CN117757670A

CN117757670A - 一种降解丙烯酰胺和高产苯乳酸的乳酸片球菌yys-j2及其应用

Info

Publication number: CN117757670A
Application number: CN202311748708.0A
Authority: CN
Inventors: 官雪芳; 林斌; 王�琦; 赵大洲; 黄君阳
Original assignee: Fujian Academy Of Agricultural Sciences Agricultural Product Processing Research Institute; Xiamen Yuanzhidao Biotech Co ltd
Current assignee: Fujian Academy Of Agricultural Sciences Agricultural Product Processing Research Institute; Xiamen Yuanzhidao Biotech Co ltd
Priority date: 2023-12-15
Filing date: 2023-12-15
Publication date: 2024-03-26

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，提供一种降解丙烯酰胺和高产苯乳酸的乳酸片球菌YYS‑J2及其应用。该乳酸片球菌YYS‑J2(Pediococcus acidilactici YYS‑J2)的保藏编号为CGMCC No.28183。该乳酸片球菌YYS‑J2具有良好的丙烯酰胺去除能力、高效的L‑苯丙氨酸利用和代谢能力、优质的苯乳酸生产能力、优秀的变异链球菌抑菌能力，同时还能产SOD，并且其在人工胃液和人工肠液中耐受性良好；该乳酸片球菌YYS‑J2可为丙烯酰胺清除产品、抑菌产品、产SOD产品等功能产品的开发提供新的益生菌源，具有重要的应用价值。

Description

一种降解丙烯酰胺和高产苯乳酸的乳酸片球菌YYS-J2及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种乳酸片球菌YYS-J2及其应用。

背景技术

油炸、烘烤或烤制食品是深受人类喜爱的美味食品，然而，这些碳水化合物在高温过程中，其还原糖和天冬氨酸会发生美拉德反应，并产生丙烯酰胺等副产物。丙烯酰胺被世界卫生组织列为2A级致癌物，大量研究表明，丙烯酰胺具有潜在的致癌性、神经毒性、遗传毒性、生殖毒性等毒性。丙烯酰胺可溶于水，其可通过呼吸道、消化道、皮肤等多种途径被人体吸收,影响人体健康。

现有的降低丙烯酰胺水平的方式为：通过降低原料糖含量、在食物中加入有机酸等方式降低部分丙烯酰胺的生成，但这会影响食物的感官品质，因此有必要寻求新的方式去除食物或体内的丙烯酰胺以维护机体健康。

变异链球菌是口腔中常见的致病菌，它通过分泌黏附素初步黏附于牙齿表面，形成生物膜，再将食入口腔中的蔗糖等碳水化合物代谢为酸性物质和不溶性葡聚糖，黏附于牙齿表面并损伤和腐蚀牙齿，引起牙齿表面脱矿，导致踽病发生，据国家计生委第四次全国口腔健康流行病学的调查显示，我国五岁和十二岁儿童的龋齿患病率为分别71.9％和34.5％，因此寻求一种可有效抑制变异链球菌的方法极为重要。

苯乳酸是一种天然的抑菌化合物，具有广谱抑菌特征作用，可抑制真菌和多种细菌的生长，是一种天然的优质生物防腐剂，并且，苯乳酸是丹参素的衍生物之一，具有和其一样药理作用，例如抗血小板聚集活性、调节人体类固醇等。苯乳酸对人和动物安全无毒，由此，乳酸菌等产生的苯乳酸可视为天然的抗菌物质。

苯丙氨酸是人体必需的氨基酸，是苯乳酸和酪氨酸合成的前体物质，然而有部分苯丙氨酸羟化酶基因缺陷人群不能代谢苯丙氨酸为酪氨酸，导致苯丙氨酸在体内堆积造成大脑和神经系统受损，因此食用可高效消耗食物中苯丙氨酸的益生菌，不仅可减少该类人群体内苯丙氨酸的积累，其产生的苯乳酸还具有抑菌和丹参素类似的调理作用。

超氧化物歧化酶(SOD)，是一种集清除、激活、再生、修复、自愈和供养六位为一体的多功能活性酶系，具有抗辐射、抗癌和抗氧化等作用，在临床上具有重要的应用价值，然而，由于其提取工艺复杂，产量极为有限，相关产品极为稀罕和昂贵。

目前来说，兼具显著去除丙烯酰胺、高效利用苯丙氨酸产苯乳酸，可抑制变异链球菌，可分泌SOD的益生菌菌种在本领域的研究尚属空白。如何开发一款兼具显著去除丙烯酰胺、高效利用苯丙氨酸产苯乳酸，可抑制变异链球菌，可分泌SOD的益生菌，以期应用于丙烯酰胺等有害物质去除、口腔护理产品、抑菌产品和产SOD类食品、保健品、及药物的开发中，正是本领域技术人员致力于解决的问题。

发明内容

为解决上述背景技术提到的现有技术的不足，本发明提供一种乳酸片球菌YYS-J2，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)YYS-J2于2023年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.28183。

本发明还提供一种组合物，其组分包含如上所述的乳酸片球菌YYS-J2。

在一实施例中，所述组合物包括食品、保健品、药物中的一种。

在一实施例中，在所述组合物中，所述乳酸片球菌YYS-J2的数量≥1×10⁶CFU/mL或≥1×10⁶CFU/g。在一实施例中，在所述组合物中，所述乳酸片球菌YYS-J2的数量≥1×10⁸CFU/mL或≥1×10⁸CFU/g。

在一实施例中，所述组合物中包含乳酸片球菌YYS-J2未灭活菌、乳酸片球菌YYS-J2灭活菌、乳酸片球菌YYS-J2菌株的代谢物、乳酸片球菌YYS-J2冻干株中的一种或多种组合。

本发明还提供一种发酵物，其为如上所述的乳酸片球菌YYS-J2发酵获得。

本发明还提供如上所述乳酸片球菌YYS-J2和/或其发酵物在制备功能产品中的应用。

在一实施例中，所述功能产品包括食品、保健品或药品。

在一实施例中，所述功能产品包括至少以下一种作用：

(1)降解或吸附丙烯酰胺；

(2)产SOD；

(3)利用或代谢L-苯丙氨酸；

(4)产苯乳酸；

(5)对变异链球菌具有抑菌能力，且对变异链球菌具有共聚能力。

在一实施例中，所述功能产品包括丙烯酰胺排毒产品、抑菌产品以及产SOD产品。

本发明还提供如上所述的乳酸片球菌YYS-J2或如上所述的组合物在制备发酵食品中的应用。

在一实施例中，乳酸片球菌YYS-J2作为益生菌，利用水果、中草药进行发酵以制备发酵食品。

基于上述，与现有技术相比，本发明提供的乳酸片球菌YYS-J2，具有以下有益效果：

本发明提供的乳酸片球菌YYS-J2可降解或吸附薯条等食物中的丙烯酰胺、可产SOD，可高效利用L-苯丙氨酸并产苯乳酸，对口腔致病菌变异链球菌具有超强的抑菌能力，并且其在人工胃液和人工肠液中耐受性良好；该菌可为丙烯酰胺排毒产品、抗菌产品和产SOD产品等功能产品的开发提供新的益生菌源，具有重要的应用价值。

本发明的其它特征和有益效果将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他有益效果可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图；在下面描述中附图所述的位置关系，若无特别指明，皆是图示中组件绘示的方向为基准。

图1为乳酸片球菌YYS-J2的菌落形态图。

图2为乳酸片球菌YYS-J2的扫描电镜图。

图3为乳酸片球菌YYS-J2的16SrDNA目的片段扩增琼脂糖电泳图。

图4为乳酸片球菌YYS-J2的16SrDNA基因的系统发育树图谱。

图5为乳酸片球菌YYS-J2对发酵基质中L-苯丙氨酸的利用情况图。

图6乳酸片球菌YYS-J2在不同浓度L-苯丙氨酸的MRS培养基中苯乳酸的生产情况

图7乳酸片球菌YYS-J2对变异链球菌的抑菌效果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；下面所描述的本发明不同实施方式中所设计的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，本发明所使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义，不能理解为对本发明的限制；应进一步理解，本发明所使用的术语应被理解为具有与这些术语在本说明书的上下文和相关领域中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的意义来理解，除本发明中明确如此定义之外。

本发明还提供如下所示操作示例和实施例：

本发明提供的乳酸片球菌YYS-J2(Pediococcus acidilactici YYS-J2)是由杨梅果肉、糖与蜂蜜混合物中,经过发酵后分离获得。

本发明从杨梅果肉、糖与蜂蜜混合物中提取该菌的操作示例如下：

实施例1菌的筛选分离

将杨梅果肉：糖：蜂蜜：水按照质量比40:5:5：50混合，制备5瓶，于37℃静置发酵，选取发酵后风味良好的1瓶发酵样品1m l，稀释至10^-3倍、10^-4倍、10^-5倍，取稀释后的0.1mL发酵液涂布于含有CaCO₃的MRS培养基中，37℃厌氧培养48-72h，选取能产生较大溶菌圈的疑似乳杆菌的单菌落若干株，纯化3次后，进行丙烯酰胺降解效果检测，选取对丙烯酰胺降解效果较好的菌株，保存并命名为YYS-J2。

实施例2菌种的鉴定

2.1 YYS-J2菌的形态观察

YYS-J2的菌落形态如图1所示，菌体形态如图2所示，YYS-J2的主要形态特征如下：菌落圆，在MRS培养基上呈白色、不透明；菌体球形，直径在0.6-1μm。

2.2 YYS-J2菌的生理生化分析

乳酸菌生化实验按照GB4789.35标准方法进行，具体为配置七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖、乳糖、1％(质量分数(w/v))马尿酸钠的乳酸菌基础培养基。按照1％(w/v，接种YYS-J2。

其中，1％马尿酸钠还需在培养结束后，沿着试管壁缓缓加入0.2mL茚三酮溶液，其中，1％(w/v)马尿酸钠的用量为2ml，不要振荡，在36℃±1℃的水浴中放置10min后判读结果，判读结果详见表1。

表1 YYS-J2主要生理生化反应情况

注：“+”为实验阳性，“-”为实验阴性。

结论：根据表1结果可知：YYS-J2只可利用纤维二糖和水杨苷，不能利用麦芽糖、蔗糖、棉子糖、乳糖、七叶苷、甘露醇、水杨苷、山梨醇、菊糖和马尿酸钠等糖水化合物。

2.3 YYS-J2的分子生物学鉴定

①YYS-J2菌基因组DNA的提取：采用T IANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取；

②16S rDNA序列的PCR扩增：

扩增16SrDNA基因序列，所用引物为：F 9-27：5’-GAGTTT GAT CCT GGC TCA G-3’；R 1525-1542：5’–AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’；

PCR反应体系：2×Mi x 12.5μL，引物及DNA各1μL，ddH₂0 9.5μL。

PCR扩增程序：93℃预变性4min；然后94℃变性30s，55℃(16SrDNA)，72℃延伸90s，共30个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

③PCR产物检测及测序分析：取5u l的PCR产物，在加入EB的1.0％的琼脂糖中凝胶电泳分离检验，扩增得到16SrDNA目的片段长1499bp(16S rDNA目的片段扩增琼脂糖电泳图详见图3),其中，测得的YYS-J2 16SrDNA序列如下：

CCTATACATGCAGTCGAACGAACTTCCGTTAATTGATTATGAGGTGCTTGCACTGAATGAGATTTTAACACGAAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGCAGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGTATAACAGAGAAAACCGCCTGGTTTTCTTTTAAAAGATGGCTCTGCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTGAGAGTAACTGTTCACCCAGTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTAATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATTACTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGCCAACCTAAGAGATTAGGCGTTCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAAACCGCGAGGTTTAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAGCTAGCCGTCTAAGGTGGGACAGATGATTAGGGTGAAGTCGTAACAAGTAGCCAGG。

④系统发育分析：在NCBI数据中对各16S rRNA序列进行Blast比对分析，得到序列与Pediococcus acidilactici系列标准菌株的序列同源性均大于99％，进行MEGA 4中的Neighbor-joining方法发育树的构建分析(结果见图4)。

结论：结合YYS-J2菌的形态观察，生理生化鉴定，以及DNA系统发育树中的同源性分析，确定YYS-J2为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)菌种。

本发明提供的乳酸片球菌YYS-J2的性能表征如下：

实施例3乳酸片球菌YYS-J2对丙烯酰胺的去除效果

将乳酸片球菌YYS-J2母液按照1％(w/v)的量分别接种于MRS培养基中，37℃厌氧培养24h，获得YYS-J2发酵液(下同)，流式细胞仪测定初始发酵菌液活菌数为5.7*10⁸cfu/mL，测定不同时间和不同浓度的去除效果。

测定过程具体为：

(1)验证不同处理时间对丙烯酰胺的降解效果实验组一：

取发酵24h的发酵液10ml,加入丙烯酰胺母液至丙烯酰胺在溶液中的终浓度约为10mg/L，分别于不同时间(2h、4h、6h、24h)取2mL样品离心，取上清液待测；

(2)验证不同浓度下YYS-J2对丙烯酰胺的降解效果实验组二：

取发酵24h发酵液10mL,加入丙烯酰胺母液至丙烯酰胺在溶液中的终浓度约为1mg/L、10mg/L、20mg/L，处理6h后取2mL样品离心取上清液。

(3)对照组：为未接菌种的丙烯酰胺母液+10ml MRS培养基(CK)，其中，丙烯酰胺的终浓度为10mg/L，取2mL样品离心取上清液。

将上述所有样品过0.22μm微孔滤膜后于棕色液相色谱进样瓶中，采用WatersAlliance e1695高相液相色谱检测，测定各处理后的样品溶液的丙烯酰胺浓度，丙烯酰胺的去除率结果见表2-3。

其中，LC检测条件为:SunFireC18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，进样量：5μL流速：1mL/min，流动相：乙腈：甲醇：水＝1：3：96，进样温度：30℃检测波长：210nm，出峰时间5.3-5.6min。丙烯酰胺的去除率计算公式为：

丙烯酰胺的去除率/％＝(CK-X)/CK×100％；

式中，CK表示空白对照组测得的丙烯酰胺浓度，X表示实验组一或实验组二中样品中丙烯酰胺浓度。

表2不同处理时间对丙烯酰胺的降解效果

表3不同浓度下YYS-J2对丙烯酰胺的降解效果

由表2-3数据可知：乳酸片球菌YYS-J2对丙烯酰胺具有良好的去除效果。

实施例3乳酸片球菌YYS-J2在薯条介质中对丙烯酰胺的去除效果

取市售油炸薯条，将薯条粉碎后，称取5g样品加入到10mL的YYS-J2发酵液和灭活发酵液(发酵液煮沸15min)中，以未发酵的MRS培养基为对照，加入丙烯酰胺母液至丙烯酰胺终浓度约为5mg/L,混匀后37℃静置，在2h和4h取样离心取上清液，测定丙烯酰胺含量，测得的数据如表4所示。

其中，使用的YYS-J2发酵液为实施例3中的发酵液，灭活发酵液为上述YYS-J2发酵液100℃煮沸15min获得。

表4 YYS-J2对薯条中的丙烯酰胺去除效果

由表4数据可知：

在处理2h和4h后，YYS-J2发酵液对薯条中的丙烯酰胺的去除率为44.08％和78.30％,灭活后的YYS-J2发酵液对薯条中的丙烯酰胺的去除率为22.00％和76.78％,表明了YYS-J2发酵液或其灭活发酵物均可用于去除薯条中的丙烯酰胺。

且与实施例3中在发酵液中的处理效果相比，在薯条介质中处理4h后，丙烯酰胺去除率从48.18％上升到78.3％，说明YYS-J2可应用于薯条等食物中丙烯酰胺的去除。进一步地灭活后的发酵液也同样可以显著去除薯条中的丙烯酰胺。

实施例4乳酸片球菌YYS-J2利用L-苯丙氨酸产苯乳酸能力

取YYS-J2发酵母液，分别接种于加有不同浓度L-苯丙氨酸的MRS培养基中(其中MRS+0:表示在MRS培养基中未加L-苯丙氨酸；MRS+0.5：表示在MRS培养基中加外源L-苯丙氨酸至终浓度约为0.5g/L，MRS+1：表示在MRS培养基中加外源L-苯丙氨酸至终浓度约为1g/L)，发酵前取样后，进行发酵培养96h,制得YYS-J2发酵液，取发酵液离心取上清液过0.22μm微孔滤膜后，采用Waters Alliance e1695高相液相色谱检测测定L-苯丙氨酸和苯乳酸含量，检测结果见图5-6；

其中，HPLC的检测条件为：色谱柱：SunFire C18色谱柱(4.6×250mm，5μm),柱温：30℃，进样量：10μL，流速：0.8mL/min,流动相：A相为体积分数0.55％三氯乙酸甲醇溶液，B相为体积分数0.05％三氯乙酸溶液，洗脱程序：0～20min为A:B由10％线性变化为100％，20～23min为100％A相，23～27min保持A:B为10％，检测波长：210nm。L-苯丙氨酸出峰时间约为9min左右，苯乳酸出峰时间12.1-13.4min之间。

其中，YYS-J2发酵母液为实施例3中的发酵液。

YYS-J2利用L-苯丙氨酸产苯乳酸能力由图5数据可知：在YYS-J2发酵不同含量的L-苯丙氨酸后，培养基中的L-苯丙氨酸均显著下降，发酵96h后，发酵物中的L-苯丙氨酸分别由发酵前的0.24-1.10(g/L)降至0.049-0.117(g/L)，对L-苯丙氨酸利用消耗率高达79.49-93.35％，表明YYS-J2可显著降低发酵物中L-苯丙氨酸的含量。

经过96h发酵后，培养基中检测到苯乳酸的产量最高达到741.12mg/L(图6)，表明YYS-J2具有极高的苯乳酸生产能力。

实施例5乳酸片球菌YYS-J2对变异链球菌的抑菌能力

取乳酸片球菌YYS-J2发酵液，采用牛津杯法测定其对变异链球菌(Streptococcusmutans)ATCC 25175的抑菌作用，获得YYS-J2对变异链球菌的抑菌圈直径高达35.00±5.20mm(如图7所示)，表明：YYS-J2对口腔致病菌变异链球菌具有优秀的抑菌作用。

其中，YYS-J2发酵液为实施例3中的发酵液。

实施例6乳酸片球菌YYS-J2的自凝集率(％)和它凝集率(％)测试

制备菌YYS-J2和变异链球菌发酵液，取适量发酵液置于12000r/min、4℃下离心5min，收集菌泥，分别用pH＝7.0的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤菌泥2次(即在菌落中加入PBS，震荡混合均匀后，置于12000r/min、4℃下离心5min，收集菌体)。再用PBS制备成波长600nm处的吸光值为0.6±0.1(A0)的悬浮菌液及菌悬液。

自凝集率(％)：用无菌的PBS将YYS-J2菌泥制成在波长600nm处的吸光值为0.6±0.1(A₀)的悬浮菌液及菌悬液，静置24h后测定吸光值Ax(x＝24)，测得自凝集率，结果详见表5；

它凝集率(％):用无菌的PBS将YYS-J2和变异链球菌的悬菌液调节在波长600nm处的吸光值为0.6±0.1(A₀)得混合悬浮菌液(两种菌的比例为1:1)，静置不同时间段(2、4、24)h后测定吸光值Ax(x＝2、4、24)，测得自凝集率，结果详见表5；

其中，聚凝力，即凝集率的计算公式为：

聚凝力R/％＝(1-A_x/A₀)×100％；

其中，A₀表示初始吸光度值，Ax表示处理X小时后的吸光度值。

表5 YYS-J2的自凝集率和对变异链球菌凝集率测定

由上表数据可知：

YYS-J2在2、4、24(h)的自凝集率分别为9.75、12.08和32.33(％)，其自凝集率较低，而与变异链球菌的它凝集率分别为37.91、39.00和53.08(％)，显著高于自凝集率，表明其具有较好的凝集变异链球菌的能力，这将有利于变异链球菌的去除。

实施例7乳酸片球菌YYS-J2产SOD测试

SOD检测采用超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成)进行，具体测试过程为：

取YYS-J2发酵液离心获得上清液，将上清液与水按照体积比2:3的比例混合后制得样品，根据试剂盒要求说明书操作表(具体详见表6)，制备反应体系，将混合体系混匀，37℃孵育20分钟，450nm处酶标仪读取OD值，本研究反应体系中SOD抑制率达50％时所对应的酶量为一个SOD活力单位(U)。

其中，YYS-J2发酵液为实施例3中的发酵液；

SOD活力和抑制率的计算公式为

式中，A指代OD值。

表6：说明书中酶反应体系操作表

测试结果表明：YYS-J2发酵上清液中SOD酶活力为51.98±0.49U/mL,说明YYS-J2具有良好的产SOD能力。

实施例8乳酸片球菌YYS-J2在模拟人工模拟胃液环境中的存活率分析

(1)存活率测试过程为：

取发酵24h的菌YYS-J2，12000r/min离心5min收集菌体，加入同体积的生理盐水(0.85％)混匀备用；配制人工胃液(125mM NaCl，7mM KCl,45mM NaHCO₃和3g/L pepsin)，调pH值至2.0、2.5、3.0，经0.22μM微孔滤膜过滤后备用；取1mL的处理样品于9mL的pH值为2.75的人工胃液中，置于37℃恒温培养，取未处理(0h)、处理x(1、2、3、5)h样品，每次取0.9mL，加入0.1mL PI，37℃染色10min，取0.1ml于0.9mL的超纯水中，流式细胞仪检测细菌总数P1/％和死亡数P2/％，并以此计算出不同时间段存活率/％,以未处理的存活数为100％对照，计算各处理胃肠耐受力；

不同处理时间细菌存活率的计算公式为：

存活率/％＝[(P1_处理组-P2_处理组)/P1_处理组]/[(P1_对照-P2_对照)/P1_对照]。

(2)菌YYS-J2在不同胃液环境中的存活率见下表7：

表7 YYS-J2在人工模拟胃液环境中的存活率/％

根据数据可知：菌YYS-J2在胃液在pH值为2.5的模拟胃液环境中处理1-2h时，YYS-J2的存活率为21.09-45.36％；

在pH值为3.0的模拟胃液环境中处理1-5h时，YYS-J2的存活率为89.52-97.71％，表明YYS-J2在人工模拟胃液环境中有良好的耐受能力，这为其在胃液环境中降解丙烯酰胺提供了良好的基础。

其中，P1处理组指的是处理组细菌总颗粒数，P2处理组指的是处理组细菌死菌颗粒数。P1对照指的是对照组细菌总颗粒数，P2对照指的是对照组细菌死菌颗粒数。

实施例9乳酸片球菌YYS-J2在模拟人工胰液环境中的生存能力分析

(1)取发酵24h的菌YYS-J2，12000r/min离心5min收集菌体，加入同体积的生理盐水(0.85％)混匀备用；配制蛋白胰液(0.1％胰液素w/v，0.15％牛胆汁)，分别调pH值至7.5和8.0，经0.22μM微孔滤膜过滤后备用，取1mL的处理的菌液于9mL的不同pH值的蛋白胰液中，置于37℃恒温培养，在处理3、6(h)取样，每次取0.9mL，加入0.1ml PI稀释液，37℃染色10min，流式细胞仪检测细菌总数P1/％和死亡率P2/％，并以此计算出不同时间段存活率/％,以未处理的存活数为100％对照，计算细菌存活率；

细菌存活率的计算公式为：

活率/％＝[(P1_处理组-P2_处理组)/P1_处理组]/[(P1_对照-P2_对照)/P1_对照]。

(2)菌YYS-J2的细菌存活率结果见表8：

表8 YYS-J2在人工模拟胰液环境中的存活率/％

根据数据可知：菌YYS-J2在pH为7.5的胰液环境中处理3和6(h)时，存活率为91.29％和43.99％，在pH为8.0的胰液环境中存活率为65.33和44.52％，具有良好的胰液耐受能力。

本发明还提供以下乳酸片球菌YYS-J2的应用示例：

实施例12乳酸片球菌YYS-J2制备益生菌剂

将乳酸片球菌YYS-J2接种于培养基(例如MRS培养基)，0-38℃培养大于15h，离心收集菌体细胞，重悬于例如生理盐水或PBS缓冲液中，制备获得含乳酸片球菌YYS-J2的液体菌剂。可选地，将乳酸片球菌YYS-J2菌体细胞重悬于细胞保护剂和载体中，冷冻干燥获得含乳酸片球菌YYS-J2的固体菌粉制剂。

可选地，可将乳酸片球菌YYS-J2作为原料组分应用于降解或吸附丙烯酰胺、降低L-苯丙氨酸、高产苯乳酸、口腔抑菌产品、产SOD产品(例如食品、保健品)中，乳酸片球菌YYS-J2可以液体或固体制剂的形式存在于所述产品中。

实施例13乳酸片球菌YYS-J2制备发酵食品

制备乳酸片球菌YYS-J2发酵母液，以各种水果、中草药、谷物原料，各种糖类为辅料，接种乳酸片球菌YYS-J2，在一定的温度条件下(30-38℃)发酵一定的时间，制备发酵物，发酵物灭活或未灭活处理，原液或不同比例稀释后，加入常用饮料辅料，制备成发酵食品。

根据上述实施例的结果得出，本发明提供的乳酸片球菌YYS-J2具有以下性能和效果：

a.可利用纤维二糖、水杨苷等碳源物质，不能利用麦芽糖、蔗糖、棉子糖、乳糖、七叶苷、甘露醇、水杨苷、山梨醇、菊糖和马尿酸钠等糖水化合物。

b.乳酸片球菌YYS-J2可降解或吸附丙烯酰胺，去除率最高达70.41％，可在薯条等介质中降解或吸附丙烯酰胺，去除率高达78.30％。

c.可高效利用L-苯丙氨酸，对MRS自生携带的L-苯丙氨酸利用率为79.49-93.35％，可完全吸收利用0.5g/L、1g/L的外源L-苯丙氨酸。

d.可高产苯乳酸，在含有1.0g/L的苯丙氨酸的培养基中，苯乳酸产量高达741.12mg/L。

e.对变异链球菌(Streptococcus mutans)ATCC 25175具有优秀的抑菌作用，其抑菌圈直径高达35.00mm，同时对该菌具有较好的凝集作用，24h凝集率为53.08％。

f.可产SOD，SOD的酶活力为51.98±0.49U/mL。

g.菌YYS-J2在pH为2.5的胃液环境中存活1-2h，存活率为21.09-45.36(％)，在pH值为3.0的人工模拟胃液环境中可至少可存活5h，存活率在89.52-97.71(％)之间。

h.菌YYS-J2在pH为7.5的胰液环境中处理3h和6h，存活率为91.29％和43.99％，在pH为8.0胰液环境中处理3和6h，存活率为65.33％和44.52％。

i.菌YYS-J2从日常食物中分离获得，食用安全性高，能够作为具有降解或吸附丙烯酰胺、降低L-苯丙氨酸、高产苯乳酸、口腔抑菌产品、产SOD功能的产品应用于普通食品、保健品和药品中，具有广泛的应用前景。

综上所述，与现有技术相比，本发明提供的乳酸片球菌YYS-J2，具有以下有益效果：

该乳酸片球菌YYS-J2可为丙烯酰胺排毒产品、抗菌产品和产SOD产品等功能产品的开发提供新的益生菌源，具有重要的应用价值。例如：

(1)乳酸片球菌YYS-J2可作为组合物的原料组分，制备具有上述功能的组合物；其中，组合物包括但不限于微生物制剂、食品、保健品或药物等。

其中，菌种存在于组合物中的形式，包括但不限于乳酸片球菌YYS-J2未灭活菌、乳酸片球菌YYS-J2灭活菌、乳酸片球菌YYS-J2菌株的代谢物、乳酸片球菌YYS-J2冻干株中的一种或多种组合形式。优选地，在所述组合物中，所述乳酸片球菌YYS-J2的数量≥1×10⁶CFU/mL或≥1×10⁶CFU/g。进一步优选地，所述乳酸片球菌YYS-J2的数量≥1×10⁸CFU/mL或≥1×10⁸CFU/g。

(2)可以以各种植物(例如水果、中草药、谷物等)为原料，与各种配料配合，接种乳酸片球菌YYS-J2进行发酵处理制备发酵物，该发酵物可应用于具有降解或吸附丙烯酰胺、降低L-苯丙氨酸、高产苯乳酸、口腔抑菌、产SOD等功能的产品中；

其中，发酵原料可以是常规使用的各类植物发酵原料，包括但不限于上述方案的发酵原料选择。所述发酵物但不限于用于制备发酵食品，还可以是保健品、药品等产品；

综上，乳酸片球菌YYS-J2和/或其发酵物根据其特性，可应用于包括至少以下一种作用的功能产品中：

(1)降解或吸附丙烯酰胺；

(2)产SOD；

(3)利用或代谢L-苯丙氨酸；

(4)产苯乳酸；

其中，具备上述(1)-(5)功能的产品包括但不限于排毒产品、产SOD产品以及抑菌功能产品(例如口腔抑菌剂等)，具有排毒、产SOD、抑菌等功效；还可以具有基于(1)-(5)的作用与疾病产生或发展的关联性，起到其他的抑制疾病发生或发展的显向功效，包括但不限于排毒、产SOD、抑菌等功效；

例如：丙烯酰胺存在潜在的致癌性、神经毒性、遗传毒性、生殖毒性等，基于菌YYS-J2具有降低或吸附丙烯酰胺水平的作用，其应用于功能产品不仅可产生排毒显向功效，还预期其具有潜在的预防癌症风险等功效；同理，又例如：苯乳酸不仅具有抑菌功能，其还和丹参素一样药理作用，如抗血小板聚集活性、调节人体类固醇等，基于菌YYS-J2具有高效产苯乳酸的作用的原理，其应用于功能产品可产生抑菌功效，还预期其还具有抗血小板聚集活性、调节人体类固醇的显向功效；又例如，L-苯丙氨酸在体内堆积造成大脑和神经系统受损，基于菌YYS-J2具有高效利用L-苯丙氨酸的作用，预期其应用于功能产品中，可产生潜在的预防大脑和神经系统受损等功效；其中，所述功能产品包括但不限于食品、保健品或药品。

需要说明的是：

(1)定义：

本文中所使用的术语食品”一词是广义的，包括人类的食物和饮物。在某些实施方案中，所述食物产品适合于以及设计用于人类进食。本申请可用于制备粉剂、片剂等固体制剂，也分散于液体中制成液体制剂等适用于人类口服的制剂。

所述组合物包括但不限于微生物制剂、食品、保健品、药品，所述含有乳酸片球菌YYS-J2的组合物可用于其他形式的产品中。

所述乳酸片球菌YYS-J2在组合物中的存在形式包括但不限于未灭活菌、灭活菌、代谢物、冻干株等形式，预期所述乳酸片球菌YYS-J2还可以采用其他形式存在于组合物中。

(2)本申请涉及的相关现有技术手段或现有技术术语：

“SOD”为超氧化物歧化酶的简称。

本文中“对变异链球菌具有共聚能力”指的是：菌YYS-J2对变异链球菌具有凝集作用。

“OD”值是optical density(光密度)的缩写，又称吸光度，光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量存在定量关系，可以用这种定量关系测定被测物浓度。“OD_x”是将波长设定为Xnm时测定的光密度值，是追踪液体培养物中微生物密度的标准指标，通常用来指示菌体细胞密度。其中，“OD”值测定方法为现有技术，其原理和方法此处不再累述。

采用流式细胞仪测定细菌总数P1和死菌数P2为现有技术，其原理和方法此处不再累述。

乳酸菌生化实验按照GB4789.35标准方法进行，此为现有技术，其原理和方法此处不再累述。

牛津杯法是抗生素效价测定的一种方法，通常可以分为二剂量法和三剂量法，此为现有技术，其原理和方法此处不再累述。

(3)实施例中所使用的各培养基的配方如下：

MRS培养基(g/L)：酪蛋白胨10、牛肉提取物10、酵母提取物5、葡萄糖5、醋酸钠5、K2HPO4 2、柠檬酸二铵2、MgSO₄.7H₂O 0.2、MnSO₄.H₂O 0.05、吐温80 1；pH 6.2，固体培养基在以上基础上加2％琼脂和2％CaCO₃、121℃灭菌15min。

如未明确指出，本发明实施例中涉及的实验操作方法为本领域常规的实验操作方法，涉及的试剂或仪器均可从正规渠道商购获得。

另外，本领域技术人员应当理解，尽管现有技术中存在许多问题，但是，本发明的每个实施例或技术方案可以仅在一个或几个方面进行改进，而不必同时解决现有技术中或者背景技术中列出的全部技术问题。本领域技术人员应当理解，对于一个权利要求中没有提到的内容不应当作为对于该权利要求的限制。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种乳酸片球菌YYS-J2，其特征在于：其保藏编号为CGMCC No.28183。

2.组合物，其特征在于：其组分包含如权利要求1所述的乳酸片球菌YYS-J2。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述组合物包括食品、保健品、药物中的一种。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述组合物的组分中包含乳酸片球菌YYS-J2未灭活菌、乳酸片球菌YYS-J2灭活菌、乳酸片球菌YYS-J2菌株的代谢物、乳酸片球菌YYS-J2冻干株中的一种或多种组合。

5.发酵物，其特征在于：其为如权利要求1所述的乳酸片球菌YYS-J2发酵获得。

6.乳酸片球菌YYS-J2和/或其发酵物在制备功能产品中的应用，其特征在于：所述乳酸片球菌YYS-J2采用如权利要求1所述的乳酸片球菌YYS-J2。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述功能产品包括食品、保健品或药品。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述功能产品包括至少以下一种作用：

(1)降解或吸附丙烯酰胺；

(2)产SOD；

(3)利用或代谢L-苯丙氨酸；

(4)产苯乳酸；

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述功能产品包括抑菌产品、丙烯酰胺排毒产品以及产SOD产品。

10.如权利要求1所述的乳酸片球菌YYS-J2或如权利要求2-4任一项所述的组合物在制备发酵食品中的应用。