CN101861895B - 一种发酵豆乳制品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型发酵豆乳制品，如发酵豆乳、发酵混合豆乳、发酵豆干等制备方法，即利用α乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)活力作为指标，获得乳酸菌以一种或多种乳酸菌作为发酵剂发酵豆乳或含豆乳的混合乳，制备成发酵豆乳、发酵混合豆乳、豆干或豆干酪等产品，风味良好，易为消费者接受。

Description

一种发酵豆乳制品的制备方法

技术领域

本发明属于食品加工领域，具体涉及一种新型发酵豆乳制品的制备方法。 

技术背景

随着人们生活水平的提高，普通的日常饮食并不能满足人们的需求，各种功能保健食品倍受人们的关注。大豆蛋白是一种优质的完全蛋白质。由于大豆蛋白的营养性和功能性，以豆乳全部或部分替代牛乳生产各种豆乳制品，为广大消费者所接受。 

大豆蛋白含有人体所必需的各类氨基酸，尤其是人体不能合成的赖氨酸、色氨酸等，除含硫氨基酸(半胱氨酸和蛋氨酸)外，其它营养成分均为均衡的，在氨基酸组成平衡胜过其它豆类、油料作物、谷类作物和棉籽；其生物学价值平均含有96个标准单位，同肉、蛋和奶的蛋白质相似，是植物中唯一类似于动物蛋白的“完全”蛋白质，因此极易被人所体收，且没有动物性蛋白质的副作用，如引发肥胖症、心血管病和高胆固醇症等。研究表明，人们进食动物性食品过多，是造成导致心血管病、脑血管病、肥胖症、糖尿病等所谓“文明病”增加的原因之一，营养学家认为，增加植物性蛋白，特别是大豆蛋白的食用量，是解决这一问题的一条行之有效的途径。此外大豆蛋白还能解除因重金属盐、生物碱等引起的中毒、降低血液中的低密度脂蛋白、减少身体内钙的损失等重要生理功能。 

双乙酰是由柠檬酸利用微生物包括乳酸乳球菌属中双乙酰亚种、明串珠菌、乳杆菌在发酵中形成的。在通常条件下，柠檬酸发酵和双乙酰形成仅出现在含有编码运输和代谢柠檬酸的乳酸菌中。在乳制品的乳酸菌中，柠檬酸利用最常与若干种明串珠菌和筛选的乳球菌亚种联系在一起，已发现在发酵柠檬酸的菌中含有编码运输柠檬酸基因的质粒。双乙酰是酸豆乳发酵过程中乳酸菌柠檬酸代谢过程里的一种重要副产物。当其超过一定风味阈值时，就会给酸豆乳带来不良口味，从而影响酸豆乳的质量。α-乙酰乳酸能从乳酸菌细胞中渗出，在细胞外经非酶促氧化脱羧产生双乙酰，双乙酰具有令人不愉快的饭嗖味，影响酸豆乳风味。双乙 酰经过双乙酰还原酶将其还原为乙偶姻(acetoin，3-羟基-2-丁酮)，再进一步由3-羟基-2-丁酮还原酶还原为2，3-丁二醇。a-乙酰乳酸脱羧酶(a-acetolactatedecarboxylase，ALDC)催化a-乙酰乳酸脱羧酶脱羧形成乙偶姻和二氧化碳，不经过双乙酰形成途径。在双乙酰形成与消除这两步反应中，前体物质α-乙酰乳酸的氧化脱羧反应速率比双乙酰的还原反应速率慢10倍之多。这样α-乙酰乳酸的去除反而成了双乙酰去除速率的限制步骤。因此如何控制好的酸豆乳中双乙酰的含量，就要控制好乳酸菌柠檬酸的代谢。α-乙酰乳酸脱羧酶能催化α-乙酰乳酸直接脱羧生成乙偶姻和二氧化碳，有利于改善酸豆乳的风味，从而改善酸豆乳的品质。 

酸豆奶是以大豆和新鲜牛奶(或奶粉)为主要原料，经乳酸菌发酵制成含活性乳酸菌的保健食品，其将动物蛋白和植物蛋有效地结合，提高了蛋白质的消化利用率。酸豆奶将豆奶的营养与乳酸菌的保健集于一体，克服了豆奶酸味不足，品种单一的缺点，同时由于乳酸菌的作用，使产品风味更加柔和。酸豆奶不含胆固醇和乳糖，与酸牛奶相比更适合老年人和儿童饮用，是一种优质植物动物复合蛋白乳酸发酵食品。 

因此利用高产ALDC的乳酸菌生产一种大众普遍接受的酸豆奶及其相关产品具有很好的应用价值。本发明以高ALDC活性的乳酸菌对豆乳进行发酵，生产出一种营养丰富、风味良好、易为消费者接受的酸豆乳。 

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种新型发酵豆乳制品的制备方法。利用人们尚未发现的具有较高ALDC活性的乳酸菌单一或混合发酵来制备口感好的含豆乳发酵制品，可以消除发酵豆乳中表现出来的饭馊味。 

本发明方法是全部使用具有较高ALDC活力的乳酸菌进行发酵，发酵豆乳风味良好，易为消费者接受。具体的操作是：对蛋白质重量百分含量在1.5％-6％的豆乳基质进行95℃杀菌20min的热处理后，用α乙酰乳酸脱羧酶的活力大于0.1000μmol/mL的乳酸菌进行发酵，使其凝固，制备发酵豆乳；或是将对凝乳进行处理，加工成豆干或豆干酪。 

本发明还提供一种筛选能用于本发明的具有高产ALDC的乳酸菌乳酸菌的 方法，具体而言，它采用下述步骤制得：(1)从传统乳制品及天然发酵食品中分离获得乳酸菌；(2)对分离获得的乳酸菌比较其ALDC活力，选择ALDC活力大于0.1000μmol/mL的乳酸菌用于本发明的发酵。 

经热处理的豆乳或含豆乳的混合乳，利用乳酸脱氢酶活力较高的乳酸菌作为发酵剂发酵后，添加或不添加其它食品添加物，直接制成发酵豆乳或经过适当加工处理后制成豆干或豆干酪等产品，其产品特征在于，风味良好，易为消费者接受。 

具体实施方式

本发明提供具有较高ALDC活性的乳酸菌作为发酵剂，用于豆乳基质发酵，具有消除发酵豆乳中的饭馊味的功能，使制备的发酵豆乳风味良好，易为消费者接受。 

具体而言，包括以下几个方面： 

1.样品采集 

本发明样品来源主要是新疆、云南、四川、江苏等地民族传统乳制品及天然发酵食品，如酸奶酒、酸马奶酒、泡菜等，将样品采集后放入事先准备好的缓冲溶液中，冷藏，2天之内对样品进行分离。 

2.乳酸菌分离与鉴定 

将新疆、云南、四川、江苏等地民族传统乳制品及天然发酵食品采用PTYG培养物于37℃培养24小时后。将该培养物涂布在PTYG琼脂平板上，然后在37℃培养3天，挑取单菌落，并进一步纯化，用其检测细菌特征，如下文所述的革兰氏染色，在生理生化基础上进一步进行API鉴定及16SrDNA序列测定结果鉴别出上述细菌是乳酸菌。 

将分离获得的菌株用含11％脱脂乳的培养物培养后，加入保护剂，冻干、保存在-18℃，然后用于各种检测细菌特征的试验。 

3.ALDC活力的测定 

标准曲线的绘制：分别吸取800μM的3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)0、20、40、60、80、100、120、140μL，加水补足至1000μL，加入200μl 5％α-萘酚(溶于2.5mol/L的NaOH中)和200μL 0.5％的肌酸，室温显色1h，522nm比色测OD值。其数据回归处理，以乙偶姻的量为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。 

菌株的活化：将分离到的菌株接种于新配制灭菌后的12％脱脂乳培养基中，混匀后置42℃培养箱中培养，活化3代。 

发酵液制备：各取活化后的菌株3％接种到10mLMRS试管中培养3代，将第3代乳酸菌菌种按3％的量接入装有50mLMRS培养基的三角瓶中培养。 

粗酶液制备：将上述发酵液于4℃，5000r/min离心20min收集菌体，用0.85％的NaCl溶液洗涤，并离心。所得菌体用pH6.0，0.03mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液悬浮，在冰浴中用超声波(200w)间断处理7min，至绝大多数菌体破碎为止，离心除去细胞碎片，所得上清液为粗酶液。 

测定方法：反应总体积400μL，其中200μL为新配制底物α-乙酰氧基-α-甲基-乙酰乙酸乙酯，用200μLpH6.0的0.03mol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液适当稀释的酶样，置于30℃水浴20min；加入4.6mL显色剂(0.1％肌酸，1％α-萘酚，溶1mol/LNaOH溶液中，临用前配)，于15～20℃下显色50min，在721型分光光度计上于522nm处测吸光度，根据吸光度计算酶活单位。一个酶活单位定义为：在30℃，pH6.2条件下，由α-乙酰乳酸脱羧酶脱羧，每分钟产生1μmol乙偶姻的酶量。 

酶活的计算公式 

U＝OD×0.00113494×F×T/H 

OD：样品在522nm处测得的值； 

0.00113494：将结果换算成μmol/min的常数； 

F：样品被稀释的倍数； 

T：样品的总体积； 

H：标准曲线斜率 

从新疆、云南、四川、江苏等地采集的民族传统乳制品及天然发酵食品，如酸奶酒、酸马奶酒、泡菜等分离获得的106株乳酸菌，ALDC活性大于0.1000μmol/mL的占13.19％，ALDC活性在0.0065-0.1000μmol/mL之间的占56.43％，ALDC活性小于0.0065μmol/mL的占30.38％。 

4.发酵豆乳试验 

选取9株酶活大于0.1000μmol/mL、3株酶活在0.0065-0.1000μmol/mL之间、3株酶活小于0.0065μmol/mL乳酸菌共15株菌进行发酵豆乳试验。结果如表1。 

grx90为本实验室分离的菌株，于2010年2月1日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；分类命名为：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，保藏号为CGMCCNo：3622。表1中的其他乳酸菌可从申请人实验室获取。XN53、AM1、CM1、AP3、BM5、ST、qy(ST-日)3球见杨旭(乳酸菌rep-PCR分子鉴别及其与体外细胞的相互作用，扬州大学硕士研究生论文，2009)；白杆见王慧晶(对酒精肝损伤具有保护作用的乳酸菌筛选，扬州大学硕士研究生论文，2008)；BB-16、P971P11、XPL-1、BP2、西草2杆、西原1球见刘彩平(酸豆乳专用乳酸菌的筛选及应用研究，扬州大学硕士研究生论文，2010)。 

表1单菌株发酵豆乳试验 

菌株	ALDC/   μmol/mL	凝乳时间/h	酸度/°T	Cfu/mL	感官评价
						grx90	0.1542	4.5	64	1.7×108	色乳白，香气自然，无乳清，口感细腻
XN53	0.1324	5.1	63	1.06×109	色微暗，弱豆味，少量乳清，口感细腻
						BB-16	0.1123	17	60	5.3×108	色暗红，弱豆味，少量乳清，口感细腻
AM1	0.1121	5.1	54	3.2×108	色暗红，弱豆味，少量乳清，口感细腻
						CM1	0.1121	5.5	57	1.9×108	色微暗，弱豆味，无乳清，口感细腻
BM5	0.1070	5.5	60	7.1×108	色暗红，弱豆味，少乳清
						白杆	0.1043	14	63	4.5×108	色微暗，弱豆味，少乳清
AP3	0.1020	5.5	51	5.3×108	色暗红，微涩，无乳清，无异味
						P971P11	0.1000	4.6	52	1.01×109	色乳白，微涩，无乳清，弱豆味
ST	0.0934	5.5	45	1.58×108	色乳白，弱豆腥味，微涩
						西草2杆	0.0087	13	47	3.1×106	色微暗，凝乳不均匀，豆腥味，少乳清
XPL-1	0.0069	7.6	35	7.7×107	色暗，豆腥味，少量乳清，微涩
						BP2	0.0046	10	30	1.3×107	色暗，乳清析出，豆腥味，气味酸
西原1球	0.0005	3.8	27	1.9×107	凝乳不均与，色暗，有异味
						qy(ST-日)3球	0.0003	4.1	20	1.21×107	色暗，凝乳不均匀，重豆腥味，涩口

从上表可以看出不同酶活的乳酸菌发酵的酸豆乳在滴定酸度和感官方面有很大的差异。酶活大于0.1000μmol/mL的菌株发酵的酸豆乳在色泽，气味，表观和口感方面都优于酶活低于0.1000μmol/mL的菌株，特别是酶活小于0.0065μmol/mL的菌株发酵的酸豆乳不仅表观差，还具有令人难以接受的异味。酶活大于0.1000μmol/mL的菌株适合做发酵豆乳的发酵剂。 

下述实施例阐述了本发明的实践和目前优选的实施方式。 

但是，应理解，本领域熟练的技术人员在考虑到本公开内容之后可在本发明的精神和范围内作出改动和改进。 

实施例1、高产ALDC乳酸菌的筛选及鉴定 

将分离的乳酸菌按3％的接种量接入50mL MRS培养基中培养→发酵液于4℃，5000r/min离心20min收集菌体→0.85％的NaCl溶液洗涤，并离心→Ph6.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液悬浮进行超声波细胞破碎→离心得上清为所要酶液→200μL新配制底物α-乙酰氧基-α-甲基-乙酰乙酸乙酯+200μL酶液30℃水浴20分钟后加入显色剂→15-20℃显色50分钟，于522nm处测吸光度。对所获得的高产ALDC活性的乳酸菌进行API鉴定。表1中15株乳酸菌(grx90、XN₅3、BB-16、AM1、CM1、BM5、白杆、AP3、P971P11、ST、西草2杆、XPL-1、BP2、西原1球、qy(ST-日)3球)的API鉴定见表2和3。鉴定结果为：grx90、CM1为嗜热链球菌；XN₅3、ST、AM1、BM5、P971P11、BP2屎肠球菌；AP3、西原1球、qy(ST-日)3为巴黎链球菌；BB-16、西草2杆为瑞士乳杆菌；白杆、XPL-1为鼠李糖乳杆菌。 

表2乳酸菌分离株的API20ATREP鉴定结果 

表3乳酸菌分离株的API50HCL鉴定结果 

实施例2、混合菌株发酵豆乳试验 

选取9株酶活大于0.1000μmol/mL的乳酸菌经过组合后进行发酵豆乳试验。结果如下表： 

表4混合菌株发酵豆乳试验 

编号	ALDC/   μmol/mL	凝乳时间/h	酸度/°T	Cfu/mL	感官评价
						H1	0.1572	4.5	69	7.1×108	色乳白，香气自然，无乳清，口感细腻
H2	0.1394	4.5	69	5.9×108	色微暗，弱豆乳香，无乳清，口感细腻
						H3	0.1223	5.7	68	5.3×108	色白，弱豆味，无量乳清，口感细腻
H4	0.13181	4.5	64	3.8×108	色微红，豆香，少量乳清，口感细腻
						H5	0.1221	5.1	65	2.5×108	色微暗，豆香，无乳清，口感细腻
H6	0.1470	4.5	69	1.1×109	色暗红，香气自然，少乳清，口感细腻
						H7	0.1143	6.5	62	4.8×108	色微暗，弱豆香，少乳清，口感细腻
H8	0.1080	5.5	61	5.6×108	色暗红，弱豆香，无乳清，口感细腻
						H9	0.1233	4.3	50	9.2×108	色乳白，无乳清，弱豆味
H10	0.1134	4.5	55	3.4×108	色乳白，弱豆腥味、无乳清
						H11	0.1087	5.8	57	2.1×108	色微暗，弱豆腥味，少乳清
H12	0.1069	5.6	59	3.7×109	色微暗，弱豆腥味，少量乳清
						H13	0.1106	5.5	56	3.3×107	色微暗，少乳清析出，弱豆腥味
H14	0.1109	4.0	52	2.3×107	色微暗，凝乳均匀，弱豆味、微涩口
						H15	0.1183	4.1	52	1.25×107	色微暗，凝乳均匀，弱豆腥味，微涩口

注：H1-H8分别为grx90与XN₅3、BB-16、AM1、CM1、BM5、白杆、AP3、P971P11混合发酵的酸豆乳；H9-H12分别为XN₅3与CM1、BM5、白杆、P971P11混合发酵的酸豆乳；H13-H15分别为AM1与白杆、AP3、P971P11混合发酵的酸豆乳。 

从表1可以看出不同酶活的乳酸菌发酵的酸豆乳在滴定酸度和感官方面有很大的差异。酶活大于0.1000μmol/mL的菌株发酵的酸豆乳在色泽，气味，表观和口感方面都优于酶活低于0.1000μmol/mL的菌株，特别是酶活小于0.0065μmol/mL的菌株发酵的酸豆乳不仅表观差，还具有令人难以接受的异味。酶活大于0.1000μmol/mL的菌株适合做发酵豆乳的发酵剂。 

从表4和表1可以看出混合菌株发酵的酸豆乳的凝乳时间较单菌株发酵的酸豆乳有所减短，并且混合菌株发酵的酸豆乳在色泽、气味、口感方面都优于单菌株发酵的酸豆乳。 

实施例3、酸豆乳的制作方法 

精选黄豆→0.25％的NAaHCO₃浸泡14h→清水洗两次→1∶8的比例用热水(85℃左右)磨浆→煮浆→加入8％的白砂糖和3％的全脂乳粉→均质(15-20MPa)→灭菌(90-95℃，15分钟)→冷却42℃左右接入3％酶活大于0.1000μmol/mL乳酸菌→42℃恒温发酵4h至pH值为4.3～4.6→放入4℃冰箱过夜即制成凝固型酸豆乳。发酵结束后经搅拌，添加果酱果汁等，冷藏，即制成搅拌型酸豆乳。 

实施例4、乳酸菌饮料的制作方法 

按应用实施例1制备好酸乳，将酸乳用杀菌并冷却的水、糖浆、乳化稳定剂等混合物稀释3-4倍左右，制成可直接饮用的酸豆乳饮料。 

实施例5、发酵豆干的制作方法 

按实施例2制备好酸豆乳，切割成小凝乳块，阶段性加热，加热到45-50℃促使其排出乳清，压力为0.06～0.09kg/cm²之间压榨到水分含量为40-43％，制成发酵豆干。 

实施例6、大豆再制干酪制作 

按实施例2、4制备好发酵，接种毛霉26℃培养36h，8℃成熟12天制成大豆干酪。加入14％胡萝卜汁、2.3％盐、1％糖、6.7％人造奶油、6.7％全脂奶粉、2％乳化稳定剂，85℃融化后进行包装。 

以上本发明提供的菌株发酵的酸豆乳、大豆豆干、再制豆干酪几种产品风味良好，易为消费者接受。 

Claims (4)

1.一种发酵豆乳制品的制备方法，其特征在于，对蛋白质重量百分含量在1.5%-6.0%的豆乳基质在95℃进行20min的热处理后，用α－乙酰乳酸脱羧酶的活力为0.1542μmol/mL的嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus)CGMCC No：3622进行发酵，使其凝固，制备发酵豆乳。

2.根据权利要求1所述的发酵豆乳制品的制备方法，其特征在于，是将对凝乳进行处理，加工成豆干或豆干酪。

3.根据权利要求1或2所述的发酵豆乳制品的制备方法，其特征在于，豆乳基质中大豆蛋白含量占豆乳基质总蛋白质的15％-90%，且添加10%-85%的牛奶，或1%-2%的奶粉，或添加0.5%-2%的乳清粉。

4.根据权利要求3所述的发酵豆乳制品的制备方法，其特征在于在豆乳基质或发酵豆乳中添加糖、盐、奶油或人造油，制备成发酵豆乳、豆干或豆干酪。