CN111349583B - 一种高地芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高地芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明的高地芽孢杆菌是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为：CGMCC No.18083的高地芽孢杆菌FK003。本发明提供的高地芽孢杆菌具有较好的溶磷效果，可应用于抗菌肥料、生物防治、污水处理等方面，具有商业应用价值。

Description

一种高地芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高地芽孢杆菌及其应用。
背景技术
高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)是芽孢杆菌属的一种革兰氏阳性菌。具有液化明胶，还原硝酸盐，吲哚阴性等特点。
高地芽孢杆菌目前主要应用在防治病虫害。发明专利CN110066754A中公开了一种高地芽孢杆菌菌株及其应用，筛选出了一种高地芽孢杆菌以防治星油藤根茎腐病。发明专利CN108865946A中公开了一种高地芽孢杆菌及其在防治西红柿根结线虫中的应用，表明了高地芽孢杆菌菌株YT2002生物制剂对西红柿根结线虫具有较好的防治效果，并且可以促进西红柿植株的生长。发明专利CN105820981B公开了一株高地芽孢杆菌菌剂的制备及应用，该菌剂能有效的防治桃褐腐病、灰霉病、软腐病及青霉病等多种真菌病害。还有研究发现高地芽孢杆菌也可对桃果实褐腐病的防治有一定效果。
高地芽孢杆菌的脱氮去磷性能让其在废水污泥的处理中也有一定的作用。发明专利CN108046555A中公开了一种用于修复底泥污染的高地芽孢杆菌的制备方法及应用，该菌株对底泥中总磷的修复具有良好的性能。发明专利CN102703350B中公开了一株耐盐脱氮除磷高地芽孢杆菌其在废水处理中的应用，该菌株其具有耐高盐兼具异养硝化-好氧反硝化的能力，在单一好氧条件下兼有同步除磷的能力，将该菌株应用于高盐废水的处理，可实现单一好氧条件下氮磷的同步去除。
目前已公开的获得纯培养保藏的具备实际应用价值的高地芽孢杆菌种类并不多，对于本领域而言，充足的微生物资源储备毫无疑问对其产业化应用有重要的实际意义。
发明内容
本发明提供了一种高地芽孢杆菌，以及其发酵培养方法、其作为饲料添加剂的用途、其作为肥料添加剂的用途、其作为生物防治病虫害菌剂的用途、其作为污水处理剂的用途。
一方面，本发明提供的一种高地芽孢杆菌，它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为：CGMCC No.18083的高地芽孢杆菌FK003(Bacillusaltitudinis FK003)。
本发明的高地芽孢杆菌FK003(Bacillus altitudinis FK003)于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.18083。
另一方面，本发明提供的一种高地芽孢杆菌的发酵工艺。
具体地，所述的发酵培养基的碳源包括但不限于：蔗糖、葡萄糖、玉米淀粉、麦芽糊精、玉米粉。
在一些具体的实施方案中，所述的发酵工艺包括以下步骤：
(1)菌种活化；
(2)一级种子液制备；
(3)发酵液制备。
具体地，所述的菌种活化使用的培养基包括氯化钠、蛋白胨、酵母粉中的一种或多种。
具体地，所述的一级种子液制备使用的培养基包括：糖蜜、酵母粉、豆饼粉、蛋白胨、硫酸锰、硫酸铵、硫酸镁、氯化钠中的一种或多种。
具体地，所述的发酵液制备使用的培养基包括：糖蜜、酵母粉、豆饼粉、蛋白胨、硫酸锰、硫酸铵、硫酸镁、氯化钠中的一种或多种。
本发明提供的高地芽孢杆菌在发酵过程中可利用碳氮源种类广，发酵工艺简单，能够实现工业化生产。
再一方面，本发明提供了高地芽孢杆菌FK003在生物防治中的应用。
具体地，所述的应用包括但不限于将高地芽孢杆菌FK003的发酵液用于必要的生物防治病虫害菌剂添加剂。
更具体的，所述的应用包括但不限于将高地芽孢杆菌FK003的发酵液制备成高地芽孢杆菌FK003菌粉，用于必要的生物防治病虫害菌剂添加剂。
更具体地，所述的应用包括但不限于防治桃褐腐病、灰霉病、软腐病及青霉病等病害。
又一方面，本发明提供了高地芽孢杆菌FK003在污水处理中的应用。
具体地，所述的应用包括但不限于将高地芽孢杆菌FK003的发酵液作为必要原料制备污水处理剂添加剂。
更具体地，所述的应用包括但不限于将高地芽孢杆菌FK003的发酵液制备成的菌粉作为必要原料制备污水处理剂添加剂。
更具体地，所述的应用包括但不限于处理修复底泥污染、修复水体氮磷污染。
又一方面，本发明提供了高地芽孢杆菌FK003在制备饲料或其添加剂、肥料或其添加剂、生物防治病虫害菌剂或其添加剂、污水处理剂或其添加剂中的应用。
具体地，所述的应用包括但不限于将高地芽孢杆菌FK003的发酵液作为必要原料制备饲料或其添加剂、肥料或其添加剂、生物防治病虫害菌剂或其添加剂、污水处理剂或其添加剂。
更具体地，所述的应用包括但不限于将高地芽孢杆菌FK003的发酵液制备成菌粉，作为必要原料制备饲料或其添加剂、肥料或其添加剂、生物防治病虫害菌剂或其添加剂、污水处理剂或其添加剂。
更具体地，所述的饲料或其添加剂应用于养殖业。
更具体地，所述的肥料或其添加剂应用于种植业，包括但不限于西红柿肥料添加剂，桃肥料添加剂。
更具体地，所述的生物防治病虫害菌剂应用于包括但不限于防治桃褐腐病、灰霉病、软腐病及青霉病等病害。
更具体地，所述的污水处理剂或其添加剂应用于包括但不限于处理修复底泥污染、修复水体氮磷污染。
保藏说明
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所
保藏日期：2019年07月08日
菌种名称：高地芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus altitudinis
菌株编号：FK003
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18083
附图说明
图1为高地芽孢杆菌FK003在无机磷培养基上的透明环。
图2为高地芽孢杆菌FK003摇瓶溶磷效果试验结果图，其中左侧瓶为对照组，右侧瓶为实验组。
具体实施例
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1高地芽孢杆菌FK003的筛选、鉴定和保藏
1、高地芽孢杆菌FK003的筛选
本发明所述的高地芽孢杆菌筛选自云南省山地土壤。
采用稀释平板法分离土壤中细菌：称取样品10g，加入带玻璃珠的100mL无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上200rpm充分振荡30min，即得基础菌悬液。用无菌移液管分别吸取5.0mL基础液，加入45mL无菌水中，得到10-2浓度的土壤菌悬液，然后按照梯度稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8浓度的菌悬液，然后吸取100μL，分别置于无机磷细菌筛选培养基，选取透明环明显的菌株作进一步优化。
无机磷细菌培养基组成如下：葡萄糖10.0g/L、硫酸铵0.5g/L、酵母浸粉0.5g/L、氯化钠0.3g/L、氯化钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L、硫酸亚铁0.03g/L、硫酸锰0.03g/L、磷酸三钙5.0g/L、琼脂15.0g/L。培养基pH值7.0-7.5。培养条件为37℃培养72小时，至可见明显透明环和菌落形态。
2、高地芽孢杆菌FK003的保藏信息为：
高地芽孢杆菌FK003(Bacillus altitudinis FK003)于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.18083。
实施例2高地芽孢杆菌FK003的发酵培养
斜面或冻干管或甘油管高地芽孢杆菌FK003的发酵培养步骤如下：
(1)菌种活化
把斜面或冻干管高地芽孢杆菌FK003接种到配制好的LB平板培养基，于32℃-40℃恒温培养箱，培养12-18小时。
LB平板培养基成分为：氯化钠10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、琼脂15g、蒸馏水补足至1000mL。
(2)摇瓶菌种制备
挑取1-2环活化后的菌种接种于配制好的液体摇瓶培养基，于32℃-40℃恒温震荡摇床，培养12-18小时，即得摇瓶种子液。
液体摇瓶培养基成分为：氯化钠10-30g/L、蛋白胨10-30g/L、酵母粉5-15g/L蒸馏水补足至1000mL。
(3)一级种子制备
以接种量1％-5％将摇瓶种子液接种到一级种子培养基，温度32℃-40℃，转速80-200rpm，培养6-12小时，即得一级种子液。
一级种子培养基成分为：糖蜜20-40g/L、酵母粉1-4g/L、豆饼粉20-40g/L、蛋白胨5-10g/L、硫酸锰0.5-1g/L、硫酸铵0.5-5g/L、硫酸镁0.5-2g/L、氯化钠0.2-3g/L。培养基pH为6.5。
(4)发酵液制备
以接种量15％-20％将一级种子液接种到发酵培养基，温度35℃-40℃，转速150-250rpm，风量0.5-2vvm/min,培养35-45小时；整个发酵过程溶氧值控制在50％以上，即得高地芽孢杆菌FK003发酵液。
发酵培养基组成：糖蜜50-10g/L、豆饼粉10-50g/L、硫酸锰1-3g/L、硫酸铵40-100g/L、硫酸镁0.5-2g/L、氯化钠0.5-4g/L、pH6.5；
采用国标有效活菌数的测定方法测得，高地芽孢杆菌FK003发酵液中有效活菌数在200-300×108/mL。
(5)高地芽孢杆菌菌粉制备
将高地芽孢杆菌新鲜发酵液打入到搅拌罐，加入3-10％麦芽糊精或0.5-1％二氧化硅或2-5％的大米蛋白，并搅拌均匀。然后采用高压喷雾干燥塔进行喷干，控制进风温度180-200℃，出风温度60-90℃，菌粉含水量3-5％，并用铝箔纸袋包装放置于阴凉干燥处，得到高地芽孢杆菌粉剂，储存于阴凉通风干燥处。
实施例3高地芽孢杆菌FK003溶磷效果测试
取实施例1中高地芽孢杆菌发酵液1mL转接到灭菌后的测定用培养基中，然后置于振荡培养箱，培养24-96h观察并测定溶磷效果。
测定用培养基的组成为葡萄糖10.0g/L、硫酸铵0.5g/L、酵母浸粉0.5g/L、氯化钠0.3g/L、氯化钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L、硫酸亚铁0.03g/L、硫酸锰0.03g/L、磷酸三钙5.0g/L，pH值7.0-7.5。
具体步骤为：
1、取实施例1中高地芽孢杆菌FK003发酵液1mL加至装有200mL测定用培养基的500mL三角瓶中，于28-30℃及转速200rpm的条件下，振荡培养1-4天。设置对照组：高压灭菌处理的发酵液样品1mL相同处理方法下培养。
2、将步骤1得到的高地芽孢杆菌FK003培养液和对照组培养液以滤纸过滤，或用高速离心机离心20分钟，然后取澄清液，并以0.45μm滤膜过滤后测定总磷含量，总磷含量采用磷钼酸喹啉重量法测定，具体步骤如下：
称取测量样品(高地芽孢杆菌FK003培养液或对照组培养液)1-4g于250mL容量瓶中，加入50mL硝酸溶液充分溶解，用水定容，混匀后干过滤；吸取10mL过滤试样，于500mL烧杯中，加入10mL硝酸溶液，用水稀释至100mL，盖上表面皿在电炉上加热煮沸，加入35mL磷钼酸喹啉试剂，继续煮沸1min后取下烧杯冷却。然后使用在180℃干燥箱内干燥至恒重的玻璃坩埚滤器过滤，把沉淀和滤器一并放入180℃干燥箱干燥至恒重后，称量计算，计算公式为：
Figure BDA0002408672540000061
其中，m1表示磷钼酸喹啉沉淀的质量，单位为克(g)；m2表示空白试验磷钼酸喹啉沉淀的质量，单位为克(g)；m表示试样的质量，单位为克(g)；250为试验溶液的固定体积，单位为毫升(mL)；100为分取的试样溶液的体积，单位为毫升(mL)；0.03207为磷钼酸喹啉质量换算为五氧化二磷质量的系数。
(3)活性计算：指单位体积(重量)肥料被高地芽孢杆菌在单位时间内将难溶磷分解为水溶性磷之量，计算公式为：
Figure BDA0002408672540000071
其中X表示高地芽孢杆菌FK003培养液所含水溶性磷量，单位为μg/瓶；Y表示对照组培养液(灭菌发酵液样品的培养液)所含水溶性磷量，单位为μg/瓶；Z表示使用培养液样品量，单位为mL/瓶或g/瓶；W表示培养时间单位为小时或天。
高地芽孢杆菌FK003溶磷效果测试结果如下：
(1)对照组摇瓶仍呈白色，接种高地芽孢杆菌的摇瓶在培养2天后，颜色逐渐由白转黄，说明部分难溶性磷酸盐被转化成可溶性(图2)。
(2)高地芽孢杆菌FK003溶磷效果见表1。
表1高地芽孢杆菌溶磷数据
培养时间(小时) 24 48 72
对照组磷含量(％) 0.02 0.02 0.04
实验组磷含量(％) 0.05 0.15 0.2
注：实验组指高地芽孢杆菌FK003组。
实施例4一种肥料或肥料添加剂
取有机或无机或有机无机颗粒肥料，倒入生产用搅拌器，以糖蜜或黏土作为粘合剂，充分搅拌均匀，然后加入2-10％的实施例2得到的高地芽孢杆菌菌粉，搅拌1-3小时，当肥料颗粒表面光滑，无明显潮湿时加入1-5％的裂壶藻粉，1-5％的小球藻粉。本颗粒肥料同时含有脂肪酸、蛋白质、活性肽、细胞分裂素、氮磷钾等有效成分，并可防止颗粒结块。

Claims (8)

1.一种高地芽孢杆菌，其特征在于，所述高地芽孢杆菌为高地芽孢杆菌FK003（Bacillus altitudinis FK003），保藏编号为：CGMCC No .18083。
2.一种高地芽孢杆菌发酵液，其特征在于，所述高地芽孢杆菌发酵液由权利要求1所述的高地芽孢杆菌FK003接种于培养基中培养得到。
3.根据权利要求2所述的高地芽孢杆菌发酵液，其特征在于，所述的培养基为高地芽孢杆菌发酵培养基，所述的高地芽孢杆菌发酵培养基包括糖蜜、豆饼粉、硫酸锰、硫酸铵、硫酸镁、维生素和磷酸二氢钾。
4.权利要求1所述的高地芽孢杆菌或权利要求2所述的高地芽孢杆菌发酵液在制备肥料或其添加剂、生物防治病虫害菌剂或其添加剂中的应用。
5.权利要求1所述的高地芽孢杆菌或权利要求2所述的高地芽孢杆菌发酵液在生物防治中的应用。
6.一种肥料或其添加剂，其特征在于，所述的肥料或其添加剂包括权利要求1所述的高地芽孢杆菌。
7.一种生物防治病虫害菌剂或其添加剂，其特征在于，所述的生物防治病虫害菌剂或其添加剂包括权利要求1所述的高地芽孢杆菌。
8.权利要求6所述的肥料或其添加剂、权利要求7所述的生物防治病虫害菌剂或其添加剂在种植业和生物防治中的应用。
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