CN116751701B - 一株解磷菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株解磷菌及其应用，涉及生物技术领域。该解磷菌为假单胞菌(Pseudomonassilesiensis)C21，于2023年3月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.26784。本发明从辽宁省朝阳县清风岭所采植物蓝萼毛叶香茶菜根系土壤中分离得到了一株解磷菌，经鉴定该解磷菌为Pseudomonassilesiensis，其的解磷量达到了171.6mg/L。促生作用试验表明，C21促进番茄生长的作用强，干重比对照提升8.69％。定殖率测试结果表明，C21定殖能力很强，菌数降低较慢，土壤亲和力好。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一株解磷菌及其应用。
背景技术
人们在20世纪初开始注意到微生物与土壤磷之间的关系。1908年，Sackett等发现一些难溶性的复合物施入土壤中，可以被作为磷源而应用。1948年Gerresin发现植物施入不溶性的磷肥，经接种土壤微生物后，促进了植株的生长,增加磷的吸收。全世界13.19亿hm2耕地中多数地缺磷，约占耕地总面积的43％。据报道，至有70％的磷肥进入土壤后被土壤固定，成为难以被作物吸收利用的固定形态。土壤中的大多数磷素被钙、铁、铝等离子及土壤黏粒固定，形成无效态磷，无法被槙物直接吸收利用。
土壤中存在大量的微生物，通过释放有机酸、碳酸、硝酸和硫酸，可以提高难溶性磷酸盐的溶解，从而改善作物的磷素营养，这些微生物统称为解磷菌。解磷菌的应用，能有效的提高土壤磷元素的利用率，降低磷肥施用量，减少土壤污染，为农业的可持续发展提供有力的协助。因此高效解磷菌的筛选成为农业科技工作者的研究热点。
发明内容
本发明的目的是提供一株解磷菌及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该解磷菌在土壤中的定植率高，解磷能力强，能够有效促进农作物植株生长。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一株解磷菌，所述解磷菌为假单胞菌(Pseudomonas silesiensis)C21，于2023年3月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.26784。
本发明还提供上述的解磷菌在制备具有解磷作用的微生物制剂中的应用。
本发明还提供一种具有解磷作用的微生物制剂，包括上述的解磷菌。
本发明还提供一种上述的微生物制剂的制备方法，包括将上述的解磷菌接种于发酵培养基中，之后发酵培养得到所述微生物制剂的步骤。
进一步地，所述发酵培养基为LB培养基。
进一步地，所述发酵培养的温度为28℃。
进一步地，所述发酵培养的时间为3d。
本发明还提供上述的解磷菌或微生物制剂在制备生物肥料中的应用。
本发明还提供一种生物肥料，包括上述的解磷菌或微生物制剂。
本发明还提供上述的解磷菌、微生物制剂或生物肥料在促进植物生长中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明从辽宁省朝阳县清风岭所采植物蓝萼毛叶香茶菜根系土壤中分离得到了一株解磷菌，命名为C21，经鉴定该解磷菌为Pseudomonas silesiensis。钼锑抗比色法测定C21的解磷量达到了171.6mg/L。促生作用试验表明，C21促进番茄生长的作用强，干重比对照提升8.69％。定殖率测试结果表明，C21定殖能力很强，菌数降低较慢，土壤亲和力好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为C21溶磷圈；
图2为实施例1建立的系统进化树；其中的2021-26-1即为C21。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1.菌株分离
从辽宁省朝阳县清风岭所采植物蓝萼毛叶香茶菜根系土壤中分离菌株，分离方法如下：
取1g土壤样品加入到含19mL无菌水的三角瓶中，150r/min室温条件下振荡培养30min。梯度稀释，每个梯度取100μL放入培养皿中，采用混菌法，加入15mL固体PVK培养基，每个稀释度做三个重复，置于28℃培养箱培养3d，观察平板中菌落生长情况及溶磷圈的产生。挑取溶磷圈大的菌落转入试管，并进行纯化和进一步的解磷能力测试。
各菌株的溶磷圈的统计结果见表1，其中C21的溶磷圈如图1所示。
表1各菌株的溶磷圈的统计结果
注：d表示菌落直径，D表示溶菌圈直径包括菌落在内的。
2.解磷能力测试(钼锑抗比色法)
2.1磷标准曲线制作：
分别取0、2、3、4、5和6mL的5mg/L磷标准溶液于50mL容量瓶中，加水稀释至20mL，分别加入5mL钼锑抗显色剂，摇匀，定容至50mL，得0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6mg/L的磷标准系列溶液。分光光度计上用波长700nm比色。在excel软件上，以实测值为纵坐标，磷mg/L数为横坐标，绘制工作曲线。
2.2溶磷量的测定
分别挑取单菌落于PVK液体培养基中30℃、160r/min振荡培养5d，将发酵液加入适量活性炭脱色，离心，吸取上清液2mL(含5-25μg磷)于50mL容量瓶中，用水稀释至20mL，加2,6一二硝基酚指示剂2滴，用氢氧化钠或稀硫酸溶液调节pH至溶液刚呈微黄色(小心缓加，边加边摇，防止产生的二氧化碳把溶液喷出瓶口)，然后加入钼锑抗显色剂5mL，摇匀，定容至50mL。在室温20℃下放置30min，在波长700nm处比色，以空白发酵液为参比液调零点。读取数值，结果见表2。
表2各菌株解磷能力测试结果
3.鉴定
3.1形态学鉴定
C21划线培养2d，观察单菌落形态，所见菌落小、1mm、乳黄、色浅、圆形，凸起、有光泽、边缘整齐。
3.2生理生化鉴定
对C21进行革兰氏染色、葡萄糖发酵、淀粉水解等生化测试，结果见表3。
表3生理生化鉴定结果
| 检测项目 | 检测结果 |
| 革兰氏染色 | - |
| 淀粉水解 | + |
| 甲基红试验 | + |
| 吲哚试验 | - |
| 葡萄糖发酵试验 | + |
| 过氧化氢酶活性 | + |
| 明胶化试验 | + |
| 酸性磷酸酶 | + |
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
3.3分子生物学鉴定
将C21送美吉生物公司进行测序，结果提交NCBI进行BLAST，用clustalx和MEGA软件建立系统进化树，确定亲缘关系远近，进行初步鉴定。进化树如图2所示，结果显示C21为假单胞菌(Pseudomonas silesiensis)。
菌种鉴定原始序列(SEQ ID NO.1)如下：
GTGGTACCGTCCTCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTATGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATTACGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAATGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCATTGGATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAGAGCTCAAGGCTCCCAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCATACTCTAGCTCGTCAGTTTTGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCAACTTAACGAACCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAACAGATACGTATTAGGTAACTGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTCCGTTTCCGAGCGTTATCCCCCACTACCAGGCAGATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGCCACCAGGTACAAGTACCCGTGCTGCCGCTCGACTGCATGTGTA。
4.菌株保藏
假单胞菌(Pseudomonas silesiensis)C21于2023年3月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.26784。
实施例2
将菌株A12、A3、C21和C11分别接种于LB培养基，28℃培养3d后，发酵液离心处理后，取沉淀重悬至菌浓为106cfu/mL，分别制备得到A12、A3、C21和C11的菌悬液，备用。
1.促生长效果测试
盆栽番茄，待番茄幼苗长至7天后，分别在幼苗根部浇灌A12、A3、C21和C11的菌悬液，每株10mL，对照组用10mL清水代替，每个处理10株。番茄苗生长50d后，贴近土壤表面剪下，105℃干燥2h，测试不同处理干重，结果见表4。
表4解磷菌促番茄生长干重比较(g)
结果显示，各实验菌株都有一定的促进番茄生长作用，其中C21促进番茄生长作用最明显，干重比对照提升8.69％。
2.定殖率测试
取土壤样品，阴干后，过筛，去除其中的石块，加入2wt％腐熟过筛后的羊粪，充分混匀，得到混合土壤。在￠6cm的培养皿中加入混合土壤10g，分别加入A12、A3、C21和C11的菌悬液1mL，再加入3mL无菌水，以保证土壤含水量，测试菌悬液活菌数，以不加菌悬液的土壤样品为对照，30℃培养，每隔10d测试解磷菌的数量，以培养皿中有溶磷圈的减去对照培养皿中有溶磷圈的为存活数，计算定殖率，每个处理三次重复，结果见表5。
表5土壤中解磷菌定殖数量(107cfu/g)
结果表明，在没有栽培作物的情况下，50d时定殖率还能达到0.1％以上，说明这些菌种的定殖能力很强。其中C21在四个时间点定殖率都比较理想，菌数降低较慢，土壤亲和力好。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一株解磷菌，其特征在于，所述解磷菌为假单胞菌(Pseudomonassilesiensis)C21，于2023年3月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.26784。
2.一株如权利要求1所述的解磷菌在制备具有解磷作用的微生物制剂中的应用。
3.一种具有解磷作用的微生物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的解磷菌。
4.一种如权利要求3所述的微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括将如权利要求1所述的解磷菌接种于发酵培养基中，之后发酵培养得到所述微生物制剂的步骤。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为LB培养基。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为28℃。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的时间为3d。
8.一种如权利要求1所述的解磷菌或权利要求3所述的微生物制剂在制备生物肥料中的应用。
9.一种生物肥料，其特征在于，包括权利要求1所述的解磷菌或权利要求3所述的微生物制剂。
10.一种如权利要求1所述的解磷菌、权利要求3所述的微生物制剂或权利要求9所述的生物肥料在促进植物生长中的应用。
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