸菌悬浮液(109CFU/mL)，于37℃、5％CO2培养2小时，用无菌PBS洗涤三次，用1mL胰酶进行消化，取样用稀释涂布法计算活菌数，实验设置3个平行。
(7)对低聚糖的利用
将乳酸菌分别接种到只含葡萄糖、蔗糖、水苏糖、棉籽糖的MRS培养基中，37℃培养24小时，在600nm下读取吸光值，实验设置3个平行。乳酸菌的相对生长率计算公式如下：
X(％)＝*100％
(8)发酵豆乳可滴定酸度分析
挑选无破损、未霉变的大豆，加入6倍质量的水，然后加入0.5％NaHCO3，搅匀，在常温下浸泡14h，加入85℃水，按照豆水比1:8(g:mL)进行热磨浆，经180目筛过滤得到纯豆浆，并于100℃下灭菌15min。按106CFU/mL加入单菌株发酵剂，放在37℃的恒温培养箱中发酵24h，然后于4℃下后熟24h，取样用稀释涂布法计算活菌数。酸度值按GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的测定》将样品用玻璃棒搅拌均匀，精确称取10g样品，再加入无CO2的蒸馏水20mL，混匀后加入0.5mL酚酞指示剂，用0.1N NaOH标准溶液滴定至溶液呈微红色，且30s内不褪色，记录消耗氢氧化钠的体积，实验设置3个平行。酸度的计算按照下面的公式：
X＝(C×V×100)/(m×0.1)
X——样品的酸度，单位oT；
C——氢氧化钠标液的浓度，单位mol/L；
V——消耗氢氧化钠标液的体积，单位mL；
m——样品的质量，单位g。
(9)固相微萃取-气质联用(SPME-GC/MS)分析挥发性芳香物质：50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取纤维头(SPME)于进样口(270℃)老化30min。称取5.0g发酵豆乳1:1与蒸馏水混合加入25mL顶空瓶中。加热温度40℃，加热平衡10min后，插入SPME针，吸附30min后插入GC/MS色谱仪进样口解析。气相色谱条件：进样口温度进样口温度300℃；升温程序：35℃保持2min后以5℃/min程序升温110℃，保8min，15℃/min程序升温至240℃，保持5min。分流比30:1；质谱条件：质谱接口温度250℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；离子化模式：EI；扫描模式：全扫描，质量数范围：33～400m/z；溶剂延迟：0.1min。
(10)感官风味评价：按9分制进行打分，1分为最差，9分表示最好。邀请30位品评员在20℃环境下对样品的气味、外观、滋味、质构和总体可接受性打分。
(11)阳性对照用干酪乳杆菌为Lactobacillus casei-01，丹麦科汉森股份有限公司样品。
实施例1：菌种筛选和鉴定
第一步采样和平板分离：使用无菌采样瓶，现场采集自然发酵而成的酸浆水，低温带回。立即使用无菌水分别稀释至10-3、10-4、10-5倍，涂布于改良的MRS固体培养基上。然后放入37℃的恒温培养箱中，培养48小时。挑取疑似菌落，进行平板划线分离，如此重复4～5次，直至获得纯的单菌落。将纯化的单菌落穿刺接种到MRS半固体培养基，于4℃冰箱内保存。
第二步形态观察和生理生化实验：该菌株在MRS培养基上的菌落呈圆形、灰白色、半透明状，湿润光滑(图1)；进行革兰氏染色和细胞形状观察，菌株M1的菌体呈短杆状，成对或堆生(见图2)。常规生理生化实验结果(见表2)表明菌株M1为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、异型发酵的无芽孢杆菌，能在20～45℃内的温域范围内生长。表2为本发明Lactobacillus harbinensisM1菌株的生理生化特性；
表2
Figure BDA0001836576770000071
第三步分子鉴定：将所得菌株M1活化培养，送专业的检测机构测序，获得16S rDNA序列(序列为SEQ.ID.NO1，见序列表)，结果在NCBI的基因库上进行比对，找出与此菌亲缘相近的标准菌株KT897917.1(Lactobacillus harbinensisstrain LH-1)，KF312693.1(Lactobacillus harbinensisstrain TCP001)和NR_113969.1(Lactobacillusharbinensisstrain NBRC100982)，将菌株M1的16S rDNA的部分序列与标准菌进行相似度分析，M1与哈尔滨乳杆菌Lactobacillus harbinensisstrain LH-1序列同源性超过98％(见表3)，应为同一种。结合菌落、菌体形态，生理生化特征将菌株鉴定为哈尔滨乳酸菌(Lactobacillus harbinensis)。
表3为本发明Lactobacillus harbinensisM1菌株根据16S rDNA序列所做的BLAST序列比对情况表。
表3
Figure BDA0001836576770000072
该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地点为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.60305，保藏日期为2017年12月20日。
实施例2：抗生素敏感性
第一步乳酸菌菌悬液制备：取100mL三角瓶，加入50mL改良MRS液体培养基，121℃灭菌15min，分别接种Lactobacillus harbinensisM1和Lactobacillus casei-01菌株，37℃培养过夜，置于4℃冰箱保存备用。
第二步抗性平板制备：采用抗生素氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素，配制浓度为5120μg/mL的抗菌药物贮存液，临用时按稀释液配制法稀释至所需浓度的稀释液。吸取1.0mL抗菌药物稀释液于9.0mL改良MRS琼脂培养基的大试管中，立即涡旋混匀，倒入无菌平皿中，待凝固，即制得一定药物浓度(μg/mL)的抑菌平板。与此同时，制备不加药物的对照平板。
第三步抗生素敏感性分析：取菌悬液1μL(109CFU/mL)接种至平板表面于37℃恒温箱培养16-20h，同时，用不接种的空白平皿作对照。观察琼脂平板上菌株不生长的临界浓度(MIC值)并做记录。结果表明，跟阳性对照菌株Lactobacillus casei-01一样，Lactobacillus harbinensisM1对上述9种抗生素的MIC值均小于耐药性拐点(见表4)，符合EFSA安全性标准。
表4为本发明Lactobacillus harbinensisM1菌株的耐药性分析结果；
表4
Figure BDA0001836576770000081
实施例3：对消化液的耐受性
第一步乳酸菌菌悬液制备：取100mL三角瓶，加入50mL改良MRS液体培养基，121℃灭菌15min，分别接种Lactobacillus harbinensisM1和Lactobacillus casei-01菌株，37℃培养过夜，置于4℃冰箱保存备用。
第二步对模拟胃液肠液的耐受性：把培养好的乳酸菌以109CFU/mL接种到模拟胃液(pH＝3)中，3小时后转接到模拟肠液(pH＝8)中，分别在0h-12h每小时取样用稀释涂布法计算活菌数。结果表明，Lactobacillus harbinensisM1在模拟胃液、肠液中剩余活菌数为2.76log CFU/mL，阳性对照菌Lactobacillus casei-01的剩余活菌数为2.98log CFU/ml,两者没有显著性差异。
第三步对胆盐的耐受性：把培养好的乳酸菌以109CFU/mL接种到含0.3％猪胆盐的MRS液体培养基中，分别在0h-11h每小时取样在620nm下读取吸光值，计算细菌存活率。结果表明，Lactobacillus harbinensisM1在耐胆盐测试中存活率为94.3％，阳性对照菌Lactobacillus casei-01的存活率为98.1％，两者对胆盐都有较高的耐受性。
实施例4：对致病菌的抑制效果
第一步乳酸菌无细胞上清液制备：取100mL三角瓶，加入50mL改良MRS液体培养基，121℃灭菌15min，分别接种Lactobacillus harbinensisM1和Lactobacillus casei-01菌株，37℃培养24小时。将上述制备的菌悬液以10000r/min、4℃离心5min，取上清液，分成两等份，一份不处理，另一份将pH调至7.0，所得上清液均用0.22μm一次性针头滤器过滤，置于4℃冰箱保存备用。
表5为本发明Lactobacillus harbinensisM1菌株的抑菌活性分析结果。
表5
Figure BDA0001836576770000091
第二步抑菌活性分析：采用牛津杯扩散法测试乳酸菌无细胞上清液对病源菌单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌、溶血链球菌以及金黄色葡萄球菌的抑制效果，结果表明，跟阳性对照菌株相比，Lactobacillus harbinensisM1上清液在pH性时对测试病源菌的抑制能力更强，有可能产生了细菌素类的抑菌物质(表5)。
实施例5：对小肠上皮细胞Caco-2的粘附性
第一步乳酸菌菌悬液制备：取100mL三角瓶，加入50mL改良MRS液体培养基，121℃灭菌15min，分别接种Lactobacillus harbinensisM1和Lactobacillus casei-01菌株，37℃培养24小时，用无双抗的DMEM+10％牛血清调整菌体浓度为109CFU/mL。
第二步细胞粘附实验：将Caco-2细胞接种至细胞培养板中，于37℃、5％CO2的条件下培养10天。用无菌PBS洗涤三次，加入上述乳酸菌悬浮液(109CFU/mL)1mL，于37℃、5％CO2条件下继续培养2小时，无菌PBS洗涤三次，用1mL胰酶进行消化，取样用稀释涂布法计算活菌数。结果显示，Lactobacillus harbinensisM1对小肠上皮细胞Caco-2的粘附菌数为5.21log CFU/mL，阳性对照菌Lactobacillus casei-01的粘附菌数为5.22log CFU/mL，表明两者均对小肠上皮细胞均有良好的粘附性。
实施例6：低聚糖利用特性
第一步乳酸菌菌悬液制备：取100mL三角瓶，加入50mL改良MRS液体培养基，121℃灭菌15min，分别接种Lactobacillus harbinensisM1和Lactobacillus casei-01菌株，37℃培养过夜，置于4℃冰箱保存备用。
第二步对低聚糖的利用：将经过活化的菌种接种到只含葡萄糖、蔗糖、水苏糖、棉籽糖的MRS培养基中，37℃培养24小时，在600nm下读取吸光值。结果显示，LactobacillusharbinensisM1在蔗糖、水苏糖和棉籽糖中的相对生长率分别为121.59％，94.20％，103.08％，而阳性对照菌株Lactobacillus casei-01在蔗糖、水苏糖棉籽糖中的相对生长率分别为98.27％，48.25％，91.91％，表明该菌株对蔗糖、水苏糖和棉子糖有很高的利用率，与对葡萄糖的利用率相当，适宜于在豆类基质或植物性原料中生长。
实施例7：发酵豆乳的活菌数及挥发性成分
第一步发酵豆乳的制备及活菌数分析：取经180目筛过滤得到的纯豆浆分装于10ml大试管中，于100℃下灭菌15min。按106CFU/mL加入单菌种，在37℃的恒温培养箱中发酵24h，再置于4℃冰箱后熟24h，分析样品中的活菌数和可滴定酸度。结果显示，Lactobacillus harbinensisM1发酵豆乳的活菌数达到9.08log CFU mL-1，酸度值为44.35°T，而阳性对照菌Lactobacillus casei-01发酵豆乳的活菌数为8.42log CFU mL-1，酸度值为36.91°T，两者有显著性差异，表明该菌株更适合在豆浆中发酵。
第二步发酵豆乳的挥发性成分分析：利用固相微萃取-气质联用(SPME-GC/MS)分析发酵豆乳的挥发性芳香物质，结果见表6。从表中结果可知，(1)Lactobacillusharbinensis M1发酵豆乳能够显著降低正己醛(100％)、壬醛(100％)、1-辛烯-3-醇(31％)等豆腥味物质的含量，而对照菌株Lactobacillus casei-01发酵豆乳降低正己醛(61％)、1-辛烯-3-醇(13％)等豆腥味物质的能力明显偏弱，甚至提高了某些豆腥味成分如正己醇、2-乙基呋喃的含量。(2)Lactobacillus harbinensis M1菌株发酵豆乳能够产生丰富的香气成分，其中牛奶的特征性风味成分丁二酮和乙偶姻的含量分别是对照Lactobacilluscasei-01发酵豆乳的7倍和202倍，从而使产品呈现特有的奶香味。目前尚未有关于Lactobacillus harbinensis产生奶香味挥发性物质的报道。
表6为本发明Lactobacillus harbinensis M1菌株对发酵豆乳挥发性成分的影响结果。
表6
Figure BDA0001836576770000111
第三步感官品评：对两种发酵豆乳进行感官评价试验，结果显示，Lactobacillusharbinensis M1株发酵豆乳感官评价得分总体可接受性为8.13，其中气味8.38、外观7.38、滋味8.63、质构8.13；对照菌Lactobacillus casei-01发酵豆乳感官评价得分总体可接受性为6.5，其中气味6.00、外观6.13、滋味6.25、质构6.75。Lactobacillus harbinensis M1发酵豆乳的各项评分均显著高于对照菌Lactobacillus casei-01发酵豆乳的评分。
由以上实施例可见，从豆腐酸浆水分离出来的菌株Lactobacillus harbinensisM1具有生长温域宽、易于培养等特点(实施例2)。与Lactobacillus casei-01一样，具有良好的对消化液的耐受性(实施例3)、对小肠上皮细胞的粘附性(实施例4)、对病源菌的抑制性(实施例5)等益生特性，其中该菌株对病源菌的抑制效果很好，可能产生了细菌素类的抑菌物质。同时，该菌株对低聚糖利用率很高，能够在富含蔗糖、水苏糖、棉子糖等低聚糖的基质中生长，是发酵豆乳等植物基食品的理想发酵剂(实施例6)。利用该菌株制备的发酵豆乳具有更高的活菌数和酸度；该菌能够显著降低豆乳中的豆腥味成分，并增加了特殊的牛奶香气成分，显著提高酸豆乳的风味与滋味(实施例7)，有很好的应用前景。
本发明哈尔滨乳杆菌为革兰氏染色阳性无芽孢杆菌，葡萄糖异型发酵，生长温域宽(20-45℃可正常生长)，生长速度快；常规生理生化实验结果表明菌株M1为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、非运动性。16S rDNA序列通过BLAST比对，与此菌亲缘相近的标准菌株KT897917.1(Lactobacillus harbinensisstrain LH-1)，KF312693.1(Lactobacillusharbinensisstrain TCP001)和NR_113969.1(Lactobacillus harbinensisstrainNBRC100982)，将菌株M1的16S rDNA的部分序列与标准菌进行相似度分析，鉴定其为哈尔滨乳酸菌Lactobacillus harbinensis。
该菌株对抗生素氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素敏感，安全性符合EFSA的要求。
该菌株对模拟胃液(pH＝3，3h)、肠液(pH＝8，12h)及胆盐的耐受性、以及对小肠上皮细胞Caco-2的粘附能力均与对照菌株Lactobacillus casei-01类似，可定植在小肠上皮细胞并发挥益生功效。
该菌株的上清液对单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌、溶血链球菌以及金黄色葡萄球菌等病源菌的抑制效果显著，将其上清液pH值调整到7.0后仍具有很强的抑菌能力，表明该菌株有可能产生细菌素类的抑菌物质。
该菌株对蔗糖、水苏糖和棉籽糖的利用率显著高于对照菌，应用该菌株制备的发酵豆乳具有更高的活菌数和酸度值。不仅如此，该菌株发酵豆乳时还能够产生丰富的香气成分，其中牛奶特征性香气成分丁二酮和乙偶姻的含量显著高于对照菌发酵豆乳，并显著降低豆腥味成分含量，其中正己醛完全消失。感官品评的结果显示，该菌株可明显改善发酵豆乳的风味和滋味，是发酵豆乳等植物原料的理想发酵剂，应用前景十分广阔。
本发明不受上述实施例约束，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的替代方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0001836576770000141
Figure BDA0001836576770000151
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种哈尔滨乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1479
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggcaagggg ggcggctata atgcaagtcg aacgaggttt ggtcagtttg cggtggtgct 60
tgcatcacca attaccgatc aaaccgagtg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct 120
gcccttcagc aggggataac atttggaaac agatgctaat accgtataac cacggagacc 180
gcatggtctc cgggtaaaag atggcgcaag ctatcactga aggatggacc cgcggcgtat 240
tagccagttg gtggggtaac ggcctaccaa agcgatgata cgtagccgac ctgagagggt 300
aatcggccac attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa 360
tcttccacaa tggacgcaag tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga aggctttcgg 420
gtcgtaaaac tctgttattg aagaagaacg tgtgtgacag taactggtca tgcagtgacg 480
gtattcaatc agaaagtcac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg 540
caagcgttgt ccggatttat tgggcgtaaa gcgagtgcag gcggtctttt aagtctgatg 600
tgaaagcctt cggcttaacc gaagaagggc atcggaaact gggagacttg agtgcagaag 660
aggagagtgg aactccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg 720
gcgaaggcgg ctctctggtc tgtaactgac gctgaggctc gaaagcgtgg gtagcaaaca 780
ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat actaagtgtt ggagggtttc 840
cgcccttcag tgctgcagct aacgcattaa gtattccgcc tggggagtac gaccgcaagg 900
ttgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 960
aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcttctg ccaggctgag agatcagctg 1020
ttcccttcgg ggacagaatg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1080
gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttatgatca gttgccagca ttcagttggg 1140
cactctggtc agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggcg gggatgacgt caaatcatca 1200
tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatgggt ggtacaacga gcagcgagac 1260
cgcgaggtca agcgaatctc taaaaaccat cctcagttcg gattgcaggc tgcaactcgc 1320
ctgcatgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcac gccgcggtga atacgttccc 1380
gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gagagtttgt aacacccaaa gccggtgaga 1440
caaccgcaag gagtcagccg tctaagtgac aaaagccca 1479

Claims (6)

1.一种哈尔滨乳酸菌作为益生菌的应用；其特征在于，该哈尔滨乳酸菌（Lactobacillus harbinensis）M1对抗生素氨苄西林、万古霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素敏感，安全性符合EFSA的要求；该哈尔滨乳酸菌的保藏号为GDMCC No.60305。
2.根据权利要求1所述哈尔滨乳酸菌作为益生菌的应用，其特征在于，该哈尔滨乳酸菌（Lactobacillus harbinensis）M1的上清液对单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌、溶血链球菌以及金黄色葡萄球菌抑制效果显著。
3.根据权利要求1所述哈尔滨乳酸菌作为益生菌的应用，其特征在于，该哈尔滨乳酸菌（Lactobacillus harbinensis）M1对胃液、肠液及胆盐耐受，可定植在小肠上皮细胞上。
4.一种哈尔滨乳酸菌在发酵豆乳中的应用；其特征在于，该哈尔滨乳酸菌（Lactobacillus harbinensis）M1使豆乳中的豆腥味成分正己醛完全消失；该哈尔滨乳酸菌的保藏号为GDMCC No.60305。
5.根据权利要求4所述哈尔滨乳酸菌在发酵豆乳中的应用，其特征在于，所述哈尔滨乳酸菌对蔗糖、水苏糖和棉籽糖的利用率与对葡萄糖的利用率相当。
6.根据权利要求4所述哈尔滨乳酸菌在发酵豆乳中的应用，其特征在于，所述哈尔滨乳酸菌增加了牛奶香气成分丁二酮和乙偶姻。
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