CN109055267B - 一株耐盐碱多粘类芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐盐碱多粘类芽孢杆菌及其应用。该菌株为分离自盐碱地棉花根际土壤的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)PAPM17，已于2018年7月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16118。该菌株能在盐碱土壤中存活，对没食子酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸等植物自毒物质有较好的降解效果，可减轻其引起的连作障碍，对盐碱地栽培的棉花具有促进生长和增加产量的作用。该菌株接种于以豆粕粉、玉米浆和糖蜜为主要营养源的发酵培养基中发酵后加入助剂喷雾干燥后制得活菌制剂，其发酵周期短，喷雾干燥过程中活菌损失少，保存过程中稳定性高。

Description

一株耐盐碱多粘类芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株耐盐碱多粘类芽孢杆菌及其应用，属于农业生物技术领域。

背景技术

盐碱地是我国重要的土地资源，具有巨大的开发潜力。据农科院南京土壤所报道，我国盐碱地和盐碱障碍耕地总面积超过5亿亩，其中具有农业利用潜力的多达2亿亩，占中国耕地面积的10％左右，主要分布在我国西北、东北及东部沿海地区。合理开发利用盐碱地，对保障我国粮食安全、促进农业可持续发展、改善生态环境及推动区域经济协调发展具有重要意义。

盐碱地改良是一项系统工程，需综合采用物理、化学、水利、生物等多种改良措施。在这些措施中，生物改良因具有较高的经济和生态效益，发展前景广阔。生物肥料在盐碱地生物改良中扮演着重要角色，它不仅具有促进植物生长、拮抗病原菌、缓解重茬效应、增加作物产量与质量等作用，还具有改良土壤、提高肥力、改善生态等作用。生物肥料中的有效微生物能否适应盐碱环境并在盐碱土壤中大量繁殖是决定其有效性的重要因素。针对盐碱土壤的特点，筛选能够耐受盐碱环境的功能性微生物，研发盐碱地专用生物肥料具有重要意义。

棉花(Gossypium)耐盐碱能力较强，是盐碱地广泛栽培经济作物。随着种植年限的增加，连作障碍成为影响棉花产量与品质主要制约因素之一。植物产生的自毒物质是引起连作障碍的主要原因之一，它可通过植物体淋溶、根系分泌物和植物残茬等途径进入土壤，影响下茬作物生长。酚酸类物质是棉花产生的一类自毒物质，包括没食子酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸等，对棉花生长具有显著的抑制作用。采用生物学措施促进土壤中酚酸类物质的降解，可有效减轻连作障碍。

筛选对酚酸类物质降解作用强的微生物，制成活菌制剂，用于降解土壤中的酚酸类自毒物质，以减轻连作障碍，是一种很有前途的生物防治措施。据报道，很多微生物均具有降解酚酸类物质的能力，包括黄孢原毛平革菌、粘质沙雷菌、生脂固氮螺菌、解淀粉芽孢杆菌等20多个种属，但分离自盐碱地棉花根际土壤、能同时降解没食子酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸等多种酚酸类物质的耐盐碱多粘类芽孢杆菌尚未有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株分离自盐碱地棉花根际土壤的微生物——多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)PAPM17及其应用。多粘类芽孢杆菌PAPM17菌株具有较强的耐盐碱能力，能够在盐碱土壤中繁殖，降解没食子酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸等多种酚酸类自毒物质，促进植物生长，减轻连作障碍。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一株分离自盐碱地棉花根际土壤的多粘类芽孢杆菌菌株PAPM17，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.16118，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年7月17日。

所述多粘类芽孢杆菌PAPM17菌株的菌落及菌体特征：在营养琼脂培养基上37℃培养36h，菌落乳白色，圆形、凸起、有光泽、表面光滑、湿润、具粘性、边缘整齐、不易挑取；菌体呈杆状、革兰氏阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，不膨大，无伴孢晶体。所述营养琼脂培养基配方为：蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000ml，pH 7.0。

所述多粘类芽孢杆菌PAPM17菌株的生理生化特征：吲哚试验阴性、硝酸盐还原试验阳性、v-p试验阳性、酪素水解试验阳性、淀粉水解试验阳性、5％NaCl试验阳性、L-阿拉伯糖试验阳性、D-葡萄糖试验阳性、D-木糖试验阳性、柠檬酸盐利用试验阴性、厌氧生长试验阳性、氧化酶试验阴性、接触酶试验阳性。

所述多粘类芽孢杆菌PAPM17菌株活菌制剂的制备方法，其特征是，首先制备多粘类芽孢杆菌PAPM17的种子液，然后接种于以豆粕粉、玉米浆和糖蜜为主要营养源的发酵培养基中，发酵36-48h，再向发酵液加入叔丁基对羟基茴香醚、酵母浸粉和生物黄腐酸粉，然后进行喷雾干燥，得到活菌制剂原粉，再进一步制得活菌制剂。

具体包括以下步骤：

1)活化：将多粘类芽孢杆菌PAPM17转接入营养琼脂培养基活化；所述营养琼脂培养基的配方为：蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000ml，pH 7.5。

2)制备二级种子：将活化后的多粘类芽孢杆菌PAPM17菌株接种于营养肉汤培养基，35-40℃培养24-28h，即为一级种子液，然后将一级种子以1-2％(质量比)的接种量转接入营养肉汤培养基，35-40℃培养24-28h，即为二级种子；所述营养肉汤培养基的配方为：蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl 5g、水1000ml、pH 7.5。

3)发酵培养：将二级种子以1-2％(质量比)的接种量转接入发酵培养基中，35-40℃培养36-48h，即为多粘类芽孢杆菌PAPM17发酵液。

其中，步骤3)所述发酵培养基的配方为：豆粕粉15g、玉米浆15g、糖蜜15g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁1.0g、硫酸锰0.2g、碳酸钾2g、邻苯二甲酸500mg、复合酶制剂2g、水1000mL，初始pH7.5。所述复合酶制剂的组成为(质量比)：碱性蛋白酶40％、木瓜蛋白酶30％、纤维素酶30％。

4)向步骤3)所述多粘类芽孢杆菌PAPM17发酵液中加入叔丁基对羟基茴香醚(BHA)0.001-0.02％(w/w)、酵母浸粉1-5％(w/w)、生物黄腐酸粉5-15％(w/w)，搅拌均匀，然后于进口温度160-200℃，出口温度60-80℃的条件下进行喷雾干燥，获得活菌制剂原粉。

进一步的，所述多粘类芽孢杆菌PAPM17活菌制剂原粉与生物黄腐酸粉按质量比1：(5-10)的比例混匀，即为多粘类芽孢杆菌PAPM17活菌制剂。

本发明还公开了多粘类芽孢杆菌PAPM17活菌制剂的使用方法：多粘类芽孢杆菌PAPM17活菌制剂加水稀释50～100倍，移苗时蘸根或浇水时随水冲施。

本发明的有益效果：

本发明多粘类芽孢杆菌PAPM17耐盐碱能力较强，能在盐碱土壤中生长繁殖，促进植物生长，降解没食子酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸等植物自毒物质，培养5d后，对羟基苯甲酸、没食子酸和阿魏酸的降解率分别可达64％、68％、72％，其活菌制剂可用于降解盐碱地棉花产生的自毒物质，减轻连作障碍，促进棉花生长，提高棉花产量。

本发明多粘类芽孢杆菌PAPM17活菌制剂的生产方法科学，发酵液活菌数高，生产成本低。发酵培养基中添加复合酶制剂，灭菌时在升温过程中对豆粕与玉米浆等原料进行水解，可缩短延迟期，提高原料利用率，提高发酵液中的活菌浓度与芽孢生成率。喷雾干燥时加入抗氧化剂叔丁基对羟基茴香醚与对活菌具有保护作用的酵母浸粉，可以减少喷雾干燥过程中活菌数量的损失，并可提高活菌制剂在保存过程中的稳定性。

附图说明

图1为基于16S rDNA部分序列构建的系统发育树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：多粘类芽孢杆菌PAPM17的筛选

多粘类芽孢杆菌PAPM17分离自盐碱地棉花根际土壤。土壤取样于山东省东营市垦利区永安镇，为连续种植棉花5年以上的盐碱土壤。具体分离方法为：称取混匀后的土样5g，放入100mL富集培养基中，37℃、150rpm振荡培养5d。取富集培养物1mL进行10^-1～10^-5系列稀释，然后取10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度涂布至含选择培养基的平板上，37℃培养5d。分别挑取单菌落划线至含选择培养基的平板上，37℃培养5d。挑取单菌落转接至保藏培养基试管斜面上，37℃培养2d，长满菌苔后，置于4℃冰箱中保存备用。

所述富集培养基的配方为：邻苯二甲酸800mg、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.1g、氯化钾0.2g、氯化钠3g、磷酸氢二钾1.5g、蒸馏水1000mL、pH8.5。

所述选择性培养基的配方为：邻苯二甲酸1000mg、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.1g、氯化钾0.2g、氯化钠3g、磷酸氢二钾1.5g、蒸馏水1000mL、琼脂20g，pH8.5。

所述保藏培养基的配方为：对羟基苯甲酸1000mg、牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000ml、pH 7.5。

将各株分离物分别转接入添加1000mg/L对羟基苯甲酸、1000mg/L没食子酸或1000mg/L阿魏酸的基础培养基中，37℃、150rpm振荡培养5d后，采用高效液相色谱法测定对羟基苯甲酸、没食子酸、阿魏酸的降解率，筛选出1株对三种自毒物质均具有较好降解效果的分离物，即PAPM17菌株。

所述基础培养基的配方为：蛋白胨5g、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.1g、氯化钾0.2g、氯化钠0.5g、水1000ml、pH 8.5。

高效液相色谱法测定对羟基苯甲酸、没食子酸、阿魏酸降解率时采用的条件为：以乙腈和水(用乙酸调节pH2.8)为流动相，流速0.8mL/min，柱温25℃，检测波长280nm。采用梯度洗脱，0-40min，乙腈从5％提高到40％，40-50min，乙腈保持40％，50-55min，乙腈从40％下降到5％。

实施例2：多粘类芽孢杆菌PAPM17的鉴定

(1)形态与生理生化特特征

所述PAPM17菌株的形态特征为：在营养琼脂培养基上37℃培养36h，菌落乳白色，圆形、凸起、有光泽、表面光滑、湿润、具粘性、边缘整齐、不易挑取；菌体呈杆状、革兰氏阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，不膨大，无伴孢晶体。所述营养琼脂培养基的配方为蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000ml、pH 7.5。

所述PAPM17菌株的生理生化特征为：吲哚试验阴性、硝酸盐还原试验阳性、v-p试验阳性、酪素水解试验阳性、淀粉水解试验阳性、5％NaCl试验阳性、L-阿拉伯糖试验阳性、D-葡萄糖试验阳性、D-木糖试验阳性、柠檬酸盐利用试验阴性、厌氧生长试验阳性、氧化酶试验阴性、接触酶试验阳性。

(2)16S rDNA序列分析

将PAPM17菌株接种到营养肉汤培养基中，37℃、150r/min摇床培养28h。所述营养肉汤培养基的配方为：蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl 5g、水1000ml，pH 7.5。收集菌体，提取总DNA，然后以其为模板，在原核生物16S rRNA基因的通用引物F27:5′-AGA GTT TGA TCA TGGCTC AG-3′和F27:5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′的引导下进行16S rDNA基因的PCR扩增。扩增条件为：95℃预变性3min，94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1.5min，共30个循环，72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用胶回收试剂盒回收，交由上海生工生物技术有限公司测序，所得序列如序列表SEQ No.1所示。将所测16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，并用MEGA 4.0软件进行多序列同源性分析，并构建系统发育树，如图1所示。

通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析可知，该菌株为多粘类芽孢杆菌，命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)PAPM17。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.16118，保藏日期为2018年7月17日。

实施例3多粘类芽孢杆菌PAPM17对没食子酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸的降解试验

制备含对羟基苯甲酸的培养基，其配方为：对羟基苯甲酸1000mg、蛋白胨5g、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.1g、氯化钾0.2g、氯化钠0.5g、水1000ml，pH 7.5。

制备含没食子酸的培养基，其配方为：没食子酸1000mg、蛋白胨5g、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.1g、氯化钾0.2g、氯化钠0.5g、水1000ml，pH 7.5。

制备含阿魏酸的培养基，其配方为：阿魏酸1000mg、蛋白胨5g、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.1g、氯化钾0.2g、氯化钠0.5g、水1000ml，pH 7.5。

将多粘类芽孢杆菌PAPM17转接入上述三种培养基中，37℃、150rpm振荡培养5d。取培养液10mL，4000r/min离心10min，弃沉淀，上清液采用10mL二氯甲烷萃取。萃取相采用真空旋转蒸发仪蒸干，残留物用1mL甲醇溶解，备用。

采用高效液相色谱法测定对羟基苯甲酸、没食子酸、阿魏酸降解率时采用的条件为：以乙腈和水(用乙酸调节pH2.8)为流动相，流速0.8mL/min，柱温25℃，检测波长280nm。采用梯度洗脱，0-40min，乙腈从5％提高到40％，40-50min，乙腈保持40％，50-55min，乙腈从40％下降到5％。

高效液相色谱法检测结果表明，多粘类芽孢杆菌PAPM17培养5天，对自毒物质对羟基苯甲酸、没食子酸、阿魏酸的降解率分别为64％、68％、72％。

实施例4多粘类芽孢杆菌PAPM17菌剂的制备

所述多粘类芽孢杆菌PAPM17菌株菌剂的制备方法包括以下步骤：

1)菌种活化：将多粘类芽孢杆菌PAPM17转接入营养琼脂培养基试管斜面，于37℃培养28h进行活化。所述营养琼脂培养基的配方为：蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000ml，pH 7.5。

2)三角瓶种子制备：用接种环刮取活化后的多粘类芽孢杆菌PAPM17菌苔，接种于营养肉汤培养基中，37℃培养28h。所述营养肉汤培养基的配方为蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCl 5g、水1000ml，pH 7.5。

3)种子罐菌种制备：将三角瓶种子以2％(质量比)的接种量转接入装有7L营养肉汤培养基的10L种子罐中，于37℃培养28h，全程搅拌转速220rpm，0-10h通风量为4L/min，11-28h通风比为7L/min。

4)发酵培养：将种子罐菌种以2％(质量比)的接种量转接入500L的发酵罐。发酵罐内装发酵培养基中350L，37℃培养48h，即为多粘类芽孢杆菌PAPM17的发酵液。全程搅拌转速为150rpm，0-10h通风量为180L/min，11-28h通风量为350L/min。发酵结束后，发酵液中多粘类芽孢杆菌PAPM17的活菌数为(1～2)×10¹⁰cfu/ml，芽孢生成率为85％～90％。

步骤4)所述发酵培养基的配方为：豆粕粉15g、玉米浆(固含量40-50％)15g、糖蜜15g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁1.0g、硫酸锰0.2g、碳酸钾2g、邻苯二甲酸500mg、复合酶制剂2g、水1000mL，初始pH7.5。所述复合酶制剂的组成为(质量比)：碱性蛋白酶40％、木瓜蛋白酶30％、纤维素酶30％。碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶均由泰安信得利生物科技有限公司生产，产品规格分别为20万U/g、10万U/g与20万U/g。碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的活力单位定义与检测方法执行国家标准GB/T 23527-2009《蛋白酶制剂》，纤维素酶的酶活力单位定义与检测方法执行中华人民共和国轻工行业标准QB 2583-2003《纤维素酶制剂》。

步骤4)所述发酵培养基的制备方法为：按照配方称取原料，溶于水中，加热至48-52℃，保温1.5h，然后升温至121℃，保温30min进行灭菌。

5)发酵结束后，向发酵液中加入叔丁基对羟基茴香醚(BHA)0.01％(w/w)、酵母浸粉2％(w/w)、生物黄腐酸粉10％(w/w)，搅拌均匀，然后于进口温度180℃，出口温度70℃的条件下进行喷雾干燥，获得活菌制剂原粉。

将多粘类芽孢杆菌PAPM17活菌制剂原粉与生物黄腐酸粉按1：5的比例混匀，即为多粘类芽孢杆菌PAPM17活菌制剂，其活菌含量优选为(1.0～2.0)×10¹⁰cfu/g。

所述生物黄腐酸粉由山东泉林嘉有肥料有限责任公司生产，其黄腐酸含量为40％。

实施例5多粘类芽孢杆菌PAPM17菌剂对盐碱地棉花的促生作用

试验地位于山东省东营市垦利区，土壤类型为滨海盐渍土。耕层土壤pH8.06，全盐含量2.43‰，有机质含量7.5g/kg，全氮含量837mg/kg，速效氮含量57.6mg/kg，速效磷含量23.17mg/g，速效钾含量80.65mg/g。棉花品种采用鲁棉研28，播种日期为2017年4月18日。

试验设2个处理：T1：施尿素300kg/hm²，过磷酸钙500kg/hm²，硫酸钾200kg/hm²，有机肥3000kg/hm²，经灭菌处理的多粘类芽孢杆菌PAPM17菌剂15kg/hm²；T2：施尿素300kg/hm²，过磷酸钙500kg/hm²，硫酸钾200kg/hm²，有机肥3000kg/hm²，多粘类芽孢杆菌PAPM17活菌制剂15kg/hm²。全部肥料均为基施。各处理均3次重复，随机区组设计，小区面积90m²，小区间设1.5m宽间道。常规管理，棉花收获后统计各组的株高和籽棉产量。

试验结果如表1所示，施用多粘类芽孢杆菌PAPM17活菌制剂的处理T2棉花株高增加7.6％，籽棉产量增加12.6％。由此可见，多粘类芽孢杆菌PAPM17活菌制剂对盐碱地棉花具有促生与增产作用。

表1多粘类芽孢杆菌PAPM17活菌制剂对棉花的促生与增产作用

处理组	株高(m)	籽棉产量(kg·hm-2)
			T1	67.15	1756.1
T2	72.25	1978.2

SEQUENCE LISTING

<110> 山东佐田氏生物科技有限公司

<120> 一株耐盐碱多粘类芽孢杆菌及其应用

<130> 0

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1406

<212> DNA

<213> 多粘芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）PAPM17

<400> 1

ttgcggttac ctcaccgact tcgggtgttg taaactctcg tggtgtgacg ggcggtgtgt 60

acaagacccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag caattccgac 120

ttcatgtagg cgagttgcag cctacaatcc gaactgagac cagcttttct aggattggct 180

ccagatcgct ccttcgcttc ccgttgtacc ggccattgta gtacgtgtgt agcccaggtc 240

ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca ccggcagtct 300

gcttagagtg cccagcttga cctgctggca actaagcata agggttgcgc tcgttgcggg 360

acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct gtctcctctg 420

tcccgaagga aagatctgtc tctagaccgg tcaaagggat gtcaagacct ggtaaggttc 480

ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatact ccactgcttg tgcgggtccc cgtcaattcc 540

tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc caggcggaat gcttaatgtg ttaacttcgg 600

caccaagggt atcgaaaccc ctaacaccta gcattcatcg tttacggcgt ggactaccag 660

ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgcgcctca gcgtcagtta cagcccagag 720

agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca tctctacgca tttcaccgct acacgtggaa 780

ttccactctc ctcttctgca ctcaagctct cccagtttcc agtgcgaccc gaagttgagc 840

ctcgggatta aacaccagac ttaaagagcc gcctgcgcgc gctttacgcc caataattcc 900

ggacaacgct tgccccctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccggggcttt 960

cttctcaggt accgtcacct caatagcagt tactctacaa gacgttcttc cctggcaaca 1020

gagctttacg atccgaaaac cttcatcact cacgcggcgt tgctccgtca ggctttcgcc 1080

cattgcggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtc tgggccgtgt ctcagtccca 1140

gtgtggccga tcaccctctc aggtcggcta cgcatcgtcg ccttggtagg cctttacccc 1200

accaactagc taatgcgccg caggcccatc cacaagtgac agattgctcc gcctttcctc 1260

cttctcccat gcaggaaaag gatgtatcgg gtattagcta ccgtttccgg tagttatccc 1320

tgtcttgtgg gcaggttgcc tacgtgttac tcacccgtcc gccgctaggt tagttagaag 1380

caagcttcta attaaccccg ctcgac 1406

Claims (9)

1.一株耐盐碱多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)菌株PAPM17，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.16118。

2.权利要求1所述的耐盐碱多粘类芽孢杆菌菌株PAPM17在降解酚酸类植物自毒物质，促进盐碱地棉花生长，提高棉花产量方面的应用；所述酚酸类植物自毒物质为没食子酸、对羟基苯甲酸和阿魏酸。

3.一种含有权利要求1所述的耐盐碱多粘类芽孢杆菌PAPM17菌株的活菌制剂。

4.权利要求3所述活菌制剂的制备方法，其特征在于，首先制备多粘类芽孢杆菌PAPM17的种子液，然后接种于以豆粕粉、玉米浆和糖蜜为主要营养源的发酵培养基中，发酵36-48h，再向发酵液加入叔丁基对羟基茴香醚、酵母浸粉和生物黄腐酸粉，进行喷雾干燥，获得活菌制剂原粉，再进一步制得活菌制剂。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为：豆粕粉15g、玉米浆15g、糖蜜15g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁1.0g、硫酸锰0.2g、碳酸钾2g、邻苯二甲酸500mg、复合酶制剂2g、水1000mL，初始pH7.5；所述复合酶制剂的组成为碱性蛋白酶40％、木瓜蛋白酶30％和纤维素酶30％。

6.如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)活化：将多粘类芽孢杆菌PAPM17转接入营养琼脂培养基活化；

2)制备二级种子：将活化的多粘类芽孢杆菌PAPM17菌株接种于营养肉汤培养基，35-40℃培养24-28h，即为一级种子液，然后将一级种子以质量比1-2％的接种量转接入营养肉汤培养基，35-40℃培养24-28h，即为二级种子；

3)发酵培养：将二级种子以质量比1-2％的接种量转接入发酵培养基中，35-40℃培养36-48h，即为多粘类芽孢杆菌PAPM17发酵液；

4)向步骤3)所述多粘类芽孢杆菌PAPM17发酵液中按质量比加入叔丁基对羟基茴香醚0.001～0.02％、酵母浸粉1～5％、生物黄腐酸粉5～15％，搅拌均匀，然后喷雾干燥，获得活菌制剂原粉；

5)将多粘类芽孢杆菌PAPM17活菌制剂原粉与生物黄腐酸粉按质量比1：(5-10)的比例混匀，得到多粘类芽孢杆菌PAPM17活菌制剂。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述叔丁基对羟基茴香醚添加量为0.01％、酵母浸粉添加量为2％、生物黄腐酸粉添加量为10％。

8.权利要求3所述的活菌制剂在降解酚酸类植物自毒物质，促进盐碱地棉花生长，提高棉花产量方面的应用；所述酚酸类植物自毒物质为没食子酸、对羟基苯甲酸和阿魏酸。

9.权利要求3所述的活菌制剂的使用方法，其特征在于，多粘类芽孢杆菌PAPM17活菌制剂加水稀释50～100倍，移苗时蘸根或浇水时随水冲施。

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