CN117987298A - 一种植物乳植杆菌及采用该菌株制备芦笋发酵饮料的方法 - Google Patents

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黄锦卿
刘光宪
王丽
李雪
张耀
程文龙
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Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种植物乳植杆菌及采用该菌株制备芦笋发酵饮料的方法。该种植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JGS49，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC NO.28396，该菌株耐酸、耐胆盐，具有良好的抗氧化活性，对大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌均存在显著的抑制作用。采用植物乳植杆菌JGS49对芦笋汁进行发酵制备成富含益生菌的芦笋汁发酵饮料，可提升发酵芦笋汁的综合口感，且饮料具有抗氧化活性、血管紧张素转化酶抑制活性和黄嘌呤氧化酶抑制活性，具有潜在的降血压和降尿酸性能，具有广阔的应用前景以及商业价值。

Description

一种植物乳植杆菌及采用该菌株制备芦笋发酵饮料的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种植物乳植杆菌及采用该菌株制备芦笋发酵饮料的方法。
背景技术
芦笋是多年生草本植物，营养价值较高。芦笋中具有多种维生素和矿物质等营养成分，富含多糖、皂苷、黄酮以及氨基酸等功能性成分。国内芦笋以鲜销为主，其加工食品以芦笋罐头为主，饮料类型相对单一，此外，老茎和加工下脚料等芦笋副产物产量巨大且大部分被直接丢弃，造成了严重的环境问题，影响了产业的可持续发展。
芦笋汁同大多数蔬菜汁一样，是经预处理榨汁后所得的汁液，以水溶性物质为主，主要有果胶、糖、皂苷、酚类、部分含氮物质、色素和大部分无机盐类。单纯的芦笋汁普遍存在野蒿味(青臭味)重、风味欠佳的缺点，尤其是经高温处理后，风味变劣影响到其商品价值。
微生物转化不仅被广泛用于改善果汁的药用和营养特性，而且还被用于改善果汁的口感特征，其中有些乳酸菌发酵已被用于蔬菜汁的脱臭和改变口感。乳酸菌发酵蔬菜汁具有产酸、生香、脱臭并赋予发酵蔬菜汁特有风味的作用，通过微生物对果蔬菜进行发酵，不仅能分解原料中的组织，释放出对人体有益的成分，而且对发酵饮料的风味物质的形成起着重要的作用。由于含有丰富的酚类物质、黄酮类物质以及由于发酵菌株的不同产生的不同代谢产物，而使发酵食品其具有改善人体内微生态环境、提高免疫力、减肥、降血压、降血脂、抗氧化、延缓衰老等作用。
植物乳植杆菌属于不产芽孢的一种革兰氏阳性菌，主要应用于食品和中药领域。植物乳植杆菌应用到食品饮料中时，需要具有较强的耐胃酸和胆盐的能力，以保证有效通过胃和小肠到达大肠发挥作用。大肠杆菌等肠道有害菌增加，会导致菌群失调，引发多种疾病，植物乳植杆菌如果具有较好的抑制有害菌的作用，会加快恢复肠道菌群平衡。自由基是机体氧化反应中产生的有害化合物，可促进机体老化、疾病和引发健康问题，清除自由基等抗氧化，有利于维护机体的健康。然而现有的植物乳植杆菌应用于发酵制成芦笋发酵饮料时存在发酵周期长，制得的芦笋发酵饮料口感、风味仍然较差的问题。
因此，针对上述问题，本发明的目的在于开发一种新型的植物乳植杆菌，并基于此植物乳植杆菌，提供一种风味丰富怡人、发酵周期短的芦笋发酵饮料的制备方法，其制作过程简单且适合大规模工业化生产。
发明内容
本发明针对现有的芦笋发酵饮料普遍存在口感、野蒿味(青臭味)重、风味欠佳，发酵周期长的缺点，本发明提供了一种植物乳植杆菌及采用该菌株制备芦笋发酵饮料的方法。
为实现上述技术目的，本发明提供了一种植物乳植杆菌，其被命名为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JGS49，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC NO.28396。
其中，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期是2023年09月08日。
本发明提供了一种菌剂，其活性成分包含植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)JGS49。
进一步地，所述菌剂为粉剂、颗粒剂或者液体制剂。
进一步地，所述菌剂中还包括至少一种适合于微生物制剂的赋形剂。例如但不局限于脱脂奶粉等冻干保护剂。
本发明还提供一种植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JGS49或者所述菌剂在制备发酵饮品或者营养粉中的应用。
其中，所述发酵饮品可以是发酵蔬菜汁，也可以是酸奶。所述营养粉可以是营养代餐粉。
本发明还提供一种植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JGS49或者所述菌剂在制备具有抑制有害菌生长、抗氧化、抗衰老、降尿酸、降血压中至少一种作用的产品中的用途；优选的，所述有害菌为大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌中的至少一种。
本发明还提供一种芦笋发酵饮料的制备方法，包括，以植物乳植杆菌JGS49或者所述菌剂为发酵剂在甜味剂的存在下对芦笋汁进行发酵。
进一步地，将芦笋在温度为45～55℃下、功率为45～55W的条件下超声波处理25～35min制成芦笋汁；和/或，芦笋制成芦笋汁之前先进行热烫处理，所述热烫处理包括在90～100℃水中热烫0.5～2min；和/或，所述发酵的温度为30～37℃，时间为1～2天；和/或，发酵之后还包括过滤、调配、均质、冷却灌装和灭菌的步骤。
进一步地，发酵之前还包括将芦笋汁、甜味剂和水混合得到发酵底液，再将发酵底液与发酵剂混合的步骤；
优选的，以发酵底液的质量为100％计，发酵底液中包含10～50％芦笋汁、3～9％甜味剂，余量为水；
优选的，发酵剂的质量占发酵底液质量的0.001-0.5％；
优选的，所述甜味剂选自白砂糖、冰糖、果糖、葡萄糖、果葡糖浆、麦芽糖浆和白砂糖浆中的至少一种。
进一步地，所述调配的步骤为，将过滤后的发酵液冷却至2-4℃，再加入质量百分数为发酵液质量的5-10％的甜味剂，混合。
进一步地，所述芦笋发酵饮料的制备方法，包括，芦笋筛选→清洗、分切→护色→榨汁→冷却→接种发酵→过滤→调配→均质→冷却灌装→灭菌。
本发明还提供一种上述任一所述的制备方法制得的芦笋发酵饮料。
本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JJGS49，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCCNO.28396，该菌株耐酸、耐胆盐，起酵温度低，发酵时间短。具有良好的抗氧化活性，对大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌均存在显著的抑制作用。采用植物乳植杆菌JGS49对芦笋汁进行发酵制备成富含益生菌的芦笋发酵饮料，可提升发酵芦笋汁的综合口感，且饮料具有抗氧化活性、血管紧张素转化酶抑制活性和黄嘌呤氧化酶抑制活性，具有潜在的降血压和降尿酸性能，可应用于发酵蔬菜汁，也可联合嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌发酵酸奶等饮品，也可作为代餐粉原料，具有广阔的应用前景以及商业价值。
(2)本发明提供的一种菌剂，通过将植物乳植杆菌JGS49制备为菌剂，该菌剂同样具有优异的抗氧化能力，可用于制备具有抗氧化作用的产品；较强的耐酸、耐胆盐特性和对大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌具有显著的抑制作用，可用于制备芦笋发酵饮料、具有抑制有害菌生长的产品。
(3)本发明提供的一种芦笋发酵饮料的制备方法，采用植物乳植杆菌JGS49对芦笋汁进行发酵后制备成芦笋发酵饮料，发酵时间短，可应用于大规模生产。制成的芦笋发酵饮料中酚类物质/有机酸/香气成分/多糖等比例恰当风味佳等，可提升芦笋发酵饮料的风味及综合口感；其次，芦笋发酵饮料表现为优异的抗氧化活性、血管紧张素转化酶抑制活性和黄嘌呤氧化酶抑制活性，具有潜在的降血压和降尿酸作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1的植物乳植杆菌JGS49的菌落形态图；
图2是本发明实施例1的植物乳植杆菌JGS49革兰氏染色后的图片。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。MRS肉汤培养基(M8540)、MRS固体培养基(M8330)、LB液体培养基(L1010)、LB固体培养基(L1015)等培养基的粉末、革兰氏染色试剂盒(G1060)、细菌基因组DNA提取试剂盒(D1600)均购自北京索莱宝公司。
MRS肉汤培养基的制备方法：称取M8540粉末48.3g，加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌20分钟，待灭菌结束后取出并冷却至室温，制得MRS肉汤培养基。
MRS固体培养基的制备方法：称取M8330粉末63.3g，加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌20分钟，待灭菌结束后取出并冷却至55℃时倒入培养皿中(15mL/皿，厚度3 5mm)，制得MRS固体培养基。
LB液体培养基的制备方法：称取L1010粉末25g、1000mL蒸馏水于烧杯中，混合，再将混合后的溶液置于灭菌罐中进行灭菌处理20分钟，待灭菌结束后取出并冷却至室温，制得LB液体培养基。
LB固体培养基的制备方法：称取L1015粉末40g、1000mL蒸馏水于烧杯中，混合，再将混合后的溶液置于灭菌罐中进行灭菌处理20分钟，待灭菌结束后取出并冷却至55℃时倒入培养皿中(15mL/皿，厚度3 5mm)，制得LB固体培养基。
实施例1
本实施例提供了一种植物乳植杆菌JGS49及制备方法，具体制备方法如下：
1、植物乳植杆菌JGS49的制备
S1、传统发酵泡菜的采集
用无菌勺吸取30mL泡菜发酵液于50mL的无菌离心管中，迅速旋紧管盖并放入低温采样箱中，采样地点为南昌市莲塘综合农贸市场，采样时间为2022年05月30日；
S2、菌株的分离和纯化
(1)制备菌悬液
泡菜发酵液样品带回实验室后首先对其进行植物乳植杆菌富集培养。在超净工作台中将S1步骤中的泡菜发酵液以5％的接种量接种于无菌MRS肉汤中，在恒温培养箱中37℃静置培养24h，当MRS肉汤变浑浊，并且在其底部有白色菌体沉淀时，说明得到了较好的富集，制备得到菌悬液，该菌悬液可进行下一步的分离纯化；
(2)涂布平板，恒温培养
分别取富集完成的MRS肉汤菌悬液1mL，在无菌状态下用无菌生理盐水稀释至10 3～10 8倍。分别取10 5～10 8稀释度的菌悬液100μL接种到MRS培养基中央位置，用无菌涂布棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置8min，待菌液吸附进培养基后，培养皿倒置放入恒温培养箱37℃培养48h，制备得到菌落；
(3)平板划线纯化
用接种环挑取(2)中平板上菌落形态不同的菌平板划线接种到新的MRS培养基进行划线分离(尽量挑去单菌落中心处的细菌)，如此重复直至分离纯化得到形态一致的纯的单菌落，然后进行革兰氏染色，具体步骤为，在载玻片上滴一滴蒸馏水，用接种环挑取S4步骤制得的单菌落于水滴中，待水分挥发干后，将载玻片置于火焰上方对单菌落进行固定，再向单菌落滴加一滴结晶紫染液，轻轻晃动载玻片，待结晶紫染液覆盖单菌落后保持1分钟，水洗；再向单菌落滴加一滴碘液，轻轻晃动载玻片，待碘液覆盖单菌落后保持1min，水洗；再滴加95％乙醇对单菌落进行脱色处理，待其无紫色液脱下后，水洗；再滴加复红液，保持30s后水洗；最后用吸水纸吸干载玻片表面液体，在油镜下进行观察，保留颜色为紫色(革兰氏阳性菌)的单菌落，其为植物乳植杆菌的单菌落，淘汰非目标菌株；
(4)菌种保存
经过革兰氏染色筛选后，保留目标菌，即植物乳植杆菌的单菌落，将单菌落接种于MRS肉汤培养基中，得到菌悬液(109CFU/mL)，用移液枪吸取0.5mL菌悬液和0.5mL20％灭菌后的甘油，将其均匀混合在灭菌过的菌种保藏管中，并保存在80℃冰箱中。
S3、菌株的形态鉴定
将植物乳植杆菌菌株接种于MRS肉汤培养基上培养至对数生长期，按革兰氏染色试剂盒说明书对菌株染色后于光学显微镜下观察菌株JGS49的革兰氏阴阳性、有无荚膜、有无鞭毛等形态特征。
S4、菌株的分子鉴定
对疑似植物乳植杆菌的菌株进行DNA提取及16S rDNA PCR扩增。将已纯化的疑似目标菌株接种于MRS肉汤培养基中，37℃培养24h后，采用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。将提取得到的DNA进行PCR扩增，其中浓度为10μM的上游引物27F(5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'，SEQ ID NO.1)1μL、浓度为10μM的下游引物1495R(5'CTACGGCTACCTTGTTAC GA 3',，SEQ ID NO.2)1μL，2×Taq plus Buffer 12.5μL、模板DNA 1μL，用无菌dd H2O将体系补足至25μL。并以无菌超纯水替代模板DNA作为阴性对照。扩增条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共29个循环，最后72℃延伸5min。回收目标DNA片段，然后送往上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果如SEQ ID NO.3所示：
GGGGCGTGGCGGCGTGCTATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCAAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGACATGATACAGGTGGTGCATGATGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTGGGTTAGTCCCGCACGAGCGCACCTATAATCAGGTGGCAGCATAGGTGGCACCTCTGGGTGAGACTGCGTGACCAGCGAAGGAAGTGGGATGACGTCAACTCATCATGGCCCGTTATGAATCTGGGGCTTAACCACCACG。
S5、菌株的形态及分子鉴定结果
对S2步骤中通过平板划线纯化得来的疑似植物乳植杆菌的菌落采用S3步骤的方法进行处理和形态观察，结果见图1和图2所示，从图1可以发现该菌落在培养基中的形态特征为乳白色，表面光滑，易挑落。对其菌株进行革兰氏染色观察发现该菌株为革兰氏阳性菌，有荚膜，无鞭毛，如图2。
采用菌体直接扩增16S rDNA的方法，测序结果(即S4中的测序结果)经BLAST比对，该菌株为乳酸菌属(Lactiplantibacillus)，16S rDNA同源性分析结果显示，与GeneBank数据库中已知植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)的同源性达100％，该分离得到的植物乳植杆菌菌株命名为JGS49，将其进行保藏，保藏信息如下：
将菌株JGS49于2023年9月送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)进行保藏，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2023年09月08日；保藏编号：CGMCC NO.28396；分类命名：植物乳植杆菌Lactiplantibacillus plantarum。
实施例2
本实施例提供了植物乳植杆菌耐酸、耐胆盐能力分析，具体方法如下：
将植物乳植杆菌JGS49接种于MRS肉汤培养基中，在37℃条件下培养24小时，制得菌悬液，分别采用如下方法测试该菌株的耐酸、耐胆盐能力。
1、耐酸试验：
取1mL菌悬液置于1.5mL的离心管中，8000×g离心5min，将收集到的沉淀物菌体用灭菌的培养基冲洗两次，然后将菌体重新悬浮于pH为2.5的MRS肉汤培养基中，最后置于35℃的CO2培养箱中厌氧培养，并于0h、3h分别取菌液1mL，用0.9％生理盐水进行10倍梯度稀释(10 1 10 7)，然后取适当浓度涂布于MRS琼脂平板，35℃厌氧培养72h，培养结束后计数测定活菌数，计算其存活率。菌株存活率计算公式：
N1―菌株处理后活菌数，即3h的活菌数；N0―菌株初始活菌数，即0h的活菌数。
将上述植物乳杆菌JGS49酸处理3h后，N1为7.23×108cfu，N0为9.63×108cfu，其存活率为75.08％。
2、耐胆盐试验：
取1mL菌悬液直接接种于含0.3％胆盐的MRS肉汤培养基中，置于35℃培养，并于培养0h，4h时分别取样，稀释后涂布于MRS琼脂平板，将涂布平板置于35℃的CO2培养箱中厌氧培养72h。待培养结束后计算MRS琼脂平板上的活菌数，计算其存活率。菌株存活率计算公式：
N1―菌株处理后活菌数，即4h的活菌数；N0―菌株初始活菌数，即0h的活菌数。
将上述植物乳杆菌JGS49胆盐处理4h后，N1为4.0×108cfu，N0为9.63×108cfu，其存活率为41.56％。
实验结果表明，植物乳植杆菌JGS49具有较强的耐酸及耐胆盐特性。
实施例3
实施例1经平板划线纯化、形态鉴定和分子鉴定共获得50种植物乳植杆菌，除了目标菌株植物乳植杆菌JGS49之外，还测试植物乳植杆菌JGS01、JGS07、JGS14、JGS20、JGS23、JGS26、JGS27、JGS28、JGS30、JGS31、JGS32、JGS35、JGS36、JGS38、JGS39、JGS40、JGS44、JGS45、JGS46、JGS48、JGS50的抗氧化性能力，具体方法如下：
1、菌悬液制备：
将植物乳植杆菌接种于MRS肉汤培养基中，在37℃条件下培养至该菌株培养浓度达到109cfu/mL时，在5000g下离心5min去除培养基。收集菌体并用2mL生理盐水重悬沉淀，即为待测样品；采用2,2 dip Henyl 1 picrylhydrazyl(DPPH)、羟基自由基清除率和还原能力确定菌株的抗氧化能力。
2、清除DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基实验
将菌悬液2mL与2mL DPPH甲醇溶液(0.2mM)混合，在室温下避光放置30min，得到混合液，记为样品组。采用2mL生理盐水代替菌悬液，其他条件同样品组处理，得到混合液，记为对照组。采用2mL乙醇代替DPPH甲醇溶液，其他条件同样品组处理，得到混合液，记为空白组。采用2mLVc(维生素C)溶液(0.8mg/mL)代替菌悬液，其他条件同样品组处理，得到混合液，记为阳性对照组。分别测试样品组、对照组、空白组和阳性对照组在517nm处的吸光度。DPPH自由基清除率(％)＝1 [A517(样品组或阳性对照组)A517(空白组)/A517(对照组)]×100％。
DPPH自由基清除率的结果取三次结果的平均值。测定结果如表1所示，实施例1平板划线纯化分离出的50株植物乳植杆菌中菌株JGS49(109cfu/mL)的DPPH清除率为49.25％。清除率与Vc(0.8mg/mL)的清除率50.12％相近，由此可知植物乳杆菌JGS49具有很强的清除DPPH自由基的能力，表现出其较强的抗氧化活性。
3、清除羟基自由基试验：
将1mL菌悬液与1mL水杨酸、1mL硫酸亚铁FeSO4和1mL过氧化氢混合在37℃放置15min，得到混合液，记为A1。采用1mL纯水代替过氧化氢，其他条件同A1处理，得到混合液，记为A2。采用1mL生理盐水代替菌悬液，其他条件同A1处理，得到混合液，记为A0。采用1mLVc溶液代替菌悬液，其他条件同样品组处理，得到混合液，记为阳性对照组A3。分别测试上述各组在510nm处的吸光度。
其中，FeSO4溶液的浓度为0.005mol/L，Vc溶液的浓度为0.8mg/mL，羟基自由基清除率(％)＝1[(A1A2)/A0]×100％，羟基自由基清除率取三次结果的平均值。结果如表1所示，植物乳植杆菌JGS49的羟基自由基清除率较高，且羟基自由基清除率为40.15％。
4、还原能力的测定
取菌悬液0.5mL加入到0.2moL/L的PBS溶液(pH6.6)0.5mL和1％铁氰化钾溶液0.5mL的混合溶液中，混匀，在50℃下水浴20min，迅速冷却后加入10％三氯乙酸0.5mL，在5000g的转速下离心5min，取上清液与蒸馏水1mL、0.1％三氯乙酸1mL混匀，静置反应10min后，制得样品组A1；按照上述制备方法将“菌悬液0.5mL”替换为“PBS缓冲液0.5mL”制备空白对照组A0，将“菌悬液0.5mL”替换为“Vc溶液0.5mL”制备阳性对照组A1，测量样品组A1，阳性对照组A1和空白对照组A0在700nm处的吸光度值并计算还原能力，还原能力(％)＝(A1-A0)/A0×100％，还原能力的结果取三次结果的平均值。结果如表1所示，植物乳植杆菌JGS49的还原能力为34.11％。
表1菌株抗氧化活性
上述清除DPPH自由基实验、清除羟基自由基实验、还原能力实验结果表明：该植物乳植杆菌JGS49具有耐酸耐胆盐和强抗氧化活性，可用于制备具有抗衰老、抗氧化作用的食品或保健品。
实施例4
实施例提供了植物乳植杆菌的抗病原菌试验，抑菌试验采用牛津杯法，具体方法如下：
将大肠杆菌(CMCC 44350)、伤寒沙门氏菌(ATCC 13311)、单核细胞增多性李斯特氏菌(CMCC 54007)、金黄色葡萄球菌(CMCC 26003)、蜡样芽孢杆菌(CMCC 63301)分别接种于LB液体培养基中，制备得到含108cfu/mL的大肠杆菌、伤寒沙门氏、单核细胞增多性李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的LB溶液，取各个LB溶液100μL分别涂板于已灭菌的LB固体培养基上，在LB固体培养基上放置牛津杯，牛津杯中分别加入200μL相同浓度的菌悬液(制备方法见实施例3第1项)，设置3个重复，在37℃下培养24h，记录抑菌圈直径，同时将“加入200μL相同浓度的菌悬液”替换为“加入200μL的PBS溶液”按照上述方法检测抑菌圈，作为空白对照组。结果如表2所示，植物乳植杆菌JGS49对大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌均存在显著的抑菌效果。
表2植物乳杆菌JGS49抑菌圈(mm)
实施例5
本实施例提供了一种芦笋发酵饮料及制备方法，方法如下：
芦笋筛选→清洗、分切→护色→榨汁灭菌→冷却→接种发酵→过滤→调配→均质→冷却灌装→灭菌。
植物乳植杆菌JGS49菌剂的制备方法：将植物乳植杆菌JGS49接种于MRS肉汤培养基中，经离心10分钟(10000转/分钟)后，加入5％的脱脂奶粉水溶液(质量分数为10％)，-80℃预冻2小时，进行真空冷冻干燥48小时，制得植物乳植杆菌JGS49菌剂，菌数为1×1010cfu/g。
芦笋发酵饮料的制备方法：将绿芦笋段在95℃水中热烫处理1分钟进行护色处理，再在温度为50℃、超声功率为50W的条件下超声波处理30分钟后进行榨汁，获得芦笋汁；将30kg芦笋汁、70kg水、5kg果葡糖浆混合后，在95℃下灭菌15分钟，得到发酵底液，待发酵底液冷却后加入质量为发酵底液质量的0.01％的植物乳植杆菌JGS49菌剂(活菌数1×1010cfu/g)，混合均匀后于37℃下发酵2天。发酵完成后过滤，再按照蔗糖占发酵液质量的8％向发酵液中添加蔗糖，均质后将发酵芦笋汁进行罐装和90℃巴氏杀菌10分钟，即可制得芦笋发酵饮料。
实施例6
本实施例提供了一种芦笋发酵饮料，与实施例5的区别在于，将“30kg芦笋汁、70kg水、5kg果葡糖浆”替换为“20kg芦笋汁、80kg水、3kg果葡糖浆”，将“加入质量为发酵底液质量的0.01％的植物乳植杆菌JGS49菌剂”替换为“加入质量为发酵底液质量的0.1％的植物乳植杆菌JGS49菌剂”，其余制备方法与实施例5一致。
实施例7
本实施例提供了一种芦笋发酵饮料，与实施例5的区别在于，将“30kg芦笋汁、70kg水、5kg果葡糖浆”替换为“10kg芦笋汁、90kg水、9kg果葡糖浆”，将“加入质量为发酵底液质量的0.01％的植物乳植杆菌JGS49菌剂”替换为“加入质量为发酵底液质量的0.001％的植物乳植杆菌JGS49菌剂”，其余制备方法与实施例5一致。
对比例1
本对比例提供了一种芦笋发酵饮料，与实施例5的区别在于，未添加植物乳植杆菌JGS49菌剂(即采用植物内生菌进行发酵)，其余制备方法与实施例5一致。
对比例2
本对比例提供了一种芦笋发酵饮料，与实施例5的区别在于，未添加果葡糖浆，其余制备方法与实施例5一致。
对比例3
本对比例提供了一种芦笋发酵饮料，与实施例5的区别在于，将“植物乳植杆菌JGS49菌剂”替换为现有的“含植物乳植杆菌ATCC 8014的菌剂”。该菌剂的制备方法同实施例5，区别仅在于菌株替换为植物乳植杆菌ATCC 8014，该菌剂中活菌数为1×1010cfu/g，植物乳植杆菌8014菌剂的制备方法同植物乳植杆菌JGS49菌剂的制备方法，其余制备方法与实施例5一致。
实验例1
本实验例对实施例5、未发酵(实施例5)和对比例1-3进行了主要挥发性风味化合物含量的检测，测定方法如下：
将实施例5制得的芦笋发酵饮料、未发酵(实施例5)的发酵液、对比例1-3制得的芦笋饮料置于顶空固相微萃取设备中进行前处理，待其结束后采用气相色谱和质谱进行检测。具体条件为：
色谱柱：HP-5MS石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)；
参数：初始温度为50℃，在维持3min后以2℃/min的升温速率升至100℃并维持2min，然后以4℃/min的升温速率升至210℃维持5min；载气为氦气，流速1.0mL/min，压力7.6522psi；分流比1:50；EI电离源的电离能量70eV，温度230℃；进样口温度250℃；传输线温度230℃；质谱扫描范围为35～450m/z，2scans/s。
鉴定：待数据采集完成后，使用Mass Hunter和Unknown Analysis软件(安捷伦公司)对GC-Q-TOF/MS原始数据进行峰提取、峰对齐和基线过滤，采用NIST17.0谱库对每种化合物进行比对鉴定，并使用峰面积归一法进行定量。
检测结果见下表3。
表3主要挥发性风味化合物含量检测结果
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备注：未发酵(实施例5)是指实施例5制得的发酵底液，未经过发酵处理；醇类化合物指编号为1-8的总和；酮类化合物指编号为10-13的总和；酸类化合物指编号为15-18的总和；醛类化合物指编号为20-29的总和；酯类化合物指编号为31-34的总和；其他类化合物指编号为36-39的总和。
如表3所示，相较于分别采用自然发酵的对比例1、不添加果葡糖浆发酵的对比例2，实施例5使用植物乳植杆菌JGS49进行发酵后，酯类化合物和醇类化合物的相对含量均得到了提高，同时减少了正己醛的含量，正己醛是青蒿味物质，因而，降低了野蒿味(青臭味)。相较于对比例3，实施例5使用植物乳植杆菌JGS49发酵后，芦笋发酵饮料中酯类和醇类物质的相对含量显著高于对比例3，说明采用本发明提供的植物乳植杆菌JGS49对芦笋汁进行发酵，相对于采用现有技术中的植物乳植杆菌(ATCC，编号8014)，在主要挥发性风味化合物的产生上具有明显优势。
实验例2
本实验例对实施例5、未发酵(实施例5)和对比例1-3进行了感官评定，主要包括色泽、口感和风味、组织形态三个方面，感官评定的指标如下：
表4芦笋发酵饮料感官评价标准
评定结果见下表5。
表5乳酸菌发酵芦笋饮料感官评价标准
备注：未发酵(实施例5)是指实施例5制得的发酵底液，未经过发酵处理。
如表5所示，相较于对比例和未发酵(实施例5)，实施例5的发酵芦笋发酵饮料感官评价较高，且具有芦笋汁应有的淡黄绿色，无杂色；酸味柔和，且芦笋的清香味浓滋味，具有天然芦笋汁之混浊，有少量悬浮，久置后有分层。综合挥发性物质和感官评定，实施例5对应的菌剂制备的芦笋发酵饮料，具有更丰富更愉悦的香气成分，异味成分较低，这有助于提升消费者接受度。
实验例3
本实验例对实施例5、未发酵(实施例5)和对比例1-3进行了黄嘌呤氧化酶抑制能力的检测，检测方法如下：
将饮料进行匀浆后称取2.0g加入到30mL的70％乙醇中，超声提取20min后离心取上清液，过滤，将上清液旋蒸浓缩后进行真空冻干，将冻干后的物质加入到2mL的PBS溶液中复溶，制得饮料提取液，备用。黄嘌呤氧化酶抑制率检测方法如下：样品组中分别加入不同的饮料提取液0.2mL、PBS溶液(0.2mmol/L，pH7.5)2.3mL、黄嘌呤溶液(1.2mmol/L)2.0mL，用水补足体系体积为5mL，25℃恒温水浴20min后加入50U/L的黄嘌呤氧化酶溶液，在292nm下测定吸光度值，每反应1min测定1次，共测定10次。按照上述方法将“饮料提取液0.2mL”替换为“PBS缓冲液0.2mL”进行制备对照组并测定吸光度值。以反应时间为横坐标，以吸光度值为纵坐标，计算斜率K(酶反应速率)，再按下式计算黄嘌呤氧化酶抑制率并根据抑制率计算IC50值。
其中，Kcontrol为对照组的酶反应速率，Ksample为样品组的酶反应速率。
检测结果见下表6。
表6对黄嘌呤氧化酶抑制能力的影响
组别 黄嘌呤氧化酶抑制IC50(μg/mL)
未发酵(实施例5) 310.88
实施例5 59.44
对比例1 267.77
对比例2 122.87
对比例3 98.56
备注：未发酵(实施例5)是指实施例5制得的发酵底液，未经过发酵处理。
如表6所示，实施例5制备的芦笋发酵饮料中的黄嘌呤氧化酶抑制IC50值远低于对比例1-3和未发酵(实施例5)，说明实施例5具有更好的黄嘌呤氧化酶抑制活性，具有更好的降尿酸潜力。
实验例4
本实验例对实施例5、未发酵(实施例5)和对比例1-3进行了ACE(血管紧张素转化酶)抑制能力的检测，检测方法如下：
将饮料进行匀浆后称取2.0g加入到30mL的70％的乙醇中，超声提取20min后离心取上清液，过滤，将上清液旋蒸浓缩后真空冻干，将冻干后的物质加入到2mL的PBS溶液中复溶，制得饮料提取液，备用。检测方法：取饮料提取液10μL和5mM的盐酸溶液40μL，混匀，37℃水浴预热5min后，加入0.02U/mL ACE 30μL，37℃孵育30min，每5min震荡一次；再加入150μL的1M的HCl溶液终止反应，采用高效液相色谱仪检测产物HA(马尿酸)的含量，记为Aa。液相条件：进样量为20μL，色谱柱Kromasil 100-5-C18(4.6ⅹ250mm)，流动相为0.05％甲酸水溶液:乙腈＝80:20，柱温箱温度为30℃，检测器为紫外检测器，检测波长为228nm。按照上述方法将“饮料提取液10μL”替换为“水10μL”进行制备空白对照组，并检测HA的含量，记为Ab；按照上述方法将“饮料提取液10μL”替换为“水10μL”，将“加入0.02U/mL ACE 30μL”替换为“加入水30μL”进行制备溶剂对照组，并检测HA的含量，记为Ac。计算ACE抑制率并根据抑制率计算IC50值，ACE抑制率按下式计算：
检测结果见下表7。
表7对ACE抑制能力的影响
组别 ACE抑制IC50(mg/mL)
未发酵(实施例5) 1.07
实施例5 0.22
对比例1 0.48
对比例2 0.39
对比例3 0.42
备注：未发酵(实施例5)是指实施例5制得的发酵底液，未经过发酵处理。
如表7所示，实施例5制备的芦笋发酵饮料中的ACE抑制IC50值远低于对比例1-3和未发酵(实施例5)。说明实施例5制备的芦笋发酵饮料具有优异的降血压潜力。
实验例5
本实验例对实施例5-7制备的芦笋发酵饮料和未发酵(实施例5-7)的发酵底液的理化指标进行了测定，其中，pH的测定按照《化学试剂pH值测定通则》(GB/T 9724-2007)进行测定；总酸的测定按照《食品中总酸的测定方法》(GB/T 12456-1990)进行测定；皂苷的测定按照《食品中总皂苷含量的测定分光光度法》(T/AHFIA 004-2018)进行测定；黄酮的测定按照《出口食品中总黄酮的测定》(SN/T4592-2016)进行测定。
测定结果见下表8。
表8主要理化指标
备注：未发酵(实施例5)是指实施例5制得的发酵底液，未经过发酵处理；未发酵(实施例6)是指实施例6制得的发酵底液，未经过发酵处理；未发酵(实施例7)是指实施例7制得的发酵底液，未经过发酵处理。
如表8所示，实施例5-7制备的芦笋发酵饮料的pH较低，总酸含量较高，能赋予饮料浓郁的酸味。实施例5-7制备的芦笋发酵饮料中，总酸含量和黄酮含量增加。
实验例6
本实验例对实施例5-7制备的芦笋发酵饮料和未发酵(实施例5-7)的发酵底液进行了有机酸含量检测，检测条件如下：
饮料于4℃下，在10000rpm/min的转速下离心10min，取1mL上清液过0.22μm水系滤膜后，使用安捷伦1260高效液相色谱仪进行有机酸含量的检测。色谱柱采用BIO-RADHPX-87H离子交换色谱柱C18(5μm，300mm×7.8mm)；流动相：6mmol/L的稀硫酸；检测器：紫外检测器，波长：210nm；柱温：35℃；进样量：20μL；流速：0.5mL/min；使用有机酸标准品进行外标法定量。
检测结果见下表9。
表9有机酸含量％
注：“-”表示未检测到；未发酵(实施例5)是指实施例5制得的发酵底液，未经过发酵处理；未发酵(实施例6)是指实施例6制得的发酵底液，未经过发酵处理；未发酵(实施例7)是指实施例7制得的发酵底液，未经过发酵处理。
如表9所示，实施例5-7制备的芦笋发酵饮料中的各类有机酸(除草酸外)含量较发酵前均有所提高，其中乳酸含量最高。乳酸、苹果酸及柠檬酸为饮料主要提供柔和愉快的酸味滋味。乙酸、丙酸和丁酸则属于短链脂肪酸的重要组成，有助于预防和治疗一些代谢综合征。
实验例7
本实验例对实施例5-7制备的芦笋发酵饮料和未发酵(实施例5-7)的发酵底液进行了抗氧化能力检测，方法参照实施例2中的方法，测定结果见下表10。
表10抗氧化能力结果
组别 DPPH自由基清除能力(％) 羟基自由基清除率(％) 总还原能力(％)
未发酵(实施例5) 35.28 38.23 32.57
未发酵(实施例6) 30.16 31.65 21.33
未发酵(实施例7) 23.74 27.76 25.62
实施例5 57.97 51.45 43.15
实施例6 50.40 42.55 33.64
实施例7 42.38 34.73 27.72
注：未发酵(实施例5)是指实施例5制得的发酵底液，未经过发酵处理；未发酵(实施例6)是指实施例6制得的发酵底液，未经过发酵处理；未发酵(实施例7)是指实施例7制得的发酵底液，未经过发酵处理。
如表10所示，实施例5-7制备的芦笋发酵饮料的DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力和还原能力均较强，说明本发明制备的芦笋发酵饮料具有优异的抗氧化活性。
实验例8
本实验例对实施例5-7制备的芦笋发酵饮料进行了感官质量和微生物指标检测，其中，大肠菌群采用《食品微生物学检验大肠菌群计数》GB4789.3-2016方法进行测定。若芦笋发酵饮料具有如下特点，则认为相对应的色泽、滋味、气味及组织状态没有发生变化。芦笋发酵饮料的特点：色泽：具有芦笋汁应有的淡黄绿色，无杂色；滋味：酸味柔和；气味：具有芦笋的清香味浓；组织状态：具有天然芦笋汁之混浊，有少量悬浮，久置后有分层。
测定结果见下表11。
表11结果评价
如表11所示，本发明制备的芦笋发酵饮料在12个月的贮藏期间内，色泽、滋味、气味及组织状态等感官指标均未发生变化，菌落总数均为0且未检测到大肠菌群。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种植物乳植杆菌，其特征在于，其被命名为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)JGS49，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC NO.28396。
2.一种菌剂，其特征在于，其活性成分包含权利要求1所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JGS49。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为粉剂、颗粒剂或者液体制剂。
4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中还包括至少一种适合于微生物制剂的赋形剂。
5.权利要求1所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JGS49或者权利要求2-4中任一所述的菌剂在制备发酵饮品或者营养粉中的应用。
6.权利要求1所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)JGS49或者权利要求2-4中任一所述的菌剂在制备具有抑制有害菌生长、抗氧化、抗衰老、降尿酸、降血压中至少一种作用的产品中的用途；优选的，所述有害菌为大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌中的至少一种。
7.一种芦笋发酵饮料的制备方法，其特征在于，包括，以权利要求1所述的植物乳植杆菌JGS49或者权利要求2-4中任一所述的菌剂为发酵剂在甜味剂的存在下对芦笋汁进行发酵。
8.根据权利要求7所述的芦笋发酵饮料的制备方法，其特征在于，将芦笋在温度为45～55℃下、功率为45～55W的条件下超声波处理25～35min制成芦笋汁；和/或，芦笋制成芦笋汁之前先进行热烫处理，所述热烫处理包括在90～100℃水中热烫0.5～2min；和/或，所述发酵的温度为30～37℃，时间为1～2天；和/或，发酵之后还包括过滤、调配、均质、冷却灌装和灭菌的步骤。
9.根据权利要求7或8所述的芦笋发酵饮料的制备方法，其特征在于，发酵之前还包括将芦笋汁、甜味剂和水混合得到发酵底液，再将发酵底液与发酵剂混合的步骤；
优选的，以发酵底液的质量为100％计，发酵底液中包含10～50％芦笋汁、3～9％甜味剂，余量为水；
优选的，发酵剂的质量占发酵底液质量的0.001-0.5％；
优选的，所述甜味剂选自白砂糖、冰糖、果糖、葡萄糖、果葡糖浆、麦芽糖浆和白砂糖浆中的至少一种。
10.权利要求7-9中任一所述的芦笋发酵饮料的制备方法制备得到芦笋发酵饮料。
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