CN103031260A

CN103031260A - 一种具有解钾作用的变栖克雷伯氏菌及其培养方法和应用

Info

Publication number: CN103031260A
Application number: CN201210430677XA
Authority: CN
Inventors: 张忠锋; 申国明; 祖秉桥; 李青诚; 高林; 张玉芹; 高加明; 张淼; 代光照
Original assignee: Hubei Branch Of China National Tobacco Corp; Shandong Co Ltd Of China Nationaltobacco Corp; Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Hubei Branch Of China National Tobacco Corp; Shandong Co Ltd Of China Nationaltobacco Corp; Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2012-11-02
Filing date: 2012-11-02
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2032-11-02
Also published as: CN103031260B

Abstract

本发明公开了一株对具有较高解钾活性的变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)Trb33菌株及其培养方法和促进烟草生长中的应用。本发明提供的变栖克雷伯氏菌Trb33，可以用于硅酸盐微生物肥料的制备，分解土壤中钾长石和云母等硅酸盐矿物，从中释放出可溶性钾，供烟草吸收利用，减少化学钾肥的施用量，改善土壤微环境，提高烟叶品质。

Description

一种具有解钾作用的变栖克雷伯氏菌及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及生物菌种技术领域，尤其是具有解钾作用的变栖克雷伯氏菌，及该变栖克雷伯氏菌的培养方法和应用。

背景技术

烟草属于喜钾作物，钾含量是判断烟叶品质的重要指标之一，钾在烟草中，除了作为重要的营养元素发挥作用外，还能提高烟叶燃烧性从而降低焦油产生量，提高烟制品的安全性。钾在烟株体内几乎能够参与所有代谢进程(何念祖等，1987)，能够极大地影响烟株的能量和物质代谢。我国目前烟叶钾含量偏低，生产上主要以施用化学钾肥为主，通过增施钾肥，提升钾的有效性，能够有效增加烟叶中钾的含量(马朝文，2006；李强等，2007)。但是，我国的钾肥资源比较匮乏，并且钾肥成本高、利用率低，会破坏土壤的结构，降低有机质的含量(马光庭，2004)，造成污染，提高成本，而且单纯的增施钾肥并不能增加烟叶中钾的含量(郭合营等，1995；宋荣官等，1997)。

然而在土壤中，含钾量本来是非常丰富的，只是其中95％以上的钾是存在于硅酸盐矿物中，如以云母和钾长石的形态存在(别运清等，2002)，只有不到2％的钾是能够被作物直接吸收利用的速效性钾。

现有的研究报道，硅酸盐细菌又称为钾细菌，能够分解钾长石、云母等硅酸盐类矿物，即把土壤中的固态钾分解、转化成为可以被作物直接吸收的有效钾，同时它还可以分泌一些促进植物生长的活性物质(葛诚，2000；农业部肥政药政管理办公室，2002)。丁原书(2005)发现对硅酸盐细菌剂能够促进甘薯的生长发育，增强其抗旱性。使用硅酸盐菌剂对玉米拌种，能够提高出苗率，增加土壤中速效钾含量，促进植株的生长发育(梁盛年等，2006)。

还有研究表明，作物分泌物对根际微生物种类和数量有较大影响，烟草的许多重要物质如烟碱的合成主要在烟草根际完成，对微生物的影响更为明显。只有适应烟草根际独特的微生态环境，微生物才能定殖及发挥效力。目前有关烟草根际解钾细菌的报道较少，能够适应烟草根际生态环境的高效解钾菌种资源鲜见报道。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，提出一种具有解钾作用的硅酸盐细菌-变栖克雷伯氏菌，作用于烟草根际生态环境，具有很好的解钾能力。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种具有解钾作用的变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)Trb33菌株，2012年3月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.5933。

一种如上所述变栖克雷伯氏菌Trb33菌株的培养方法，包括以下步骤：

(1)从烟草根际取变栖克雷伯氏菌Trb33菌株，接种至现配的斜面培养基活化36～48小时，培养温度为28～30℃；

(2)取步骤(1)活化后的变栖克雷伯氏菌Trb33菌株，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，温度为28～30℃，160～200rpm震荡培养24～36小时。

优选的，所述斜面培养基的组成为：牛肉膏2～4g，蛋白胨4～6g，琼脂18～20g，蒸馏水1L，pH值7.0～7.2。

优选的，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的组成为：牛肉膏2～4g，蛋白胨4～6g，蒸馏水1L，pH值自然。

如上所述变栖克雷伯氏菌Trb33菌株在解钾方面的应用。

优选的，所述应用包括以下步骤：

①.从烟草根际取变栖克雷伯氏菌的Trb33菌株，接种至现配的斜面培养基活化36～48小时，培养温度为28～30℃；取活化后的变栖克雷伯氏菌Trb33菌株，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，温度为28～30℃，160～200rpm震荡培养24～36小时；

②.按每250ml的瓶装入50ml含有钾的硅酸盐矿物的解钾细菌液体培养基，灭菌，冷却后接入1ml步骤①变栖克雷伯氏菌的Trb33菌株培养液，26～30℃、130～170rpm振荡培养6～8d。

优选的，所述解钾细菌液体培养基组成为：

优选的，所述应用还包括以下步骤：

③.将步骤②培养液倒出并定容至50ml，在400～600rpm下离心10～12min，除去发酵液中的不溶性物质；取10ml的菌液8000～15000rpm离心10～15min，取上清液利用原子吸收光谱仪测定水溶性钾含量。

与现有技术相比，本发明提供的具有高解钾活性的变栖克雷伯氏菌 Trb33，可以用于硅酸盐微生物肥料的制备，分解土壤中钾长石和云母等硅酸盐矿物，从中释放出可溶性钾，供烟草吸收利用，减少化学钾肥的施用量，改善土壤微环境，提高烟叶品质。

本发明所提供的变栖克雷伯氏菌Trb33，针对现有高效解钾微生物的种类有限，特别是能够适应烟草根际生境(烟草根部合成大量烟碱，影响微生物区系)，达到提高烟草对钾元素的吸收，对从根本上提高烟草的钾含量、改善烟叶品质、缩小国内外差距意义重大。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。

实施例1烟草根际解钾细菌的分离

1、解钾细菌培养基：NaH₂PO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，FeCl₃ 0.05g，蔗糖5.0g，CaCO₃ 0.1g，钾长石粉1.0g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.5，121℃灭菌15min后备用。

2、牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，琼脂18～20g，蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2，121℃灭菌15min后备用。

采用解钾细菌培养基筛选土壤中的解钾细菌。取根际土样5g溶入100mL无菌水中，配制成10^-3～10^-6稀释度根际菌悬液，取10^-4～10^-6稀释度根际菌悬液50μl在Aleksandrov培养基(蔗糖5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、FeCl₃ 0.005g、NaH₂PO₄·12H₂O 2g、CaCO₃ 0.1g、琼脂粉20g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.2)上涂布，将平板在30℃温箱中培养72h，挑选生长旺盛、具有溶钾圈的菌株至牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，以厘米为计量单位，测量溶钾圈的直径，并编号，4℃保藏。

结果见下表1所示，表明从烟草根际土壤中共分离获得27株解钾细菌，溶解圈直径在0.11～0.30cm，其中Trb33菌株溶解圈直径最大，达0.30cm。

表1解钾细菌在平板上溶钾能力测定结果

菌株编号	溶钾圈直径(cm)	菌株编号	溶钾圈直径(cm)	菌株编号	溶钾圈直径(cm)
						Trb4	0.228	Trb16	0.11	Trb25	0.134
Trb6	0.188	Trb17	0.174	Trb26	0.226
						Trb7	0.202	Trb18	0.25	Trb27	0.164
Trb9	0.15	Trb19	0.206	Trb28	0.186
						Trb10	0.172	Trb20	0.122	Trb29	0.202
Trb11	0.144	Trb21	0.184	Trb30	0.264
						Trb13	0.162	Trb22	0.13	Trb31	0.18
Trb14	0.26	Trb23	0.196	Trb32	0.186
						Trb15	0.144	Trb24	0.258	Trb33	0.3

实施例2 Trb33菌株的鉴定

参考Kim等和Rainey等的方法小量提取实施例1中Trb33菌株的总DNA。用无菌牙签挑取少许已纯化的菌体重悬于2μL灭菌ddH₂O中，100℃煮沸10min后，迅速冰浴2min，4℃12000r/min离心5min备用。为保证PCR效果，每次用前均离心1次。取3μL上清液用于50μL PCR反应体系。反应使用的上游引物为：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，反应使用的下游引物为：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增体系(50μL)：0.5μL基因组DNA，2.5mmol/L dNTP混合物4μL，正、反向引物各1μL，0.5μL TansTaqDNA聚合酶(Fermentas)，5μL反应缓冲液(10×buffer)，ddH₂O38μL。PCR反应程序：94℃下1min，94℃下30s，48℃下30s，72℃下5min，72℃下10min，30个循环。

PCR产物由上海英骏生物技术有限公司北京测序部测序。将测序得到的结果在NCBI进行blastn比对，寻找具有较高同源关系的16S rDNA序列。

对解钾细菌Trb33菌株的16S rDNA进行序列测定，将获得的序列通过 BLAST程序与GenBank数据库中已报道的16S rDNA序列进行相似性比对分析。结果表明Trb33菌株与Klebsiella variicola(CP001891)关系密切，16S rDNA序列相似性99％。

Trb33菌株16S rDNA序列如下：

ATGCAGTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTGGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGGTGAGGTTAATAACCTCATCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGG TAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTACCACTT

此结果表明Trb33菌株为变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)。

实施例3 Trb33菌株解钾活性测定

进一步分析实施例2中在解钾培养基上显现出溶解圈的菌株从液体培养基上释放钾的能力。将配好的Aleksandrov液体培养基(不加琼脂)按每瓶50mL的装量加入250mL的三角瓶中，0.1MPa，20min灭菌，冷却后接进1mL解钾菌液，并设置不接种的空白对照。接种后，28±1℃、150rpm振荡培养7d，试验设3次重复，第7d测量培养液中速效钾含量。

上清液速效钾测定

将在三角瓶中培养好的钾细菌发酵液倒出并定容至50mL，将发酵液在500rpm下离心10min，除去发酵液中的不溶性物质，然后取10mL的菌液10000rpm离心10min，用火焰光度法检测上清液中的钾含量。同时，用不同浓度的2ppmKCL溶液制备标准曲线。从标准曲线中即可得出菌株对钾的降解量。

标准曲线的制备

将氯化钾置于60℃烘干，取1.908g溶于蒸馏水中并定容到1L。取该母液10mL用蒸馏水稀释到100mL以获得2ppm溶液，并用于制备0、2、4、6、8、10ppm标准液。上述标准液置于火焰光度计并获得K标准曲线。

27株烟草根际解钾细菌解钾能力测定结果如表2所示。结果表明，所有参试菌株均有一定的解钾能力，但菌株间差异较大，解钾活性范围分布在0.59～4.4mg/L，其中1.0mg/L以下的菌株有15株，占55.56％，1.0～2.0mg/L的菌株有8株，占29.63％，2.0mg/L以上的4株占14.81％。解钾效果最好的菌株Trb33有效钾活性为4.4mg/L，是对照组的8.8倍。

表2解钾细菌解钾效能测定结果

菌株	钾含量(mg/L)	菌株	钾含量(mg/L)	菌株	钾含量(mg/L)
						CK	0.50	CK	0.50	CK	0.50
Trb4	1.24	Trb16	1.47	Trb25	0.57
						Trb6	0.60	Trb17	0.63	Trb26	2.20
Trb7	2.22	Trb18	1.97	Trb27	0.95
						Trb9	0.60	Trb19	1.93	Trb28	0.75
Trb10	0.59	Trb20	0.68	Trb29	1.15
						Trb11	1.22	Trb21	0.63	Trb30	0.84
Trb13	0.63	Trb22	1.08	Trb31	0.75
						Trb14	3.34	Trb23	0.75	Trb32	0.75
Trb15	0.60	Trb24	1.18	Trb33	4.4

实施例4 对烟草促生作用测定

将实施例1中分离得到的解钾细菌进行盆栽测试。选择40天苗龄(4叶一心)的烟苗，移至盆钵，每盆1株，每个组5株。对照：将无菌水10mL浇灌于烟草根部；处理：将预先繁殖的稳定细菌组合配制成1×106cfu/mL的菌悬液，浇灌于烟草根部，每株10mL。按照温室常规管理，以接种日为起点日，第21d调查烟株的株高、叶长。

温室盆栽试验结果表明(表3)，参试菌株对烟草的生长均有一定程度的促进作用。利用解钾细菌菌液处理烟株20d后，与对照相比，株高增加0.97～38.64％，最大叶长增加4.4～31.02％，以菌株Trb33促生效果最为明显，株高和最大叶长较对照分别增加38.64％和31.02％。

表3解钾细菌对烟草促生作用测定

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种具有解钾作用的变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)Trb33菌株，2012年3月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.5933。

2.一种如权利要求1所述变栖克雷伯氏菌Trb33菌株的培养方法，包括以下步骤：

3.如权利要求2所述培养方法，其特征在于：所述斜面培养基的组成为：牛肉膏2～4g，蛋白胨4～6g，琼脂18～20g，蒸馏水1L，pH值7.0～7.2。

4.如权利要求2所述培养方法，其特征在于：所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的组成为：牛肉膏2～4g，蛋白胨4～6g，蒸馏水1L，pH值自然。

5.如权利要求1所述变栖克雷伯氏菌Trb33菌株在解钾方面的应用。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于：包括以下步骤：

7.如权利要求6所述应用，其特征在于：所述解钾细菌液体培养基组成为：

8.如权利要求6或7所述应用，其特征在于：包括以下步骤：

9.如权利要求6所述应用，其特征在于：所述斜面培养基的组成为：牛肉膏2～4g，蛋白胨4～6g，琼脂18～20g，蒸馏水1L，pH值7.0～7.2。

10.如权利要求6所述应用，其特征在于：所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的组成为：牛肉膏2～4g，蛋白胨4～6g，蒸馏水1L，pH值自然。