CN111197018B - 一种酸鱼乳杆菌、用其发酵豆乳的方法及制备出的发酵豆乳与应用 - Google Patents

一种酸鱼乳杆菌、用其发酵豆乳的方法及制备出的发酵豆乳与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物及发酵技术领域，具体公开一种酸鱼乳杆菌、用其发酵豆乳的方法及制备的发酵豆乳与应用。所述酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)HAU‑FR7，保藏号为CGMCC NO.19253。酸鱼乳杆菌HAU‑FR7为兼性厌氧大豆异黄酮还原转化乳酸菌，既能在有空气氧条件下生长，又能在有空气氧条件下将豆乳中的黄豆苷和染料木苷还原为DHD和DHG，且转化功能稳定，解决大豆功能性食品研发中，兼性厌氧大豆异黄酮还原转化乳酸菌匮乏的问题，DHD和DHG对DPPH自由基的清除能力均显著高于黄豆苷原和染料木素，该功能性乳酸菌的发现对功能性发酵豆制品的开发利用具有极大的推动作用。

Description

一种酸鱼乳杆菌、用其发酵豆乳的方法及制备出的发酵豆乳 与应用
技术领域
本发明涉及微生物及发酵技术领域，尤其涉及一种酸鱼乳杆菌、用其发酵豆乳的方法及制备的发酵豆乳与应用。
背景技术
早在上世纪80年代，研究人员就尝试用乳酸菌发酵灭菌后的豆乳来获得酸豆乳。文献报道，经发酵后的酸豆乳保健功能不仅较大豆本身有所增加，还可减少豆乳中的抗营养因子、降低免疫原性、增加氨基酸含量以及抗氧化肽、降血压肽等生物活性肽的含量。经乳酸菌发酵后的酸豆乳中胆固醇含量几乎为零，且不含乳糖，尤其适合乳糖不耐和患高胆固醇血症的人群饮用。另外，酸豆乳中富含大豆异黄酮，具有预防心血管疾病、防癌抗癌、延缓女性衰老、缓解更年期症状、预防骨质疏松等作用。研究发现，以大豆异黄酮为主要原料的保健品对人体的骨骼、血液、皮肤、睡眠、免疫力等方面均有一定的保健功能。
大豆异黄酮是大豆在其生长过程中形成的一类次生代谢产物，目前已得到分离且结构鉴定的大豆异黄酮一共有12种，分为游离型苷元(aglycons)和结合型糖苷(glucosides)两类，其中绝大部分以结合型糖苷存在，主要由黄豆苷(daidzin)和染料木苷(genistin)组成；游离型苷元仅占大豆异黄酮总量的2％～3％，主要由染料木素(genistein)和黄豆苷原(daidzein)组成。被摄入体内的结合型大豆异黄酮糖苷经糖苷酶水解后可被转化为游离的大豆异黄酮苷元，游离型大豆异黄酮苷元脂溶性较强，可穿过肠道黏膜细胞进入血液，发挥其生理功能。另外，脱去糖的游离型大豆异黄酮苷元还可被肠道中的特定微生物菌株转化，其中黄豆苷原可被转化为二氢黄豆苷原(dihydrodaidzein，简称DHD)、四氢黄豆苷原(tetrahydrodaidzein，简称THD)、雌马酚 (equol)以及去氧甲基安哥拉紫檀素(O-desmethylangolensin，简称O-Dma) 等；染料木素可被转化为二氢染料木素(dihydrogenistein，简称DHG)、对羟基苯丙酸(2-(4-hydroxyphenyl)propionic acid，简称2-HPPA)以及5-羟基- 雌马酚(5-hydroxy-equol)等。大量研究结果表明，大豆异黄酮的微生物转化产物具有比大豆异黄酮更高、更广的生物活性。
目前，国内外学者已经分离并报道了30余株对大豆异黄酮具有特定转化功能的菌株。根据菌株转化功能的不同，可将大豆异黄酮转化菌株分为三类：第I类转化菌株仅具有加氢还原功能，该类菌株能在厌氧条件下将底物黄豆苷原或染料木素分别还原为DHD和DHG；第II类既具有加氢还原功能又具有去酮基功能，该类菌株能在厌氧条件下将底物黄豆苷原、DHD或染料木素分别转化为雌马酚或5-羟基-雌马酚；第III类具有开环转化功能，该类菌株能在厌氧条件下将底物黄豆苷原和染料木素分别开环转化为O-Dma和2-HPPA。
在已经报道的30余株大豆异黄酮转化菌株中，仅有3株为兼性厌氧菌。其中第1株兼性厌氧菌是由日本学者Uchiyama等从人粪样中分离得到的乳酸球菌Lactobacillussp.20-92，该菌株能将底物黄豆苷原转化为雌马酚，但其只在严格厌氧条件下才具有转化活性。第2株是本申请发明人实验室于2009年报道的海氏肠球菌Enterococcus hirae AUH-HM195，该菌株是从褐马鸡粪样中分离得到，尽管海氏肠球菌AUH-HM195在有空气氧条件下能够正常生长，但该菌株只能在厌氧工作站内才能将底物黄豆苷原开环转化为O-Dma。第3株兼性厌氧菌株是我国华侨大学肖美添课题组2012年报道的分自大鼠肠道的变形杆菌Proteus mirabilis LH-52，但其在有氧条件下转化黄豆苷原合成雌马酚的能力并不稳定。
目前，国内外有关益生菌的应用非常广泛，但益生菌种类还是非常有限，具有保健功能或临床上使用最广泛的仍是乳酸菌。研究人员从各种菌源中已分离并报道了大量乳酸菌，利用乳酸菌发酵豆乳方面也有很多报道，其中既包括用目前已知的乳酸菌直接发酵的，也有用研究人员自己分离的乳酸菌来发酵豆乳的报道。另外，经乳酸菌发酵后，豆乳中的大分子蛋白可被降解为氨基酸和不同长度的多肽。有研究表明，乳酸菌发酵豆乳时可使豆乳中总氨基酸含量增加。另外，乳酸菌发酵豆乳过程中产生的大豆多肽还具有抗氧化、降糖、降血压以及降胆固醇等功效。发酵后的酸豆乳之所以具有更高的抗氧化能力，其主要原因在于两个方面：一是游离型大豆异黄酮苷元含量明显增加，二是发酵过程中产生的大豆多肽以及乳酸菌产生的一些代谢物具有较强的抗氧化活性。
但是，在有氧下能将大豆异黄酮黄豆苷原和染料木素还原的兼性厌氧乳酸菌目前国内外尚未见报道。
发明内容
针对现有大豆功能性食品研发中，兼性厌氧大豆异黄酮还原转化乳酸菌匮乏的问题，本发明提供一种酸鱼乳杆菌、用其发酵豆乳的方法及制备的发酵豆乳与应用。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
一种酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)HAU-FR7，其保藏编号为 CGMCCNO.19253。
酸鱼乳杆菌HAU-FR7是从我国传统发酵豆制品青方腐乳中分离得到，分类命名为酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)，已于2019年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，菌种保藏号为CGMCC NO.19253，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明所提供的酸鱼乳杆菌HAU-FR7为兼性厌氧大豆异黄酮还原转化乳酸菌，既能在有空气氧条件下生长，又能在有空气氧条件下将豆乳中的黄豆苷和染料木苷分别脱糖转化为黄豆苷原和染料木素，并进一步将脱糖转化产物黄豆苷原和染料木素高效还原为DHD和DHG，且转化功能稳定，解决大豆功能性食品研发中，兼性厌氧大豆异黄酮还原转化乳酸菌匮乏的问题，一定浓度的DHD和DHG对DPPH自由基的清除能力均显著高于黄豆苷原和染料木素，因此，该功能性乳酸菌的发现对功能性发酵豆制品的开发利用具有极大的推动作用。
本发明中酸鱼乳杆菌HAU-FR7将黄豆苷和染料木苷还原转化为DHD和 DHG的途径如下所示：
Figure RE-GDA0002454070180000041
本发明中酸鱼乳杆菌HAU-FR7的分类学特征为：
革兰氏阳性，接触酶阴性，菌落圆形边缘整齐，在MRS固体培养基上呈白色，菌落直径0.5-1.5mm，在MRS液体培养基中，菌体为短杆状，单个排列，生长过程中培养基整体浑浊，至稳定期后菌体全部沉于底部，培养基变澄清透明。
氧化酶阴性，精氨酸产氨阴性，脲酶阴性，H2S阴性，V.P.实验阴性，明胶液化阴性，淀粉水解弱阳性，利用葡萄糖、果糖、菊糖能力强，对乳糖、淀粉、麦芽糖、木糖醇的利用能力较弱，不能利用蔗糖和山梨醇。
本发明还提供了一种上述酸鱼乳杆菌HAU-FR7在豆乳发酵中的应用。
本发明提供的酸鱼乳杆菌HAU-FR7不仅可在有氧条件下正常生长，而且在有氧条件下对豆乳中的黄豆苷和染料木苷也具有较高的转化活性，能将黄豆苷和染料木苷高效还原为DHD和DHG，DHD和DHG对DPPH自由基的清除能力显著高于黄豆苷原和染料木素，且DHD对心血管的保护功能也是显著高于黄豆苷原的，在制备功能性发酵豆乳领域具有较好的实用价值。
本发明还提供了一种利用上述酸鱼乳杆菌HAU-FR7发酵豆乳的方法，包括如下步骤：将培养至对数生长期的酸鱼乳杆菌HAU-FR7的培养液接种至豆乳中，25～42℃发酵36～50h，得发酵豆乳。
本发明中上述对数生长期的酸鱼乳杆菌HAU-FR7的培养液的OD值为 1.0以上。
优选的，所述酸鱼乳杆菌HAU-FR7的培养液的接种量为豆乳体积的8％～12％。
优选的，所述豆乳是由大豆与水按照重量体积比为1:6混合粉碎得到的；其中，重量的单位是克，体积的单位是毫升。
优选的，所述酸鱼乳杆菌HAU-FR7的培养液的制备方法包括如下步骤：将所述酸鱼乳杆菌HAU-FR7的活化菌液按4％-6％(v/v)的接种量接种至MRS 液体培养基中，35～40℃培养20～25h，得所述酸鱼乳杆菌HAU-FR7的培养液。
上述酸鱼乳杆菌HAU-FR7的活化菌液是将酸鱼乳酸菌HAU-FR7的甘油管冷冻保藏菌种融化，并按10-15％(v/v)接种量接种到盛有新鲜MRS液体培养基的试管中，37℃下培养48h得到的。
本发明还提供了一种发酵豆乳，由上述任一项所述利用酸鱼乳杆菌HAU- FR7发酵豆乳的方法制备得到。
本发明还提供了上述发酵豆乳在制备抗氧化、抗衰老、增强免疫力、降血压、降血脂保健食品中的应用。
附图说明
图1为本发明实施例1.①大豆中异黄酮的提取项下染料木素标准品、黄豆苷原标准品和大豆异黄酮粗提物的高效液相色谱图：a染料木素标准品，b黄豆苷原标准品，c大豆异黄酮粗提物；
图2为图1中大豆异黄酮粗提物高效液相色谱图中峰1的紫外吸收光谱图；
图3为图1中大豆异黄酮粗提物高效液相色谱图中峰2的紫外吸收光谱图；
图4为本发明实施例1.③具有转化功能的细菌菌株的分离筛选项下染料木素标准品、黄豆苷原标准品和被菌株转化后的大豆异黄酮粗提物的高效液相色谱图：a二氢染料木素标准品，b二氢黄豆苷原标准品，c加入大豆异黄酮粗提物的菌体发酵液；
图5为图4中被菌株转化后的大豆异黄酮粗提物高效液相色谱图中未知峰 1的紫外吸收光谱图；
图6为图4中被菌株转化后的大豆异黄酮粗提物高效液相色谱图中未知峰 2的紫外吸收光谱图；
图7为本发明实施例5.(2)发酵过程大豆异黄酮的变化项下豆乳的菌体发酵液和混合对照溶液的高效液相色谱图：a混合对照溶液；b豆乳的菌体发酵液的高效液相色谱图；
图8酸鱼乳杆菌HAU-FR7发酵前和发酵后的豆乳在不同检测浓度下的清除DPPH自由基能力比较图；
图9为一定浓度豆乳被酸鱼乳杆菌HAU-FR7发酵前和发酵后在不同时间内清除DPPH自由基能力比较图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1.酸鱼乳杆菌HAU-FR7的筛选
(1)市售青方腐乳中酸鱼乳杆菌HAU-FR7的分离
①大豆中异黄酮的提取
用乙酸乙酯对大豆中的异黄酮进行粗提，旋转蒸发仪蒸干乙酸乙酯后，加入色谱级甲醇配制成的一定浓度的大豆异黄酮粗提物(黄豆苷和染料木苷浓度之和为0.3mmol/L～0.5mmol/L)作为底物，并用高效液相色谱对大豆异黄酮粗提物进行检测。
高效液相色谱系统：美国Waters公司，1525型双泵，2487UV检测器；色谱柱：Kromasil C18分析柱(5μm，250mm×4.6mm)；
流动相：流动相A为10％(v/v)乙腈+0.1％(v/v)冰乙酸水溶液，流动相B为 90％(v/v)乙腈+0.1％(v/v)冰乙酸水溶液，梯度洗脱，洗脱顺序如下：
0-8min，70％流动相A，30％流动相B；
8-15min，70％→50％流动相A，30％→50％流动相B；
15-20min，50％→70％流动相A，50％→30％流动相B；
检测波长270nm；
流速：1.0mL/min；
进样量：20μL。
检测结果如图1所示。由于结合型大豆异黄酮糖苷的亲水性较强，当流动相中水的含量远高于乙腈时，结合型大豆异黄酮糖苷在高效液相色谱柱中迅速被分离出来。图1中高效液相保留时间为4min左右的物质峰为黄豆苷，保留时间为5min左右的物质峰为染料木苷。另外，根据图1中黄豆苷原和染料木素标准品的高效液相保留时间以及大豆异黄酮粗提物高效液相色谱图中峰1和峰2的紫外吸收图谱(图2和图3)，将大豆异黄酮粗提物高效液相色谱图中保留时间为10min左右的物质峰鉴定为黄豆苷原，保留时间为16min左右的物质峰鉴定为染料木素。
②梯度稀释
将市售青方腐乳中的卤水和腐乳块混合均匀后取50μL，直接涂布于MRS 固体培养基上，同时取100μL加入到1mL无菌水中振荡混匀，从中取50μL 涂布于MRS固体培养基上，分别置于普通恒温培养箱和厌氧罐中37℃培养 2～3天，观察并记录菌落形态。
③具有转化功能的细菌菌株的分离筛选
挑取②中的单菌落于MRS液体培养基中培养，向MRS液体培养基中加入一定浓度的大豆异黄酮粗提物(黄豆苷和染料木苷浓度之和为0.3 mmol/L～0.5mmol/L)作为底物，在普通生化培养箱内37℃转化3天后，取 200μL培养液并用1000μL乙酸乙酯进行萃取，萃取液过滤蒸干后加入100％色谱级甲醇，利用高效液相色谱法检测加入大豆异黄酮粗提物的菌体发酵液中黄豆苷、染料木苷、黄豆苷原、染料木素的浓度变化以及是否有新物质峰出现。
结果发现，其中的一个菌落与大豆异黄酮粗提物共培养后，结合型大豆异黄酮糖苷的量均减少，其中黄豆苷的浓度由0.184mmol/L降至0.102mmol/L，染料木苷的浓度由0.222mmol/L降至0.123mmol/L。结果表明，该菌株能产生糖苷酶，将该菌落命名为HAU-FR7。
另外，如图4所述，通过高效液相检测还发现，在保留时间10.6min和 14.7min分别出现两个新物质峰，分别将其命名为未知峰1和未知峰2。根据两未知峰的高效液相保留时间和紫外吸收图谱特征(图5和图6)，将未知峰 1初步鉴定为底物黄豆苷原的加氢还原产物DHD，未知峰2初步鉴定为底物染料木素的加氢还原产物DHG。
④转化产物的质谱解析
为进一步确定产物的结构，将产物接出，蒸干后进行阳离子质谱分析。未知物质峰1的质谱显示结果为：ESI(+)：m/z 257([M+H]+)；MS/MS(rel. int.％)：m/z 137(67)，120(57)，91(31)，表明未知峰1的分子量为256，这恰与DHD的分子量相同。因此，根据未知峰1的高效液相保留时间、紫外吸收图谱和质谱的检测结果，将菌株HAU-FR7转化底物黄豆苷原后生成的未知峰 1准确鉴定为DHD。
同样，将纯化后的未知峰2进行质谱分析，质谱显示结果为：ESI(+)： m/z 273([M+H]+)；MS/MS(rel.int.％)：m/z 153(82)，120(36)，91(25)，65(7)，表明未知峰2的分子量应为272，这恰与DHG的分子量吻合。因此，根据未知峰2的高效液相保留时间、紫外吸收图谱和质谱的检测结果，将菌株 HAU-FR7转化底物染料木素后生成的未知峰2准确鉴定为DHG。
(2)酸鱼乳杆菌HAU-FR7的纯化、菌种鉴定与保藏
①菌株纯化与菌种保藏
将分离得到的具有转化功能的菌落或菌苔在MRS固体培养基上划线培养，长出单菌落后，再对长出的单菌落重新进行划线，重复至少3次以上，确保长出的单菌落形态一致。将纯化后的单菌落接种到4mL MRS液体培养基中，培养24h取菌液200μL，加入到盛有200μL事先已灭菌的50％(v/v)甘油水溶液的冻存管中，混匀再将其保藏在-80℃的超低温冰箱中，对低温保藏的菌株定期进行定期复壮培养和转化活性测定。
②对分离得到的具有特定转化功能的细菌菌株进行菌种鉴定
以菌株HAU-FR7总DNA为模板，以通用引物27F/1492R(27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3′)为引物，对16S rDNA序列进行PCR扩增，PCR扩增产物送交上海生物工程有限公司进行DNA测序，测序结果经BLAST比对与GenBank数据库其他菌株进行相似性分析。通过BLAST比对，菌株HAU-FR7与酸鱼乳杆菌 Lactobacillus acidipiscis strain NBRC 102163(NR 112693.1)相似性最高，为99.79％；与破布子乳杆菌Lactobacillus pobuzihii strain E100301(NR 112694.1)相似性为98.32％。结合菌株HAU-FR7的生理生化特性，将分自青方腐乳的功能性乳酸菌HAU-FR7初步鉴定为酸鱼乳杆菌，即酸鱼乳杆菌 Lactobacillus acidipiscis HAU-FR7。
其中，酸鱼乳杆菌HAU-FR7的培养方法为：将酸鱼乳杆菌HAU-FR7的甘油管冷冻保藏菌种融化，按10-15％(v/v)接种量接种到盛有新鲜MRS液体培养基的试管中，37℃下培养48h；再以5％(v/v)接种量将试管中的酸鱼乳杆菌 HAU-FR7重新转接到新鲜MRS液体培养基中，培养12h-18h作为种子液。
2.酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)HAU-FR7的安全性评价及益生性评价
(1)酸鱼乳杆菌HAU-FR7产生物胺能力分析
将分离得到的酸鱼乳杆菌HAU-FR7在MRS液体培养基中活化2次，在含有0.1％(w/v)赖氨酸(或0.1％酪氨酸、或0.1％组氨酸)以及0.005％ (w/v)吡哆醛-5-磷酸的MRS培养基中进行传代培养以诱导尸胺、酪胺和组胺的产生。传代5次后，取5μL菌悬液滴到分别含有赖氨酸、酪氨酸或组氨酸的固体检测培养基上，37℃培养箱培养48h之后，观察菌落附近培养基的颜色变化情况，其中菌落附近培养基颜色为黄色代表阴性，表明不产生物胺；菌落附近培养基颜色为红色代表阳性，表明产生物胺。从试验结果看，菌落附近培养基的颜色均为黄色，表明菌株HAU-FR7不产尸胺、酪胺或组胺。
(2)酸鱼乳杆菌HAU-FR7的抗生素耐受性试验
采用药物纸片扩散法，测定菌株HAU-FR7对头孢哌酮、庆大霉素、红霉素、氨苄西林、美洛培南、四环素、万古霉素、左氧氟沙星、甲氧苄啶、利福平以及青霉素G等抗生素的敏感性。将待测菌株的MRS培养液涂布于MRS 琼脂培养基，约15min后，将含有抗生素的直径为6mm的药敏纸片用无菌镊子贴于平板上，于37℃培养24h，观察并测量抑菌圈直径。
通过对上述11种抗生素的敏感性试验发现，酸鱼乳杆菌HAU-FR7对所检测的抗生素均表现敏感，即对供试的11种抗生素均不耐受。
(3)酸鱼乳杆菌HAU-FR7对牛胆盐耐受能力的测定
将菌株HAU-FR7培养至稳定期，取5个1mL培养液，分别于8000r/min 的离心机中离心10min，弃上清，然后再分别加入1mL分别含有0.1％ (w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.5％(w/v)牛胆盐的MRS液体培养基以及1mLPBS缓冲液，并吹吸混匀，置于37℃培养箱3h后，取出100μL 进行梯度稀释，37℃培养箱培养过夜，进行菌落计数，统计菌株在不同牛胆盐浓度下的存活率。
试验结果表明，菌株HAU-FR7在0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％ (w/v)、0.5％(w/v)胆盐浓度下分别处理3h后的存活率分别为86.29％、86.00％、36.39％、1.25％，表明菌株HAU-FR7具有一定的胆盐耐受能力。
(4)酸鱼乳杆菌HAU-FR7对人工胃肠液耐受能力的测定
取1mL培养至稳定期的菌液3份，8000r/min的离心机离心10min，弃上清，分别加入1mL人工胃液、1mL人工肠液和1mL PBS缓冲液并吹吸混匀，置于37℃培养0h、0.5h、3.0h后，取出100μL进行梯度稀释，37℃培养箱培养过夜，进行菌落计数。
结果发现，菌株HAU-FR7在人工肠液中分别处理0.5h、3.0h，其存活率与对照接近，表明菌株HAU-FR7几乎不受人工模拟肠液中的胰蛋白酶和高 pH的影响；然而，用人工模拟胃液中处理时，仅0.5h后，就有一半左右的菌体不能存活，在处理3h后，菌体存活数量接近于0，表明菌株HAU-FR7对人工胃液的耐受性较差。
3.新鲜豆乳的制备方法为：
挑选颗粒饱满、无明显虫蛀损坏的黄豆，冲洗后在含0.5％NaHCO3 (w/v)的水中常温下浸泡14h，直至大豆两片子叶可轻易用手分开，且中间有轻微凹陷为佳，将浸泡好的黄豆洗涤几次，加入纯净水，使豆水比为1:6 (w/v)，用豆浆机进行磨浆，即为豆乳。磨浆完成后，选择大小适宜的容器对豆乳进行均匀分装，每个容器中分装有15mL，密封好后，采用立式压力蒸汽灭菌锅，121℃灭菌15min，冷却至40℃-50℃，备用。
4.酸鱼乳杆菌HAU-FR7发酵豆乳方法
将上述酸鱼乳杆菌HAU-FR7种子液在MRS培养基中培养至对数后期时，以豆乳体积的5％的接种量接种到上述制备好的新鲜豆乳中，37℃发酵 48h。
5.发酵后酸豆乳品质的检测方法为：
(1)乳酸菌发酵豆乳的产酸能力评价
发酵豆乳的制作流程同上，接种后，分别在0h、3h、6h、9h、12h、 18h、24h、36h、48h取样，测定发酵不同时间豆乳的pH值。结果发现，发酵初始发酵豆乳的pH值为6.5左右，随着发酵时间的延长，发酵豆乳的pH逐渐降低；发酵时间在18h左右，发酵豆乳的pH值达到最低4.8，此后趋于稳定。
(2)发酵过程大豆异黄酮的变化
发酵豆乳的制作流程同上，接种量为豆乳体积的5％，37℃发酵48h，期间分别取不同时间段发酵的豆乳2mL，加入10mL乙酸乙酯振荡萃取， 8000r/min离心机离心10min，0.45μm有机滤膜过滤上清，取出400μL，旋转蒸发仪蒸干，加入80μL色谱级甲醇，用高效液相色谱检测不同时段发酵的豆乳中的底物大豆异黄酮和产物的浓度变化情况。以二氢染料木素标准品、二氢黄豆苷原标准品、染料木素标准品和黄豆苷原标准品的溶液作为混合对照溶液，其中，混合对照溶液中二氢染料木素、二氢黄豆苷原分别为0.1mmol/L，染料木素和黄豆苷原的浓度分别为0.04mmol/L。
由图7可以看出，菌株HAU-FR7对豆乳发酵48h，能将豆乳中的90％以上的黄豆苷转化为黄豆苷原，并进一步还原为二氢黄豆苷原(DHD)；同样地，将90％以上的染料木苷转化为染料木素，并进一步还原为二氢染料木素 (DHG)。
按照相同的发酵工艺，将接种菌株HAU-FR7的豆乳在25-42℃发酵36- 50h，均可达到与上述基本相当的转化效果。
(3)不同糖类对豆乳中大豆异黄酮转化能力的影响
发酵豆乳制作同上，但在分装时分别加入质量分数为1％、4％、8％的蔗糖、葡萄糖或麦芽糖，在121℃下灭菌15min，冷却后接种，以未添加任何糖类的豆乳作为对照。接种量均为豆乳体积的5％，37℃发酵18h后，乙酸乙酯萃取发酵前及发酵后豆乳，高效液相检测大豆异黄酮的转化效果。
①葡萄糖对酸鱼乳杆菌HAU-FR7转化能力的影响
本发明分别向豆乳中添加1％(w/v)、4％(w/v)和8％(w/v)的葡萄糖，发酵后用高效液相检测豆乳中大豆异黄酮糖苷以及苷元被转化情况。结果发现，添加不同浓度的葡萄糖反而显著降低了菌株HAU-FR7的转化能力 (P<0.01)，该结果表明，豆乳中添加葡萄糖会严重影响菌株HAU-FR7对豆乳中大豆异黄酮的转化效率。
②蔗糖对酸鱼乳杆菌HAU-FR7转化能力的影响
除葡萄糖外，本发明还探讨了添加蔗糖对菌株HAU-FR7转化豆乳中大豆异黄酮的影响，结果发现蔗糖的添加对大豆异黄酮糖苷的脱糖转化无显著影响；另外，添加蔗糖对黄豆苷原和染料木素的还原转化也均无显著影响。
③麦芽糖对酸鱼乳杆菌HAU-FR7转化能力的影响
本发明分别向豆乳中添加1％(w/v)、4％(w/v)和8％(w/v)的麦芽糖，发酵后用高效液相检测豆乳中大豆异黄酮糖苷以及苷元被转化情况。试验结果表明，添加麦芽糖显著降低菌株HAU-FR7对豆乳中大豆异黄酮的还原能力(P<0.05)，但与添加葡萄糖相比，影响相对较弱。
6.酸鱼乳杆菌HAU-FR7发酵豆乳后形成的酸豆乳对DPPH自由基清除能力检测
(1)不同浓度酸豆乳对DPPH清除率的影响
取800μL 0.1mmol/L的DPPH-乙醇溶液分别与0.00μL、6.25μL、 12.50μL、25.00μL、50.00μL、100.00μL、200.00μL酸豆乳混合，蒸馏水补齐至1mL，充分震荡后25℃下暗处反应30min。然后将样品以8000r/min离心 5min，取上清液于517nm处测定吸光值。DPPH清除率用以下公式计算：
DPPH自由基清除率＝(A0-A1)/A0×100％
其中，A0为空白吸光值；A1为样品吸光值。
在本发明中的DPPH自由基清除体系中，当酸豆乳的检测浓度为6.25mg/mL时，未发酵豆乳和发酵后的酸豆乳的DPPH自由基清除率分别为 5.05％和8.87％；当酸豆乳的检测浓度升至200.00mg/mL时，未发酵豆乳的 DPPH清除率为69.87％，相同浓度的发酵后的酸豆乳的DPPH自由基清除率则高达89.49％，结果如图8所示。与发酵前相比，不同浓度的发酵后的酸豆乳对DPPH自由基清除能力均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)升高。
(2)DPPH体系反应时间对清除率的影响
取8mL 0.1mmol/L的DPPH-乙醇溶液分别与250μL已发酵的酸豆乳混合，补加蒸馏水1.75mL，充分震荡后25℃下进行暗处反应，分别在暗反应 30min、2h、6h、24h、48h、72h、96h、120h取样测定，计算DPPH自由基清除率。
本发明分别测定了对不同反应时间内发酵前和发酵后豆乳的DPPH清除能力，结果如图9所示。研究结果表明，在反应的前30min到24h，清除能力随着时间增加而明显增加，其中未发酵豆乳对DPPH自由基清除率由反应30min 的13.63％增至反应24h的34.30％；发酵后的酸豆乳对DPPH自由基清除率由反应30min的35.86％增至反应24h的67.87％。在反应24h后，随着反应时间延长，未发酵豆乳的DPPH清除率基本不再增加，而发酵后的酸豆乳的DPPH 清除率随反应时间延长仍呈缓慢增加趋势，反应120h发酵后的酸豆乳的 DPPH清除率可达81.61％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)HAU-FR7，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO.17078。
2.权利要求1所述的酸鱼乳杆菌HAU-FR7在豆乳发酵中的应用。
3.一种利用权利要求1所述的酸鱼乳杆菌HAU-FR7发酵豆乳的方法，其特征在于，包括如下步骤：将培养至对数生长期的酸鱼乳杆菌HAU-FR7的培养液接种至豆乳中，25～42℃发酵36～50h，得发酵豆乳。
4.如权利要求3所述的发酵豆乳的方法，其特征在于，所述酸鱼乳杆菌HAU-FR7的培养液的接种量为豆乳体积的8％～12％。
5.如权利要求4所述的发酵豆乳的方法，其特征在于，所述豆乳是由大豆与水按照重量体积比为1:6混合粉碎得到的；其中，重量的单位是克，体积的单位是毫升。
6.如权利要求3或4所述的发酵豆乳的方法，其特征在于，所述酸鱼乳杆菌HAU-FR7的培养液的制备方法包括如下步骤：将所述酸鱼乳杆菌HAU-FR7的活化菌液按4-6％(v/v)的接种量接种至MRS液体培养基中，35～40℃培养20～25h，得所述酸鱼乳杆菌HAU-FR7的培养液。
7.一种发酵豆乳，其特征在于，由权利要求3-6任一项所述的发酵豆乳的方法制备得到。
8.权利要求7所述的发酵豆乳在制备抗氧化保健食品中的应用。
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