CN117701443A - 一种具有丙烯酰胺降解及铅吸附功能的卷曲乳杆菌yys-j3及其应用 - Google Patents

一种具有丙烯酰胺降解及铅吸附功能的卷曲乳杆菌yys-j3及其应用 Download PDF

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官雪芳
王�琦
赵大洲
黄君阳
林斌
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Xiamen Yuanzhidao Biotech Co ltd
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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，提供一种具有丙烯酰胺降解及铅吸附功能的卷曲乳杆菌YYS‑J3及其应用，该卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)YYS‑J3的保藏编号为CGMCC No.28184。该卷曲乳杆菌YYS‑J3可降解或吸附丙烯酰胺，可吸附乙酸铅，具有良好的SOD酶生产能力，均有良好的聚凝性，具有碳源生长适应性广等特征，该菌可为丙烯酰胺或重金属类排毒产品、SOD酶产品等功能产品的开发提供新的益生菌源，具有重要的应用价值。

Description

一种具有丙烯酰胺降解及铅吸附功能的卷曲乳杆菌YYS-J3及 其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种具有丙烯酰胺降解及铅吸附功能的卷曲乳杆菌YYS-J3及其应用。
背景技术
丙烯酰胺是碳水化合物在高温过程中，由还原糖和天冬氨酸发生美拉德反应产生的副产物，在油炸、烘烤或烤制食品中较为常见，现有研究表明，丙烯酰胺具有潜在的致癌性、神经毒性、遗传毒性、以及生殖毒性等，因此其被世界卫生组织列为2A级致癌物。丙烯酰胺可溶于水，其可通过呼吸道、消化道、皮肤等多种途径被人体吸收,影响人体健康。目前降低丙烯酰胺的方法主要为通过降低原料糖含量、加入有机酸等降低部分丙烯酰胺的生成，但这会影响食物的感官品质，且许多小作坊的油炸类食品并不注重这类隐性有害物质的含量，因此有必要需求一种可以日常养护的方法以及时去除食物或体内的丙烯酰胺。
随着现代工业的发展，铅被广泛应用于汽车、燃料、油漆、涂料、农药、蓄电池、印刷、化妆品等领域，这些铅直接进入大气、土壤、水体，大气中的铅直接通过呼吸道被人体吸收，土壤、水体中的铅被植物、动物富集吸收进入食物链也最终进入人体，危害人体健康。由于铅是一种蓄积性很强的重金属元素，不能被降解，其在体内大量蓄积后，对神经系统、免疫系统、呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统、心血管系统和骨骼组织均可造成伤害。目前医学上铅中毒主要通过导泻和催吐药物进行清除，对人体副作用极大，不适合作为日常排毒常规方法使用，因此有必要寻求一种可作为日常排毒的去除铅的有效方法。
超氧化物歧化酶(SOD)酶是一种集清除、激活、再生、修复、自愈和供养六位为一体的多功能活性酶系，具有抗辐射、抗癌、抗氧化和抗衰老等作用，SOD能够治疗心肌梗死、血管性心脏病、水肿、银屑病、皮炎、湿疹和瘙痒症等多种皮肤病，在临床上具有重要的应用价值，然而，由于其提取工艺复杂，产量极为有限，相关产品极为稀罕和昂贵。
益生菌是一类对人类健康有益的微生物，已有研究表明：益生菌可以通过多种途径调理机体平衡，然而现有市场上具有清除丙烯酰胺、吸附重金属铅的益生菌极少，如何开发一款兼具显著降解或吸附丙烯酰胺、吸附重金属铅、产SOD酶的益生菌，正是本领域技术人员致力于解决的问题和难点。
发明内容
为解决上述背景技术提到的现有技术的不足，本发明提供一种卷曲乳杆菌YYS-J3，来源于婴儿粪便，分类命名为：卷曲乳杆菌，拉丁文学名：Lactobacillus crispatus，于2023年8月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.28184。
本发明还提供一种组合物，其含有如上所述的卷曲乳杆菌YYS-J3。
进一步的，所述组合物包括微生物制剂、食品、保健品、药物中的一种。
进一步的，在所述组合物中，所述卷曲乳杆菌YYS-J3的数量≥1×106CFU/mL或≥1×106CFU/g。
优选的，在所述组合物中，所述卷曲乳杆菌YYS-J3的数量≥1×108CFU/mL或≥1×108CFU/g。
进一步的，所述组合物中包含卷曲乳杆菌YYS-J3未灭活菌、卷曲乳杆菌YYS-J3灭活菌、卷曲乳杆菌YYS-J3菌株的代谢物、卷曲乳杆菌YYS-J3冻干株中的一种或多种组合。
本发明还提供一种发酵物，所述发酵物由如上所述的卷曲乳杆菌YYS-J3发酵获得。
本发明还提供如上所述卷曲乳杆菌YYS-J3和/或其发酵物在制备功能产品中的应用。
进一步的，所述功能产品包括食品、保健品或药品。
进一步的，所述功能产品包括至少以下一种功能：
(1)降解或吸附丙烯酰胺；
(2)吸附重金属铅；
(3)产SOD酶；
(4)良好的碳源利用能力，例如可利用多种糖水化合物生长；
(5)良好的凝集性。
进一步的，所述功能产品包括丙烯酰胺排毒产品、重金属铅清除产品以及SOD酶产品。
本发明还提供如上所述的卷曲乳杆菌YYS-J3或如上所述的组合物在制备发酵食品中的应用。
进一步的，卷曲乳杆菌YYS-J3作为益生菌，利用水果、中草药进行发酵以制备发酵食品。
基于上述，与现有技术相比，本发明提供的卷曲乳杆菌YYS-J3，具有以下有益效果：
本发明提供的卷曲乳杆菌YYS-J3可降解或吸附丙烯酰胺，具有良好的重金属铅吸附能力，可产SOD酶，具有良好的聚凝能力，对多种糖水化合物均能生长利用，该菌可为排毒产品(丙烯酰胺和铅)、抗氧化产品等功能产品的开发提供新的益生菌源，具有重要的应用价值。
本发明的其它特征和有益效果将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他有益效果可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的卷曲乳杆菌YYS-J3的菌落形态图；
图2为本发明实施例提供的卷曲乳杆菌YYS-J3的扫描电镜图；
图3为本发明实施例提供的卷曲乳杆菌YYS-J3的16S r DNA目的片段扩增琼脂糖电泳图；
图4为本发明实施例提供的卷曲乳杆菌YYS-J3的16S rDNA基因的系统发育树图谱。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；下面所描述的本发明不同实施方式中所设计的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，本发明所使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义，不能理解为对本发明的限制；应进一步理解，本发明所使用的术语应被理解为具有与这些术语在本说明书的上下文和相关领域中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的意义来理解，除本发明中明确如此定义之外。
本发明一种卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)YYS-J3是从婴儿粪便中，采用MRS培养基厌氧培养获得，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28184。
实施例1YYS-J3菌的筛选分离
取约1g 9月龄婴儿粪便样品，于生理盐水稀释液中分别稀释至10-2倍、10-3倍、10-4倍，各取0.1mL的稀释液置于MRS培养基中厌氧培养，选取疑似乳酸菌的菌落若干株，纯化三代后，进行丙烯酰胺去除效果和乙酸铅吸附效果测试，选取去除或吸附效果较好的菌株保存并命名为YYS-J3。
实施例2YYS-J3菌的鉴定
2.1YYS-J3菌的形态观察
YYS-J3的菌落形态如图1所示，菌体形态如图2所示。卷曲乳杆菌YYS-J3的主要形态特征如下：菌落圆，在MRS培养基上呈乳白色，表面光滑，半透明，菌体呈杆状，宽0.6-0.7μm，长1.5-8μm。
2.2YYS-J3菌的碳源利用分析
乳酸菌生化实验按照GB4789.35标准方法进行，具体为配置七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、麦芽糖、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖、乳糖、1％(w/v)马尿酸钠的乳酸菌基础培养基。按照1％接种卷曲乳杆菌YYS-J3于其中，1％马尿酸钠还需在培养结束后，沿着试管壁缓缓加入0.2mL茚三酮溶液，不要振荡，在36℃±1℃的水浴中放置10min后判读结果，判读结果详见表1。
表1YYS-J3糖水化合物利用情况
注：“+”为实验阳性，“-”为实验阴性。
结论：根据表1结果可知：YYS-J3菌可利用麦芽糖、蔗糖、棉子糖、乳糖、七叶苷、纤维二糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、菊糖等糖类物质,具有底物适应性广的特征，不能利用马尿酸钠。
2.3YYS-J3菌的分子生物学鉴定
①YYS-J3菌基因组DNA的提取：采用TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取；
②16S rDNA序列的PCR扩增：扩增16SrDNA基因序列，所用引物为：
F 9-27：5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
R 1525-1542：5’–AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’；
PCR反应体系：2×Mix 12.5μL，引物及DNA各1μL，ddH20 9.5μL。
PCR扩增程序：93℃预变性4min。然后94℃变性30s，55℃(16SrDNA)，72℃延伸90s，共30个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。
③PCR产物检测及测序分析：取5ul的PCR产物，在加入EB的1.0％(w/v)的琼脂糖中凝胶电泳分离检验，扩增得到16SrDNA目的片段长为1480bp(16S r DNA目的片段扩增琼脂糖电泳图详见图3),
④系统发育分析：在NCBI数据中对各16S rRNA序列进行Blast比对分析，得到序列与Lactobacillus crispatus的序列同源性均大于99.7％，进行MEGA 4中的Neighbor-joining方法发育树的构建分析(结果见图4)。
卷曲乳杆菌YYS-J3 16S rDNA序列测定结果如下：
GGGGGGTACTATACATGCAGTCGAGCGAGCGGAACTAACAGATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGAAAGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCGTAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTTTAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAAAGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCCATTTGTAGAGATACAAAGTTCCCTTCGGGGACGCTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTATTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGTACAACGAGAAGCGAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCTCTGAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTCTGCAATGCCCAAAGCCGGTGGCCTAACCTTCGGGAAGGAGCCGTCTAAGGCAGGGCAGATGACTGGGGTGAAGTTCGA。
结论：结合YYS-J3菌的形态观察，乳酸菌生化鉴定，以及DNA系统发育树中的同源性分析，确定YYS-J3为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)菌种。
本发明提供的卷曲乳杆菌YYS-J3的性能表征如下：
实施例3卷曲乳杆菌YYS-J3对丙烯酰胺的去除效果分析
将卷曲乳杆菌YYS-J3母液按照1％(v/v)的量分别接种于MRS培养基中，37℃厌氧培养24-48h后，流式细胞仪测定菌液活菌数为5.25*108cfu/mL，得到卷曲乳杆菌YYS-J3发酵液。在发酵液中加入丙烯酰胺至终浓度为10mg/L,37℃静置培养24h，以未接种的MRS培养基为对照，取2mL的发酵液离心后取上清液，过0.22μm微孔滤膜后于棕色液相色谱进样瓶中，采用Waters Alliance e1695高相液相色谱检测，检测条件为SunFire C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)进样量：5μL，流速：1mL/min，流动相：乙腈：甲醇：水＝1：3：96，进样温度：30℃，检测波长：210nm，出峰时间5.3-5.6min。对照为未接种的10mg/L丙烯酰胺+MRS培养基(CK)，测定各处理丙烯酰胺浓度，丙烯酰胺的去除率(％)＝(CK-处理组)/CK*100％。获得卷曲乳杆菌YYS-J3在发酵液中处理24h对丙烯酰胺的去除率为56.72±0.31％。
实施例4卷曲乳杆菌YYS-J3在薯条介质中对丙烯酰胺的去除效果
取市售油炸薯条，将薯条粉碎后，称取5g样品加入到10mL的上述卷曲乳杆菌YYS-J3发酵液和灭活发酵液(发酵液煮沸15min)中，以未发酵的MRS培养基为对照，加入丙烯酰胺至终浓度为5mg/L,混匀后37℃静置，在2h和4h取样离心取上清液，测定丙烯酰胺含量，测试结果见表2。由表2可知，在处理2h和4h后，卷曲乳杆菌YYS-J3发酵液对薯条中的丙烯酰胺的去除率为70.65％和70.62％,灭活后的卷曲乳杆菌YYS-J3发酵液对薯条中的丙烯酰胺的去除率为52.30％和67.28％,表明卷曲乳杆菌YYS-J3发酵液或其灭活发酵物均可用于去除薯条中的丙烯酰胺。且与在发酵液中的处理24h效果(见实施例3)相比，在薯条介质中处理2h和4h后去除率均高于发酵液中的去除率，且灭活后的发酵液对丙烯酰胺的去除率菌大于50％，说明卷曲乳杆菌YYS-J3有利于应用于薯条等食物中丙烯酰胺的去除。
表2卷曲乳杆菌YYS-J3对薯条中的丙烯酰胺去除率
实施例5卷曲乳杆菌YYS-J3对乙酸铅的吸附能力
取发酵24h的卷曲乳杆菌YYS-J3发酵液，加入乙酸铅至其终浓度约为25mg/L,以未接菌的MRS培养基为对照，接种卷曲乳杆菌YYS-J3发酵培养24h后，取发酵液离心测定铅含量；取发酵24-48h的卷曲乳杆菌YYS-J3发酵液，4500r/min离心10min收集菌体，加入PBS缓冲液使用流式细胞仪计数，调整菌体浓度为(1.0±0.1)*109cfu/mL，以未加菌体的PBS缓冲液为对照，加入乙酸铅至其终浓度约为1mg/L，于37℃静置，每30分钟取出混匀一次，4小时候取出离心取上清液参照国标GB5009.12-2017中石墨炉原子吸收光谱法进行,检测仪器为PinAAcle900Z原子吸收光谱仪。铅吸附率(％)＝(铅含量对照-铅含量处理组)/铅含量对照*100％。结果表明：卷曲乳杆菌YYS-J3发酵液和卷曲乳杆菌YYS-J3菌悬液均对铅有良好的吸附作用，其中卷曲乳杆菌YYS-J3发酵液对铅的吸附率为76.56％，卷曲乳杆菌YYS-J3菌体对铅的吸附率为81.21％。
表3卷曲乳杆菌YYS-J3对乙酸铅的吸附率
卷曲乳杆菌YYS-J3 MRS发酵液处理24h PBS介质处理4h
乙酸铅吸附率/％ 76.56±1.06 81.21±1.53
实施例6卷曲乳杆菌YYS-J3产SOD酶测试
SOD酶检测采用超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成)进行，具体为取上述卷曲乳杆菌YYS-J3发酵液离心获得上清液，将上清液与水按照2:3(v/v)的比例混合后，根据试剂盒要求说明书操作表(表4)进行，制备反应体系，将混合体系混匀，37℃孵育20分钟，450nm处酶标仪读取OD值，本研究反应体系中SOD抑制率达50％时所对应的酶量为一个SOD活力单位(U)。SOD活力值的计算公式如下：
其中，A对照表示对照组的OD值，A对照空白表示对照空白组的OD值，A测定表示测定组的OD值，A测定空白表示测定空白组的OD值。
表4试剂盒反应体系操作表
测试结果表明：卷曲乳杆菌YYS-J3发酵上清液中SOD酶活力为51.33±0.95U/mL,表明卷曲乳杆菌YYS-J3具有良好的产SOD酶能力。
实施例7卷曲乳杆菌YYS-J3的自凝集率和它凝集率测试
分别制备卷曲乳杆菌YYS-J3发酵液、变异链球菌发酵液和大肠杆菌发酵液，其中YYS-J3发酵液为将YYS-J3母液按照1％(v/v)接种于MRS培养基中，厌氧培养48h,变异链球菌发酵液为将变异链球菌(Streptococcus mutans ATCC 25175)按照1％(v/v)的量接种于脑心浸液培养基中，37℃150r/min发酵培养24h,大肠杆菌发酵液为将大肠杆菌(Escherichia coli ATCC35150)按照1％(v/v)的量接种于LB培养基中37℃150r/min发酵培养24h。各自取2mL以上各种菌发酵液，单独置于12000r/min、4℃下离心5min，收集菌泥，分别用pH＝7.0的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤菌泥2次(即在菌泥中加入PBS，震荡混合均匀后，置于12000r/min、4℃下离心5min，收集菌泥)，用无菌的PBS将以上菌泥调节至600nm处的吸光值为0.6±0.1(A0)的菌悬液，制备获得各种菌的菌悬液计为AO。
自凝集率测试：将上述卷曲乳杆菌YYS-J3A0菌悬液，静置不同时间段(2h、4h、24h)后测定吸光值AX。
自凝集率(％)＝(1-Ax/A0)×100％；
其中，x为2、4、24；A2表示菌悬液静置2h后测定的吸光值，A4表示菌悬液静置4h后测定的吸光值，A24表示菌悬液静置24h后测定的吸光值，下同。
它凝集率测试：分别取上述YYS-J3菌悬液、变异链球菌菌悬液和大肠杆菌的悬菌液AO,取上述1ml YYS-J3菌悬液和1ml变异链球菌菌悬液混合得第一混合悬浮菌液，取1mlYYS-J3菌悬液和1ml大肠杆菌的悬菌液混合得第二混合悬浮菌液，静置不同时间段(2h、4h、24h)后分别测定第一混合悬浮菌液和第二混合悬浮菌液的吸光值A。
它凝集率(％)＝(1-Ax/A0)×100％；
其中，x为2、4、24。
结果见下表5：可知卷曲乳杆菌YYS-J3在2h、4h、24h的自凝集率分别为19.08％、57.50％和77.17％，其自凝集率较高，这表明其具有较好的生产胞外多糖的能力；卷曲乳杆菌YYS-J3与变异链球菌的凝集率分别为43.75％、55.08％和76.58％，与大肠杆菌的凝集率在9.67％-47.92％之间，表明YYS-J3具有很好的致病菌凝集特征，这将有利于变异链球菌的高效去除，对大肠杆菌也具有一定的聚集作用。
表5卷曲乳杆菌YYS-J3的自凝集率和它凝集率
凝集时间/h 2 4 24
自凝集率/％ 19.08±1.77 57.50±2.36 77.17±2.36
对变异链球菌的凝集率/％ 43.75±0.59 55.08±2.00 76.58±0.35
对大肠杆菌的凝集率/％ 9.67±0.00 32.00±2.36 47.92±0.18
实施例8卷曲乳杆菌YYS-J3在模拟人工模拟胃液环境中的存活率分析
(1)存活率测试过程为：取发酵24h的卷曲乳杆菌YYS-J3发酵液，12000r/min离心5min收集菌体，加入同体积的0.85％(w/v)生理盐水混匀获得菌悬液；配制人工胃液(125mMNaCl，7mM KCl,45mM NaHCO3和3g/L pepsin)，调pH值至2.0、2.5、3.0，经0.22μM微孔滤膜过滤后备用；取1mL的菌悬液于9mL的以上不同pH的人工胃液中，置于37℃恒温培养，处理x(1、2、3、5)h样品，每次取0.9mL处理样品，加入0.1mL 20ug/mL的碘化丙啶(PI)，37℃染色10min后，取0.1mL于0.9mL的超纯水中，流式细胞仪检测细菌总数P1和死亡数P2，并以此计算出不同时间段存活率/％,以未经人工胃液处理的菌悬液中的存活数为100％对照，计算各处理胃肠耐受力；
不同处理时间细菌存活率的计算公式为：
存活率(％)＝[(P1处理组-P2处理组)/P1处理组]/[(P1对照-P2对照)/P1对照]；
其中，P1处理组指的处理组细菌总颗粒数，P2处理组指的是处理组细菌死菌颗粒数，P1对照指的是对照组细菌总颗粒数，P2对照指的是对照组细菌死菌颗粒数。
(2)卷曲乳杆菌YYS-J3在不同胃液环境中的存活率见表6，根据数据可知：
卷曲乳杆菌YYS-J3在胃液pH值为2.0的模拟胃液环境中处理1h，存活率为53.13％，处理2h-5h,存活率稳定在17.26％-19.88％之间；在pH值为2.5的模拟胃液环境中处理1-5h时，卷曲乳杆菌YYS-J3的存活率为99.84-66.99％；在pH值为3.0的模拟胃液环境中处理1-5h时，卷曲乳杆菌YYS-J3的存活率大于100％，表明卷曲乳杆菌YYS-J3在人工模拟胃液环境中具有良好的耐受能力，在pH值为3.0的胃液环境中不受影响。
表6卷曲乳杆菌YYS-J3在人工模拟胃液环境中的存活率(％)
实施例9卷曲乳杆菌YYS-J3在模拟人工胰液环境中的生存能力分析
(1)取发酵24h的卷曲乳杆菌YYS-J3发酵液，12000r/min离心5min收集菌体，加入同体积的0.85％(w/v)生理盐水混匀制备成菌悬液备用；配制蛋白胰液[0.1％(w/v)胰液素，0.15％(w/v)牛胆汁]，分别调pH值至7.5和8.0，经0.22μM微孔滤膜过滤后备用，取1mL的上述菌悬液于9mL的不同pH值的蛋白胰液中，置于37℃恒温培养，在处理3h、6h后取样，每次取0.9mL处理样品，加入0.1mL P I稀释液，37℃染色10min，流式细胞仪检测细菌总数P1和死亡数P2，并以此计算出不同时间段存活率,以未处理的菌悬液存活数为对照，计算细菌存活率；
细菌存活率的计算公式为：
存活率(％)＝[(P1处理组-P2处理组)/P1处理组]/[(P1对照-P2对照)/P1对照]；
其中，P1处理组指的是处理组细菌总颗粒数，P2处理组指的是处理组细菌死菌颗粒数，P1对照指的是对照组细菌总颗粒数，P2对照指的是对照组细菌死菌颗粒数。卷曲乳杆菌YYS-J3的细菌存活率结果见表7，根据数据可知：
卷曲乳杆菌YYS-J3在pH为7.5的胰液环境中处理3h和6h后，存活率分别为99.09％和98.29％，在pH为8.0的胰液环境中存活率分别为101.10％和101.05％，表明其不受胰液的影响。
表7卷曲乳杆菌YYS-J3在人工模拟胰液环境中的存活率(％)
本发明还提供以下卷曲乳杆菌YYS-J3的应用示例：
实施例10卷曲乳杆菌YYS-J3制备益生菌剂
将卷曲乳杆菌YYS-J3接种于培养基，例如MRS培养基，0-38℃培养大于15h，离心收集菌体细胞，重悬于例如生理盐水或PBS缓冲液中，制备获得含卷曲乳杆菌YYS-J3的液体菌制剂。
可选地，将卷曲乳杆菌YYS-J3菌体细胞重悬于细胞保护剂和载体中，冷冻干燥获得含卷曲乳杆菌YYS-J3的固体菌粉制剂。
可选地，将卷曲乳杆菌YYS-J3作为原料组分应用于丙烯酰胺排毒产品、重金属铅排毒产品、SOD产品(例如食品和保健品)中，卷曲乳杆菌YYS-J3可以以液体或固体制剂的形式存在于所述产品中。
实施例11卷曲乳杆菌YYS-J3制备发酵食品
制备卷曲乳杆菌YYS-J3发酵母液，以各种水果、中草药、谷物原料，各种糖类为辅料，接种卷曲乳杆菌YYS-J3，在一定的温度条件下(30-38℃)发酵一定的时间，制备发酵物，发酵物灭活或未灭活处理，原液或不同比例稀释后，加入常用饮料辅料，制备成发酵食品。
根据上述实施例的结果得出，本发明提供的卷曲乳杆菌YYS-J3具有以下性能和效果：
a.可利用七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、麦芽糖、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖、乳糖等多种碳源物质，碳源生长适应性广。
b.可降解或吸附丙烯酰胺，在MRS介质中的去除率为56.72％，在含有薯条的介质中对丙烯酰胺的去除效果更佳，处理2h和4h的去除率均大于70％，其灭活发酵液同样可以去除丙烯酰胺，处理2h和4h的去除率分别为52.30％和67.28％
c.可吸附重金属铅，在含铅PBS介质(铅含量1mg/L)和MRS介质中(铅含量25mg/L)的吸附率为81.21％和76.56％。
d.可产SOD酶，其发酵上清液的SOD酶活力为51.33U/mL。
e.具有良好的凝集率，其自凝集率最高为77.17％，24h对变异链球菌的凝集率高达76.58％，对大肠杆菌的凝集率为47.92％。
f.在pH为2.0的人工模拟胃液环境中存活1h，存活率为53.13％，在pH值为2.5的人工模拟胃液环境中可至少存活5h，存活率在66.99％-99.94％之间，在pH值为3.0的人工模拟胃液环境中，存活率不受其影响。
g.在pH为7.5的胰液环境中处理3-6h，存活率高达大于98％，在pH为8.0的胰液环境中处理3-6h，存活率不受影响。
h.卷曲乳杆菌YYS-J3从人源健康婴儿粪便中分离获得，食用安全性高，能够作为丙烯酰胺排毒、重金属铅排毒，SOD酶、产品应用于普通食品、保健食品和药品中，具有广泛的应用前景。
综上所述，与现有技术相比，本发明提供的卷曲乳杆菌YYS-J3，具有以下有益效果：
该卷曲乳杆菌YYS-J3可降解或吸附丙烯酰胺，具有良好重金属铅吸附能力，可产SOD酶，具有良好的它聚集能力，具有广泛的碳源利用能力，该菌为在功能性产品的开发提供新的益生菌源，具有重要的应用价值，例如：
(1)卷曲乳杆菌YYS-J3可作为组合物的原料组分，制备具有上述功能的组合物；其中，组合物包括但不限于微生物制剂、食品、保健品或药物等。
其中，菌种存在于组合物中的形式，包括但不限于卷曲乳杆菌YYS-J3未灭活菌、卷曲乳杆菌YYS-J3灭活菌、卷曲乳杆菌YYS-J3菌株的代谢物、卷曲乳杆菌YYS-J3冻干株中的一种或多种组合形式。优选地，在所述组合物中，所述卷曲乳杆菌YYS-J3的数量≥1×106CFU/mL或≥1×106CFU/g。进一步优选地，所述卷曲乳杆菌YYS-J3的数量≥1×108CFU/mL或≥1×108CFU/g。
(2)可以以各种植物(例如水果、中草药、谷物等)为原料，与各种配料配合，接种卷曲乳杆菌YYS-J3进行发酵处理制备发酵物，该发酵物可应用于制备具有解酒、抗氧化或减肥功能的产品中；
其中，发酵原料可以是常规使用的各类植物发酵原料，辅料也可采用现有常规辅料，包括但不限于上述方案选择。所述发酵物但不限于用于制备发酵食品，还可以是保健品、药品等产品；
综上，卷曲乳杆菌YYS-J3和/或其发酵物根据其特性，可应用于包括至少以下一种功能的功能产品中：
(1)降解或吸附丙烯酰胺；
(2)产SOD酶；
(3)吸附乙酸铅；
(4)良好的凝集特性；
(5)良好的碳源利用能力。
其中，具备上述(1)-(5)功能的产品包括但不限于丙烯酰胺或重金属类排毒产品、SOD酶产品功能产品，具有排毒、抗氧化等显向功效；还可以是具有基于(1)-(5)的功能产生的其他显向功效的产品；其中，所述功能产品包括但不限于食品、保健品或药品。
需要说明的是：
(1)定义：
本文中所使用的术语“食品”一词是广义的，包括人类的食物和饮物。在某些实施方案中，所述食物产品适合于以及设计用于人类进食。本申请可用于制备粉剂、片剂等固体制剂，也分散于液体中制成液体制剂等适用于人类口服的制剂，包括但不限于粉体。
所述组合物包括但不限于微生物制剂、食品、保健品、药品，所述含有卷曲乳杆菌YYS-J3的组合物可用于其他形式的产品中。
所述卷曲乳杆菌YYS-J3在组合物中的存在形式包括但不限于未灭活菌、灭活菌、代谢物、冻干株等形式，预期所述卷曲乳杆菌YYS-J3还可以采用其他形式存在于组合物中。
所述功能产品包括上述降解或吸附丙烯酰胺、吸附重金属铅，产SOD酶、高聚集性等作用，根据上述作用，其应用到功能产品的降解或吸附丙烯酰胺、吸附重金属铅，产SOD酶；由于其具有上述降解或吸附丙烯酰胺、吸附重金属铅，产SOD酶等作用，其应用产品的功效包括但不限于为排毒、抗氧化，其他的通过上述作用所可以起到的对人体的功效均可。
(2)本申请涉及的相关现有技术手段或现有技术术语：
“OD”值是optical density(光密度)的缩写，又称吸光度，光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量存在定量关系，可以用这种定量关系测定被测物浓度。“ODx”是将波长设定为Xnm时测定的光密度值，是追踪液体培养物中微生物密度的标准指标，通常用来指示菌体细胞密度。其中，“OD”值测定方法为现有技术，其原理和方法此处不再累述。
“SOD”为超氧化物歧化酶。
采用流式细胞仪测定细菌总数P1和死菌数P2为现有技术，其原理和方法此处不再累述。
采用乳酸菌生化鉴定条进行碳源利用分析，此为现有技术，其原理和方法此处不再累述。
(3)实施例中所使用的各培养基的配方如下：
MRS培养基(g/L)：酪蛋白胨10g、牛肉提取物10g、酵母提取物5g、葡萄糖5g、醋酸钠5g、K2HPO4 2g、柠檬酸二铵2g、MgSO4.7H2O 0.2g、MnSO4.H2O 0.05g、吐温80 1mL,pH＝6.2，固体培养基在以上基础上加2％琼脂和2％ CaCO3、121℃灭菌15min。
脑心浸液培养基(g/L)：脑浸粉5.0，心浸粉12.5，蛋白胨5.0，胰蛋白胨10.0，氯化钠5.0，葡萄糖2.0，磷酸氢二钠2.5，琼脂20.0(液体培养基不含)，pH 7.4±0.2，121℃，15min灭菌。
LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，氯化钠10.0，酵母浸粉5.0，pH 7.5；(固体培养基加琼脂粉20.0g),121℃灭菌15min。
如未明确指出，本发明实施例中涉及的实验操作方法为本领域常规的实验操作方法，涉及的试剂或仪器均可从正规渠道商购获得。
另外，本领域技术人员应当理解，尽管现有技术中存在许多问题，但是，本发明的每个实施例或技术方案可以仅在一个或几个方面进行改进，而不必同时解决现有技术中或者背景技术中列出的全部技术问题。本领域技术人员应当理解，对于一个权利要求中没有提到的内容不应当作为对于该权利要求的限制。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种具有丙烯酰胺降解及铅吸附功能的卷曲乳杆菌YYS-J3，其特征在于：其保藏编号为CGMCC No.28184。
2.一种组合物，其特征在于：含有如权利要求1所述的卷曲乳杆菌YYS-J3。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述组合物包括微生物制剂、食品、保健品、药物中的一种。
4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述组合物中包含卷曲乳杆菌YYS-J3未灭活菌、卷曲乳杆菌YYS-J3灭活菌、卷曲乳杆菌YYS-J3菌株的代谢物、卷曲乳杆菌YYS-J3冻干株中的一种或多种组合。
5.一种发酵物，其特征在于：所述发酵物由如权利要求1所述的卷曲乳杆菌YYS-J3发酵获得。
6.如权利要求1所述的卷曲乳杆菌YYS-J3和/或如权利要求5所述的发酵物在制备功能产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述功能产品包括食品、保健品或药品。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述功能产品包括至少以下一种功能：
(1)降解或吸附丙烯酰胺；
(2)吸附重金属铅；
(3)产SOD酶；
(4)良好的碳源利用能力；
(5)良好的凝集性。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述功能产品包括丙烯酰胺排毒产品、重金属铅清除产品以及SOD酶产品。
10.如权利要求1所述的卷曲乳杆菌YYS-J3或如权利要求2-4任一项所述的组合物在制备发酵食品中的应用。
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