CN111676160A - 牛大力内生菌rh5在促进牛大力生长中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛大力内生菌RH5在促进牛大力生长中的应用，牛大力内生菌RH5的分类命名为伯克霍尔德菌属(Burkhoideria sp.)RH5，已于2020年5月29日提交至广东省微生物保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO：61030。本发明在牛大力生长过程中加入内生菌RH5，该菌株对牛大力的生长具有较强的促生作用，能够提升牛大力药材的产量与质量。

Description

牛大力内生菌RH5在促进牛大力生长中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种牛大力内生菌RH5在促进牛大力生长中的应用。

背景技术

植物内生菌是指一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细 菌。普遍存在于高等植物中，木本、草本植物，单子叶植物和双子叶植物内均有内生细菌。 在长期协同进化的过程中，内生菌与宿主植物之间形成了稳定的互利共生关系。宿主为内 生菌提供生长所需的营养物质和一个相对稳定的生活环境，内生菌生活在植物体内，很大 程度上避免了外界环境中存在的各种严峻的竞争压力；而内生菌在其自身的生命过程中所 产生的代谢产物又可以促进宿主植物的生长发育，提高宿主植物对不良环境的适应能力。 因此它广泛的生物学作用及其在农业、环境保护等领域的应用潜力已引起人们的高度关注。

牛大力(Callerya speciosa)为豆科(Leguminosae)鸡血藤属(Callerya)植物，又称美丽鸡血 藤、牛大力藤、美丽崖豆藤等，主要分布于中国福建、广东、广西、贵州、海南等地，广 泛栽培于华南地区。牛大力以块根入药，味甘，性平，归肺、肾经，具有补虚润肺、强筋活络的功效，临床证明牛大力对腰肌劳损、风湿性关节炎、肺虚咳嗽、肺结核、慢性支气 管炎、慢性肝炎等慢性疾病有较好的疗效。牛大力作为主要原料被制药企业加工为壮腰健 肾丸、强力健身胶囊、桂龙药膏等中成药，在全国广泛应用。除了作为多种中成药的主要 原料之外，牛大力还被广泛用作煲汤原料、制作药膳、药酒等。

目前牛大力的生长周期长，一般需要6-8年才能采收，如何缩短牛大力的种植周期， 提高药材的产量与质量已成为亟待解决的一大难题。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种牛大力内生菌RH5在促进牛大力生长中的应用，牛 大力内生菌RH5的分类命名为伯克霍尔德菌属(Burkholderia arboris)RH5，已于2020年5 月25日提交至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO：61030，该菌株 对牛大力的生长具有较强的促生作用，能够提升牛大力药材的产量与质量。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种牛大力内生菌RH5在促进 牛大力生长中的应用，牛大力内生菌RH5分类命名为伯克霍尔德菌属(Burkhoideriasp.) RH5，保藏号：GDMCC NO：61030，所述牛大力内生菌RH5用于促进牛大力生长。

优选的是，所述牛大力内生菌RH5的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的是，所述牛大力内生菌RH5保存在甘油中。

优选的是，甘油浓度为20％。

优选的是，具体步骤为：先将牛大力内生菌RH5与液体LB培养基混匀，即得菌悬液，然后将菌悬液浇灌至牛大力植物的根部。

优选的是，牛大力内生菌RH5与液体LB培养基的体积比为：1:500。

优选的是，液体LB培养基包括：胰蛋白胨，酵母提取物，NaCl。

优选的是，每升液体LB培养基具体包括：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5gNaCl， 且其pH为7.4。

本发明至少包括以下有益效果：

在牛大力生长过程中加入牛大力内生菌RH5，该菌株对牛大力的生长具有较强的促生 作用，能够提升牛大力药材的产量与质量。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明 的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述牛大力内生菌RH5的菌株形态特征图；

图2为本发明所述牛大力内生菌RH5基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树图。

注：牛大力内生菌RH5分类命名为伯克霍尔德菌属(Burkholderia arboris)RH5，已于 2020年5月25日提交至广东省微生物菌种保藏中心，保藏号：GDMCC NO：61030。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字 能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，试剂和材 料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。甲醇为市购分析纯甲醇。2X Tag Master Mix购自宝生物工程有限公司(Takara)，Primer-F、Primer-R由北京奥科生物有限公司合成。

实施例

一、菌株的分离与纯化

供试材料：采自广西广泽健康产业股份有限公司的美丽鸡血藤[Calleryaspeciosa (Champ.ex Benth)Schot]。

NA培养基：每升NA培养基中含有牛肉浸膏3g、酵母膏1g、蛋白胨5g、蔗糖10g、 琼脂15g，且其pH为7.0。

将长度为5-6cm新鲜健康的牛大力根用流水冲洗干净后，移至超净工作台，在无菌条件下，将洗净后的牛大力根用75％乙醇消毒15s，再用浓度为0.1％的升汞溶液灭菌8-10min，灭菌后用无菌水洗4-5次，无菌滤纸吸干表面水分备用。

刮去消毒好的牛大力根表皮，切成长度为1cm的根段，放入无菌研钵中，加入5mL无菌水进行研磨，研磨充分后将研磨液体转移至无菌离心管中，静置10min，取0.5mL 上清液进行梯度稀释10～106倍，然后每个浓度梯度吸取100μL稀释液涂布于NA平板上， 每个浓度梯度重复3次。吸取最后一次漂洗的无菌水涂布在NA平板上，作为阴性对照。 NA平板置于生化培养箱28℃恒温培养24～96h，挑取不同形态菌落反复划线纯化，将纯 化的牛大力内生细菌菌株，用浓度为20％的甘油保存。

二、菌株的鉴定

1、形态学特征

将纯化好的菌株接种在NA培养基上，置于28℃培养24h，观察菌株的菌落形态特征。 同时，取上述在NA培养基上培养24h的菌株进行革兰氏染色并镜检。将所观察到的形态结果照相，如图1所示，菌株菌落在NA平板上呈淡黄色，表面光滑，隆起，边缘整齐， 圆形，在NA平板上培养5d直径为3-4mm。

2、16S rDNA序列及其系统发育学分析

2.1、DNA模板的制备

A、试剂：(1)裂解缓冲液：Tris-Ac(pH 7.8)40mM、NaAc 20mM、EDTA 1mM、 SDS 1％(w/v)；(2)5M NaCl溶液。

B、提取步骤：

a.将1.5mL细菌过夜培养液培养物置于微量离心管(EP管)内，12000rpm离心0.5min，弃去上清液，保留沉淀物；

b.在沉淀物中加入400μL裂解缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬；

c.加入200ul 5M的NaCl，充分混匀，12000rpm离心10min，离心后取600μL上 清液；

d.在步骤c获取的上清液中加入等体积的酚/氯仿(1:1)，混匀后12000rpm离心10min， 离心后将上清液转入干净的EP管中；

e.向步骤d获得的上清液中加入等体积氯仿，混匀，混匀后12000rpm离心10min，离心后将上清液转入另一干净的EP管中；

f.向步骤e所得上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，置于室温10min，然后12000rpm离心10min，离心后弃去上清液，保留沉淀物；

g.用体积浓度为70％乙醇洗涤步骤f所得沉淀物，晾干，即为DNA；

h.将步骤g中已干的DNA溶于30μL双蒸水(ddH₂O)中，-20℃保存。

2.2、PCR扩增16S rDNA序列

(1)PCR仪：ABI 3730-XL DNA测序仪(Applied Biosystems，USA)；

(2)扩增引物：Primer-F的序列为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′如SEQ ID NO.2所示；Primer-R：5′-GGTTACCTTGTTACGACT-3′如SEQ ID NO.3所示；

如序列表所示序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3分别是Primer-F和Primer-R对应的 序列，是由北京奥科生物有限公司合成。

(3)扩增体系：16S rDNA序列PCR扩增体系如表1所示：

表1

2.3、PCR扩增产物的电泳检测

使用1％的琼脂糖凝胶(含Gel red 5μL/100mL)，1×TAE电泳缓冲液，150V电压电泳 20min，PCR产物上样量为3μL，与1μL Loading dye混匀后点样。用凝胶成像系统观察 结果，以TaKaRa公司的DL1000 DNA Marker为核酸标准分子量参照物，确定扩增片段长 度为1396bp。对于目的条带正确的菌液进行送测，测序由深圳华大基因科技有限公司进 行，测序结果所得的序列如SEQ ID No.1所示。

如序列表所示的SEQ ID No.1是牛大力内生菌RH5的16S rDNA基因序列，该牛大力内生菌RH5的分类命名为伯克霍尔德菌属(Burkholderia arboris)RH5，已于2020年5月 25日提交至广东省微生物菌种保藏中心，该微生物菌种保藏中心的具体地址是：广州市 先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC NO：61030。

2.4、系统进化树的构建

将所测的16S rDNA序列与GenBank基因库中已测定的细菌的16S rDNA序列进行比对，根据比对结果下载相关序列。通过MEGA 6.0的邻接算法(Neighbor-joining，NJ)进 行系统分析并构建系统进化树，如图2所示，所测的16S rDNA序列与Burkhoideria sp.的 相似性高达99％，结合形态学特征，将其鉴定为Burkhoideria sp.RH5。

三、牛大力内生菌RH5的应用方法

先将牛大力内生菌RH5与液体LB培养基混匀，于恒温摇床220rmp、28℃条件下摇菌培养12h，然后将菌悬液浇灌至牛大力植物的根部即可。

其中，牛大力内生菌RH5与LB培养基的体积比为：1:500；每升液体LB培养基具体包括：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，且其pH为7.4。

四、检测

(1)牛大力内生菌RH5产IAA能力测定

L-色氨酸配制成溶液，用0.22μm细菌滤器进行过滤除菌，过滤后加入到经121℃高压灭菌的LB液体培养基中，配制成L-色氨酸终浓度为0.5g/L的IAA检测培养基。牛大 力内生菌RH5过夜扩大培养：按1％(v/v)的接种比例接种到上述IAA检测培养基中， 于180rpm、30℃条件下培养48h；培养后菌液经离心机在转速8000rpm下离心10min 后，取500μL上清液于白瓷板中，加入等体积Salkowski's显色剂混匀，得混合液，其中， Salkowski's显色剂的配置方法为：将150mL浓硫酸溶于250mL去离子水中，加入7.5mL 0.5M的FeCl₃·6H₂0溶液即可。以IAA标准液为对照，将混合液室温下避光放置30min， 观察颜色变化。反应液出现粉红色则表示菌株有产IAA的能力。定量检测：用稀NaOH 溶解IAA配制成浓度为100mg/L的IAA母液，用LB做稀释液梯度稀释IAA母液为0、 5、10、20、30、40、50mg/L浓度的IAA溶液，取各浓度IAA溶液与Salkowski's显色液 按1:1的体积混合，室温避光放置30min，以空白LB培养基调零，用分光光度计测定各 个浓度IAA溶液的OD₅₃₀值。以IAA浓度为横坐标，λ＝530nm时的吸光度为纵坐标，绘 制标准曲线。按上述方法再次培养菌株，获得上清液。吸取2mL加入到10mL离心管中， 加入等量Salkowski's显色剂摇匀，静置30min后，用分光光度计测定530nm处的吸光值， 根据标准曲线计算内生细菌的产IAA量。

检测结果如表1所示，IAA是普遍存在的生长素类物质，对植物细胞生长和根系发育 具有促进作用。牛大力内生菌RH5可以有效利用L-色氨酸并将其转化为IAA。加入Salkowski's试剂反应液变成粉红色。分光光度计比色法定量检测了牛大力内生菌RH5的IAA产生情况，结果表明其发酵液中RH5浓度为14.57mg·L^-1。

(2)牛大力内生菌RH5固氮能力测定

将菌株接种于LB液体培养基中，在培养条件为180rpm、30℃下培养过夜，接种1％(v/v)的菌液到Ashby液体培养基中，以接种等量无菌LB培养基为空白对照，置于恒温 振荡箱中，以180rpm、30℃条件培养7d，观察培养液的浑浊度。培养液出现明显浑浊， 记为菌株有固氮活性。菌株接种于LB固体培养基培养2d，接种环用酒精灯烧红，稍稍 冷却过后，用接种环挑取经纯化的细菌单菌落划线到Ashby固体培养基上，观察菌株的生 长情况。若菌株能正常生长，则连续继代培养三次以检测菌株的固氮能力，若菌株仍能正 常生长，则判定该菌具有固氮能力。

检测结果如表1所示，牛大力内生菌RH5经过Ashby液体培养基的初步培养和固体培养基连续3代继代培养后仍能正常生长，说明RH5具有固定大气中氮的能力。

(3)牛大力内生菌RH5产铁载体能力测定

改良络天青(CAS)蓝色检测平板配制：

A、称取60.5mg CAS用50mL双蒸水溶解，加入10mL 1mM FeCl₃溶液搅拌均匀， 得溶液a；(2)称取72.9mg HDTMA溶于40mL双蒸水，得溶液b；将a溶液缓慢加入 到b溶液中充分混匀，既得CAS染液，灭菌备用；B、将10％葡萄糖、2％蛋白陈、15.12 g哌嗪二乙醇磺酸、0.05％CaCI₂、0.05％MgS0₄·7H₂0、9g琼脂溶于450mL双蒸水，高压 灭菌后用单独灭菌的50％NaOH调pH至6.8；取上述CAS染液50mL与B所得溶液轻摇 混匀(勿产生气泡)既得CAS检测培养基。

将活化的菌株点接于CAS平板上，每平板接3个点，30℃培养48h，观察菌落周围 有无橙黄色晕圈，若出现晕圈表示该菌株有产生铁载体的能力。定量测定：阳性菌株经活 化后接种于MKB培养基中，180rpm，30℃条件下振荡培养48h。取5mL培养液8000 rmp/min离心10min，取2mL上清液与等量CAS检测液混合，充分反应1h，以双蒸水 调零，用分光光度计测定630nm处的OD₆₃₀值；将2mL空白MKB培养液与CAS检测 液等体积混匀，测得OD₆₃₀(Ar)为空白对照。

检测结果如表1所示，牛大力内生菌RH5能够在CAS检测平板正常生长，通过产生铁载体强力鳌合菌落附近铁元素而形成橙黄色晕圈。液体培养条件下，RH5发酵液中铁载体含量相对定量测定结果为75.35％。

(4)牛大力内生菌RH5溶磷能力测定

采用钼锑抗比色法检测菌株的溶磷能力。菌株活化后采用点接法接种于NBRIP培养 基平板上，每平板接种3个点，30℃恒温培养72h，观察菌落周围有无透明圈，若出现透明圈说明细菌能解磷。定量测定：将阳性菌株接种于LB培养基中培养过夜，按1％(v/v) 的接种量接种于50mL NBRIP液体培养基中，以接入等量无菌水作为对照，180rpm，30℃ 条件下振荡培养72h，每组处理设置3次重复。取5mL培养液8000rmp/min室温离心10 min，上清液适当稀释，用钼锑抗比色法测定有效磷，根据磷标准曲线计算培养液中有效 磷的含量。

检测结果如表1所示，牛大力内生菌RH5能够在添加难溶性磷酸盐(Ca₃(P0₄)₂) 的固体平板上正常生长，产生透明圈，表明RH5能溶解难溶性无机磷酸盐。液体培养条 件下，通过钼锑抗显色法定量检测，RH5发酵液中可溶性磷定量测定结果为3.92mg·L^-1。

(5)牛大力内生菌RH5产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACCD)能力测定

将菌株接种于LB培养基中培养18-24h，培养后的菌株在4℃、8000rmp/min条件下离心10min收集菌体，用经高压灭菌的无氮源DF培养基冲洗2次菌体沉淀，将菌体重悬 于装有7.5mL无氮源DF培养基的锥形瓶中，加入45μL经0.22μm细菌滤器过滤除菌的 0.5M ACC溶液，配制成终浓度为3.0mM ACC的DF培养基。将锥形瓶置于恒温振荡培 养箱中180rpm、30℃培养24h。以同样的方法离心获得菌体，用0.1M Tris-HCl(pH为 7.6)冲洗3次以洗去DF培养基，然后在4℃、8000rmp/min条件下离心10min，再次收 集菌体沉淀。用1mL 0.1M Tris-HC1(pH为7.6)重新悬浮上述菌体沉淀并用移液枪将菌 悬液转移至1.5mL离心管中，然后4℃、16000rmp/min离心5min获得菌体。将菌体沉 淀重新悬浮于600μL 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH为8.5)中，加入30μL甲苯溶液，用漩 涡振荡器振荡30s以破碎菌体。用移液枪吸取200μL破碎细胞菌悬液，与20μL 0.5mol/L ACC溶液吹打混匀，在温度为30℃下水浴15min。向混合液中加入300μL 2，4一二硝 基苯肼，在温度为30℃下水浴水浴30min，最后加入2mL 2MNaOH显色，稳定后用紫 见分光光度计测定其在540nm处的OD₅₄₀值，以Tris-HCl(pH为8.5)代替菌悬液的处理 作为空白对照，按照a-丁酮酸标准曲线计算a-丁酮酸含量。

检测结果如表1所示，1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)是乙烯的前体，ACC脱氨酶能 将ACC分解成a-丁酮酸和氨，减少乙烯的合成，促进宿主植物的生长发育。能利用ACC 为唯一氮源进行生长的具有ACC脱氨酶活性的微生物能提高植物对重金属胁迫的耐受性。 牛大力内生菌RH5能够在以ACC为唯一氮源的ADF培养基上正常生长，表明其具有ACC 脱氨酶编码基因。通过用2，4一二硝基苯肼比色法定量ACC脱氨产物a-酮丁酸检测到牛 大力内生菌RH5有ACC脱氨酶活性(见表1)。酶活性测定结果表明，牛大力内生菌RH5 脱氨酶活性为0.715mMmg^-1·L^-1。

表1牛大力内生菌RH5的促生特性

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用， 它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现 另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特 定的细节和这里示出与描述的图例。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西中医药大学

<120> 牛大力内生菌RH5在促进牛大力生长中的应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1396

<212> DNA

<213> Burkhoideria sp.RH5

<400> 1

gtcctccttg cggttagact agccacttct ggtaaaaccc actcccatgg tgtgacgggc 60

ggtgtgtaca agacccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga 120

ttccagcttc atgcactcga gttgcagagt gcaatccgga ctacgatcgg ttttctggga 180

ttagctcccc ctcgcgggtt ggcaaccctc tgttccgacc attgtatgac gtgtgaagcc 240

ctacccataa gggccatgag gacttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg 300

cagtctcctt agagtgctct tgcgtagcaa ctaaggacaa gggttgcgct cgttgcggga 360

cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccat gcagcacctg tgcgccggtt 420

ctctttcgag cactcccacc tctcagcagg attccgacca tgtcaagggt aggtaaggtt 480

tttcgcgttg catcgaatta atccacatca tccaccgctt gtgcgggtcc ccgtcaattc 540

ctttgagttt taatcttgcg accgtactcc ccaggcggtc aacttcacgc gttagctacg 600

ttactaagga aatgaatccc caacaactag ttgacatcgt ttagggcgtg gactaccagg 660

gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt cgtgcatgag cgtcagtatt ggcccagggg 720

gctgccttcg ccatcggtat tcctccacat ctctacgcat ttcactgcta cacgtggaat 780

tctacccccc tctgccatac tctagcctgc cagtcaccaa tgcagttccc aggttgagcc 840

cggggatttc acatcggtct tagcaaaccg cctgcgcacg ctttacgccc agtaattccg 900

attaacgctc gcaccctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cggtgcttat 960

tcttccggta ccgtcatccc ccgatcgtat taggaccaag gatttctttc cggacaaaag 1020

tgctttacaa cccgaaggcc ttcttcacac acgcggcatt gctggatcag gctttcgccc 1080

attgtccaaa attccccact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag 1140

tgtggctggt cgtcctctca gaccagctac tgatcgtcgc cttggtaggc ctttacccca 1200

ccaactagct aatcagccat cggccaaccc tatagcgcga ggcccgaagg tcccccgctt 1260

tcatccgtag atcgtatgcg gtattaatcc ggctttcgcc gggctatccc ccactacagg 1320

acatgttccg atgtattact cacccgttcg ccactcgcca ccaggtgcaa gcacccgtgc 1380

tgccgttcga cttgca 1396

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Primer-F

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Primer-R

<400> 3

ggttaccttg ttacgact 18

Claims (8)

1.牛大力内生菌RH5在促进牛大力生长中的应用，其特征在于，牛大力内生菌RH5分类命名为伯克霍尔德菌属(Burkhoideria sp.)RH5，保藏号：GDMCC NO：61030，所述牛大力内生菌RH5用于促进牛大力生长。

2.如权利要求1所述牛大力内生菌RH5在促进牛大力生长中的应用，其特征在于，所述牛大力内生菌RH5的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述牛大力内生菌RH5在促进牛大力生长中的应用，其特征在于，所述牛大力内生菌RH5保存在甘油中。

4.如权利要求3所述牛大力内生菌RH5在促进牛大力生长中的应用，其特征在于，甘油浓度为20％。

5.如权利要求1所述牛大力内生菌RH5在促进牛大力生长中的应用，其特征在于，具体步骤为：先将牛大力内生菌RH5与液体LB培养基混匀，即得菌悬液，然后将菌悬液浇灌至牛大力植物的根部。

6.如权利要求5所述牛大力内生菌RH5在促进牛大力生长中的应用，其特征在于，牛大力内生菌RH5与液体LB培养基的体积比为：1:500。

7.如权利要求5所述牛大力内生菌RH5在促进牛大力生长中的应用，其特征在于，液体LB培养基包括：胰蛋白胨，酵母提取物，NaCl。

8.如权利要求7所述牛大力内生菌RH5在促进牛大力生长中的应用，其特征在于，每升液体LB培养基具体包括：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5gNaCl，且其pH为7.4。

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