CN117004540B - 变栖克雷伯氏固氮菌的筛选及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola）及其应用。所述变栖克雷伯氏菌筛选自吉林公主岭的农田中，其保藏编号为CGMCC No.28351。该菌株具有固氮能力且能与玉米形成高效互作，在玉米根部能稳定定殖超过2个月，可有效促进玉米根的生长。利用该变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola）制备高效微生物菌剂，具有生产成本低、操作简单、对土壤无二次污染等优点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体的涉及一株变栖克雷伯氏菌Klebsiella variicola的筛选及其应用。
背景技术
土壤微生物包括：细菌、真菌、放线菌等，数量庞大，种类繁多，在土壤中发挥各自不同的功能。其中一部分微生物可引起植物疾病，即植物病害微生物；另外还有一部分微生物可以促进植物生长，即植物促生微生物。近年来，随着地球环境与世界气候面临的问题越来越严峻，各国对绿色环保低碳产业的关注和需求与日俱增，这类促进植物生长的微生物正在逐渐受到现代农业的重视和青睐，作为提高作物生长的新型肥料，其可持续性和对土地友好的特性，是传统化肥无法比拟的。另外，微生物肥料还具有生产过程温和，能耗低、污染小等明显优点，在肥料领域具有巨大的优势和潜能。植物促生菌对农作物的促生长作用机理各不相同，有的具有固氮、解磷等作用，能够给植物提供氮、磷等元素；有的能够抑制植物致病微生物生长，保护农作物免受土传疾病侵害......无论哪种促生机理，植物促生菌在植物中的定殖能力都直接影响促生效果。定殖能力强、定殖时间长的促生菌通常具有更好的促生效果。
氮元素是构成生命的基础物质，是蛋白质和核酸的主要组成成分。地球上的氮元素资源并不稀少，大气组成中近80％是氮气（N2），然而大部分生物并不能直接利用大气中的氮气。植物的生长离不开氮元素，但土壤中可利用的氮远远不能满足需要，往往通过施用人工合成的化学氮肥来促进植物生长。过量的化学氮肥进入土壤后，会破坏土壤原有的结构和酸碱度，影响土壤的再生性和连续耕种能力。微生物的固氮作用可将氮气分子转变成氨（NH3），氨遇水成为易溶性的铵离子（NH4 +）。固氮微生物作为促进植物生长的微生物，广泛存在于农田土壤中，本身是农田生态系统的重要组成部分，在养分循环、氮的固定、土壤结构与肥力保持等方面都起着重要作用。因此，生物固氮技术以及应运而生的生物菌肥对环境友好，无需额外消耗能量和资源，克服了人工合成化学氮肥的上述弊端，是当前发展绿色农业、有机农业的新型肥料。
克雷伯菌属的细菌广泛分布在土壤中，其中不乏具有一定固氮能力的菌株。但考虑与植物宿主适应性问题，目前分离鉴定的固氮克雷伯菌，大部分在实际应用中不能与农作物形成良好的互利共生关系，定殖的稳定性较差、定殖时间较短。对比菌根真菌与植物的定殖多数可以超过3个月甚至1年，未见报道固氮克雷伯菌可与玉米稳定定殖超过6周。
发明内容
本发明提供一株具备固氮效果的变栖克雷伯氏菌LWNF004( Klebsiella variicola)及其相关应用。
本发明的另外一个目的在于提供一株可在玉米根部稳定定殖大于2个月的变栖克雷伯氏菌LWNF004 (Klebsiella variicola)。
本发明的另外一个目的在于提供一株可在促进玉米根生长的变栖克雷伯氏菌LWNF004( Klebsiella variicola)。
本发明的另外一个目的在于提供同时具有上述一种或多种能力的的变栖克雷伯氏菌LWNF004 ( Klebsiella variicola)及其相关应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一株变栖克雷伯氏菌LWNF004，已于2023年09月04日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为的变栖克雷伯氏菌 Klebsiella variicola ，保藏编号为CGMCC No.28351。
本发明所述的变栖克雷伯氏菌LWNF004从吉林公主岭玉米植株根周和根际土壤中经过多重筛选获得，其能够在无氮培养基中生长，乙炔还原实验结果表明该菌具备固氮能力。对所述菌株进行16S rDNA测序，其序列如SEQ ID NO .1所示。综合上述各项生理、生化试验结果，在分子水平上鉴定其为变栖克雷伯氏菌Klebsiella variicola。
通过玉米定殖实验证明，该变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola），可在玉米根部稳定定殖超过2个月，并具有促进玉米根生长的作用。
本发明提供一株变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola），所述变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola）的保藏编号为CGMCC No .28351。
本发明提供一株变栖克雷伯氏菌LWNF004作为固氮菌的应用，所述变栖克雷伯氏菌LWNF004的保藏编号为CGMCC No .28351。
本发明提供一株变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola）在促进植物生长中的应用，所述变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola）的保藏编号为CGMCCNo .28351。所述植物可以是农作物，优选玉米。所述变栖克雷伯氏菌在玉米根部稳定定殖大于2个月，为玉米提供氮源营养以及促进玉米根生长的簇生作用。
本发明进一步提供一种微生物固氮菌剂，所述微生物菌剂含有变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola），所述变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola）的保藏编号为CGMCC No .28351。所述微生物固氮菌剂可以作为肥料施用于植物，所述植物优选农作物，尤其是玉米。
本发明进一步提供一种植物促生微生物菌剂，所述微生物菌剂含有变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola），所述变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola）的保藏编号为CGMCC No .28351。所述微生物促生菌剂可以作为肥料施用于植物，所述植物优选农作物，尤其是玉米。
上述菌剂中，所述变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola）的有效活菌数优选为1010～1011 CFU/g。
上述微生物菌剂可采用本领域常规的菌剂制备方式制备而成，其可以是多种形式的菌剂，如液体菌剂或固体菌剂，优选固体菌剂。
所述固体菌剂，优选采用发酵冻干方式制备而成。
本发明提供一种微生物菌剂的制备方法，将所述的变栖克雷伯氏菌活化后制备成种子液，然后接种至发酵培养基扩大培养至稳定期，分离后获得所述微生物菌剂。
本发明提供一种微生物菌剂的制备方法，将变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola）发酵得到的发酵液离心分离得到菌体沉淀，再加入冻干保护剂，在无菌条件下进行冻干处理，制备成冻干粉。
所述冻干保护剂由脱脂奶粉、谷氨酸钠、甘油、蔗糖和水按质量比例75：15：70：10：330混合制成。
所述变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola）冻干粉的有效活菌数为1010～1011 CFU/g，且可以常温储存6个月，活力不降低。
本发明提供一种一种植物光合作用改善剂、植物氮营养改善剂和植物生长发育促进剂，包含所述的变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola），或其微生物菌剂。
附图说明
图1 为变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola）对玉米根鲜重的影响
图2 为变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola）在玉米根部的丰度检测实验中的玉米根部样品图。
图3为变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola）在玉米根部的丰度检测实验中的荧光显色平板图。
图4为菌剂制备过程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。
实施例1 固氮变栖克雷伯氏菌LWNF004的筛选
在吉林公主岭农田中采集土壤和玉米根样品，低温运输至实验室，在无氮培养基KPM（培养基配方参见表1）平板上涂板培养。挑取平板上的单克隆菌株，重新在无氮培养基KPM平板上划单克隆进行纯化。PCR扩增16s rRNA基因并测序，经序列比对，筛选出其中一株菌株LWNF004，鉴定为变栖克雷伯氏菌Klebsiella variicola ，该菌株的16s rRNA序列如SEQ ID NO .1所示。
表1：KPM无氮培养基配方
实施例2变栖克雷伯氏菌LWNF004 固氮能力的鉴定
采用本领域常用的乙炔还原法对变栖克雷伯氏菌LWNF004的固氮活性进行检测。
将处于对数生长期的菌株转接至LB液体培养基，30℃、220RPM摇床中震荡培养过夜。利用分光光度计测定菌株的OD600后，5500RPM、5mint离心收集菌体，利用无氮KPM液体培养基清洗3次后悬浮于无氮KPM培养基中，调节OD600=0.2。在每根厌氧管中加入2毫升菌液，同时采用添加2毫升无氮KPM的厌氧管作为对照（未加菌），加塞封盖使厌氧管成密封状态，在厌氧管中注入2毫升乙炔气体，摇晃均匀后置于30℃培养箱中静置培养16h。每个厌氧管中用微量进样器抽取1毫升气体，注入气相色谱仪中测定乙烯生成量。
表2. 固氮酶活测定实验中产物乙烯生成量
根据表2中的测定结果可以看出，当厌氧管中添加变栖克雷伯氏菌LWNF004时，其可催化乙炔向乙烯的转化，而未加菌的对照组则未检测到乙烯的生成，依据实际测量的乙炔标准气体浓度/面积比值，可计算出该变栖克雷伯氏菌LWNF004固氮酶活为8.8 nmolC2H4/h vial，上述结果充分说明该变栖克雷伯氏菌LWNF004（Klebsiella variicola ）具有较高的固氮活性。
实施例3变栖克雷伯氏菌LWNF004对玉米根的影响。
将该变栖克雷伯氏菌LWNF004接入LB培养基中，30℃、220RPM培养16h，在离心机中5500rpm离心5mint收集菌体，倒掉上清液，用无菌的PBS调整其浓度为109 CFU/ml。将玉米种子种于温室中，加入制备好的菌悬液1000微升，再加入10毫升无菌水。对照组（CK）中加入1000微升无菌PBS，10毫升无菌水。两个处理每个处理做4组重复。种植7周后，取根，去除覆土，测量根鲜重。
结果如图1所示，种植7周后，未采用变栖克雷伯氏菌LWNF004处理的对照组的玉米根鲜重为52 克，而采用变栖克雷伯氏菌LWNF004 处理的实验组的玉米根鲜重为111 克，相对于对照组提升了116 %。上述结果表明该菌株能显著促进玉米根的生长。
实施例4 变栖克雷伯氏菌LWNF004 定殖丰度测定。
使用基因编辑方法使该变栖克雷伯氏菌LWNF004携带红色荧光标记，再使用该标记菌株进行定殖实验。将携带荧光标记的变栖克雷伯氏菌LWNF004 接入LB培养基中，30℃、220RPM培养16h，在离心机中5500rpm离心5mint收集菌体，倒掉上清液，用无菌的PBS调整其OD值为109 CFU/ml。将玉米种子种于温室中，加入制备好的菌悬液1000微升，再加入10毫升无菌水，做4支重复。生长九周后，取根部样品（参见图2）。对每个根系样品的侧根、根尖、根中部混合取样0.25g。对所取样品加入一定比例的无菌水稀释，振荡器打碎，之后对原液进行梯度稀释，稀释至10-5之后涂布于LB固体培养基在30℃有氧条件下培养2天，之后置于4℃条件下一天等待红色荧光完全显色后计数（参见图3）。
根据荧光计数结果，九周后，该变栖克雷伯氏菌在玉米根部定殖丰度仍为：5×104 CFU/克鲜根。同时分离的其他克雷伯氏固氮菌，该丰度仅能维持3周时间。
实施例5微生物菌剂制备
为了方便储存及运输，将筛选到的变栖克雷伯氏菌LWNF004制备成冻干粉菌剂。具体为（制备流程参见图4 ）：
（1）将变栖克雷伯氏菌LWNF004 发酵液通过离心分离得到菌体沉淀。
（2）将脱脂奶粉、谷氨酸钠、甘油、蔗糖和水按质量比例75：15：70：10：330混合制成冻干保护剂。
（3）将冻干保护剂按质量比1：1加入到上述步骤（1）得到的菌体沉淀中，使菌体与保护剂充分混合平衡60min，在-20℃下冷冻过夜。
（4）在无菌条件下进行冻干处理，制备成冻干粉备用。
该变栖克雷伯氏菌LWNF004 冻干粉的有效活菌数为1010～1011 CFU/g，且可以常温储存6个月，活力不降低。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一株变栖克雷伯氏菌LWNF004，其特征在于，其分类命名为变栖克雷伯氏菌Klebsiella variicola，保藏编号为CGMCC No.28351。
2.一种如权利要求1所述的变栖克雷伯氏菌LWNF004在促进玉米生长中的用途。
3.一种如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述变栖克雷伯氏菌LWNF004具有在玉米根部稳定定殖大于2个月、为玉米提供氮源营养以及促进玉米根生长的促生作用。
4.一种微生物菌剂，其特征在于，包含如权利要求1所述的变栖克雷伯氏菌LWNF004。
5.一种如权利要求4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的变栖克雷伯氏菌LWNF004活化后制备成种子液，然后接种至发酵培养基扩大培养至稳定期，分离后获得所述微生物菌剂。
6.一种如权利要求4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于制备成冻干粉菌肥，具体为：将权利要求1所述变栖克雷伯氏菌LWNF004发酵得到的发酵液离心分离得到菌体沉淀，再加入冻干保护剂，在无菌条件下进行冻干处理，制备成冻干粉。
7.一种植物氮营养改善剂，其特征在于，包含如权利要求1所述的变栖克雷伯氏菌LWNF004，或权利要求4所述的微生物菌剂，或权利要求5-6任一方法制备的微生物菌剂。
8.一种植物生长发育促进剂，其特征在于，包含如权利要求1所述的变栖克雷伯氏菌LWNF004，或权利要求4所述的微生物菌剂，或权利要求5-6任一方法制备的微生物菌剂。
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