CN110982730B - 一种微生物肥料、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物肥料领域，公开了一种微生物肥料、制备方法及其应用。本发明所述的微生物肥料，包括以下质量份数的组分：鸡粪20‑50份、草炭20‑40份、椰糠20‑40份、油棕叶片10‑40份，权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌HNU1发酵液0.25‑1.25份；所述的解淀粉芽孢杆菌HNU1菌株发酵液的菌株浓度大于1×108cfu/g。其中，解淀粉芽孢杆菌HNU1的保藏编号为CGMCC No.17834。本发明所述的微生物肥料中所添加的解淀粉芽孢杆菌HNU1系从淤泥土壤中筛选纯化，对环境没有危害。制得的微生物有机肥料可广泛用于热带林木土壤修复、瓜果和蔬菜高产优质栽培领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物肥料、制备方法及其应用，属于微生物肥料领域。
背景技术
天然橡胶作为重要的工业原材料，是热带地区的农业和经济发展的主要产业，在我国的海南和云南等地广泛种植。研究表明高林龄胶园的土壤肥力随时间的增长呈下降趋势，主要原因是受以胶乳和木材的形式转移、土壤淋溶以及水土流失等因素影响，土壤养分降低，导致橡胶产量和品质下降，橡胶产业发展受到限制。胶农在橡胶种植过程中，为了提高其产量，过量施用化肥，导致出现胶园土壤板结，土壤呈酸性化及环境污染等问题。
目前在橡胶树专用肥上的研究，主要侧重于化学肥料研究，微生物肥料研究较少。利用微生物修复土壤重金属污染是土壤治理的一个研究热点，具有广阔的发展前景。微生物具有丰富多样的代谢途径，并进化出多种抵抗重金属毒性的机制，如微生物可通过生物累积、生物矿化、生物吸附和生物转化等机制对重金属进行吸附、沉淀、氧化和还原，因此可以利用微生物对重金属的抗性机制对环境中的重金属污染进行修复。在微生物修复重金属污染的研究中，细菌类的微生物以芽孢杆菌为主。
芽孢杆菌是一类重要的资源微生物，该类细菌产芽孢，好氧或兼性厌氧，抗逆性强，可在极端环境下生存。芽孢杆菌在土壤环境中广泛存在，是被广泛研究的生防微生物之一，也是重金属污染的微生物修复技术中的重要微生物资源。微生物修复法具有来源广，成本低，操作简单，无二次污染等优点。由于微生物本身的性质，微生物修复法也存在局限性。微生物受环境温度、pH及营养物质等条件的影响，在土壤环境中不易存活及繁殖，导致微生物对重金属污染土壤的修复效果不稳定。如何提供微生物菌种适宜的营养物质及生存环境条件在微生物修复法技术存在着重要地位。申请人分离鉴定得到1株解淀粉芽孢杆菌HNU1菌株，开发为微生物肥料及其并在热带林木生长上应用。
发明内容
针对海南和云南橡胶树胶园等热带林木栽培存在的有机质含量降低、土壤酸化和人工短缺等问题，本发明提供了一种微生物肥料，可在橡胶树和其他热带珍贵树种栽培中使用，具有高效、对环境无危害的特点，可广泛用于热带林木土壤修复，瓜果和蔬菜高产优质栽培领域。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种制备微生物肥料的菌株，为解淀粉芽孢杆菌HNU1（
Bacillus
amyloliquefaciens HNU1），其保藏编号为CGMCC No. 17834，其16SrDNA序列为SEQ IDNO.1所示。
一种微生物肥料，包括以下质量份数的组分：鸡粪20-50份、草炭20-40份、椰糠20-40份、油棕叶片10-40份，权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌HNU1发酵液 0.25-1.25份；所述的解淀粉芽孢杆菌HNU1菌株发酵液的菌株浓度大于1×108cfu/g。
上述微生物肥料的制备方法，包括以下步骤：
将鸡粪、草炭、椰糠和油棕叶等按配比混合均匀，加水搅拌均匀，再加入配方量的解淀粉芽孢杆菌HNU1菌株发酵液，发酵获得微生物肥料。
进一步，所述的解淀粉芽孢杆菌HNU1菌株发酵液，其制备方法为：取解淀粉芽孢杆菌HNU1菌种原液，按培养基质量的0.1-1%的接种量接入LB液体培养基中进行活化培养18-24h；将活化菌液按培养基质量1-5%的接种量，接入LB液体培养基中进行扩大培养24-36h，获得发酵种子液；发酵种子液接种至LB液体培养基中进行液体发酵，得到解淀粉芽孢杆菌发酵液。
进一步，所述的LB液体培养基中，以培养基的总体积计，各组分的质量浓度为：蔗糖1.0-3.0 g/L、酵母1.0-4.0 g/L、蛋白胨1.0-6.0 g/L、MgSO4 1.0-5.0 g/L，液体发酵条件为：温度为20-50℃，转速为120-240rpm之间，pH 4.0-10.0，发酵种子液接种量为0.1-2%（v/w）。
进一步，水的加入量为物料总质量的60-70%，发酵温度为10-70℃，发酵时间为15-30天。
以上所述的微生物肥料在制备促进植物生长的肥料中的应用。
进一步，所述的植物为热带林木,优选地所述的热带林木为橡胶、大果紫檀或酸枝。
进一步，所述的植物为瓜果蔬菜,优选地所述的瓜果蔬菜为小白菜或番茄。
进一步，上述应用中，微生物肥料的用量为每亩施8-10kg。
有益效果
本发明采用微生物学和栽培学方法，从海南省淤泥土壤中筛选、纯化得到的解淀粉芽孢杆菌HNU1具有快速发酵功能，将其与农林热带废弃物鸡粪、油棕叶片、草炭土、椰糠等混合发酵制备成微生物肥料，能够提高发酵温度，缩短发酵时间。发酵制得的微生物肥料，有机质含量可达75.20%以上，pH7.87，菌量1×1010cfu/g，NPK>5%，钙、镁、铁、锰、铜、锌含量分别为2.98、0.37、0.20、0.27、0.00和0.15g/kg，超过NY-884-2012《生物有机肥》国家标准。施用之后，可以提高土壤pH，提高土壤有机质，显著促进橡胶树和酸枝等珍贵林木生长。对于番茄和小白菜等瓜果蔬菜也具有显著的促进生长作用。
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌HNU1系从淤泥土壤中筛选纯化，对环境没有危害，可广泛用于热带林木土壤修复、瓜果和蔬菜高产优质栽培领域。
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌HNU1于2019年05月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所。
序列表
<110> 海南大学
<120> 一种微生物肥料、制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1472
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60
cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120
aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtctga accgcatggt tcagacataa 180
aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 240
aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300
ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360
aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420
ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag 480
ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa 540
ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 600
aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660
acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct 720
ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg 780
tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc 840
agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa 900
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960
cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag 1020
agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080
caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg 1140
ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200
ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa 1260
tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa 1320
tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380
gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggagcc 1440
agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tg 1472
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为PCR程序流程图；
图2为HNU1菌株菌体形态图。
实施方式
下面结合具体的实施方式对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。
实施例1 菌株发酵液的制备
（1）菌株的分离、鉴定
解淀粉芽孢杆菌HNU1是通过浓度梯度稀释法以及平板涂布划线分离法从土壤中分离、纯化获得。利用TIANGEN细菌基因组DNA 提取试剂盒提取HNU1菌株的基因组DNA。以基因组DNA为模板，用正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTGGCTCAG-3’和反向引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’进行PCR反应，扩增菌株的16S rDNA序列，PCR程序为94℃预变性5min，90℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸2min，三个步骤循环35次，最后72℃延伸10min，16℃保存（如图1所示）。获得的16S rDNA序列见SEQ ID NO.1，经鉴定，命名为解淀粉芽孢杆菌HNU1。菌株在LB平板上形成圆形或近似圆形的乳白色菌落，前期菌落的表面光滑湿润、边缘整齐、稍有光泽，后期菌落的表面粗糙、边缘不整齐；在显微镜下观察到其菌体为短杆状，两端钝圆，菌体间首尾相连，以链状排列（如图2所示）。菌株的革兰氏染色、淀粉水解反应、接触酶反应、V-P 反应、柠檬酸盐利用反应和硝酸盐还原反应等生理生化反应呈阳性，甲基红反应、吲哚反应及脲酶反应等呈阴性；菌株在2~10%的盐浓度范围内均可正常生长；菌株可利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇及肌醇等碳源进行发酵产酸。
（2）菌株发酵液的制备方法
将解淀粉芽孢杆菌HNU1从超低温冰箱中取出菌种原液，按0.1~1%的接种量接入LB液体培养基中进行活化培养18~24h。将活化菌液按1~5%的接种量，进行扩大培养24~36h，获得发酵种子液。发酵种子液按0.1-2%(v/w)的接种量接种至LB液体培养基中进行液体发酵，得到菌株发酵液。培养条件为温度在30℃，转速在180rpm，pH在7.0，LB液体培养基配比为：蔗糖2.0g/L，酵母4.0g/L、蛋白胨4.0g/L、MgSO4 5.0 g/L。用分光光度计测定其OD600值，菌株发酵液的OD600值在2.0以上，即为浓度>1×108cfu/g的菌株发酵液。
实施例2
一种微生物肥料，包括以下质量份数的组分：鸡粪20份、草炭20、椰糠20、油棕叶片20份，解淀粉芽孢杆菌HNU11份。
其制备方法为：
将鸡粪、草炭、椰糠和油棕叶等按20:20:20:20比例混合均匀，按物料质量之和的60-70%加入自来水，搅拌均匀。再按物料质量之和的1%比例加入实施例1制得的菌株发酵液，在室温(20-25℃)条件下，进行固体发酵培养15-25天，获得微生物肥料。
实施例3
一种微生物肥料，包括以下质量份数的组分：鸡粪40份、草炭20、椰糠20、油棕叶片20份，解淀粉芽孢杆菌HNU1 0.25份。
将鸡粪、草炭、椰糠和油棕叶等按40:20:20:20比例混合均匀，按物料质量之和的60-70%加入自来水，搅拌均匀。再按物料质量之和的3%比例加入实施例1制得的菌株发酵液，在10℃下，进行固体发酵培养25-30天，获得微生物肥料。
实施例4
一种微生物肥料，包括以下质量份数的组分：鸡粪40份、草炭40、椰糠20、油棕叶片20份，解淀粉芽孢杆菌HNU1 1.25份。
将鸡粪、草炭、椰糠和油棕叶等按40:20:20:20比例混合均匀，按物料质量之和的60-70%加入自来水，搅拌均匀。再按物料质量之和的3%比例加入实施例1制得的菌株发酵液，在70℃下，进行固体发酵培养15-20天，获得微生物肥料。
实施例5-10
鸡粪、草炭、椰糠、油棕叶片和解淀粉芽孢杆菌HNU1的比例按表1进行配比，按照实施例2的方法分别制备微生物肥料。
表1实施例5-10微生物肥料组分配比
| 组分 | 鸡粪 | 草炭 | 椰糠 | 油棕叶片 | 解淀粉芽孢杆菌HNU1发酵液 |
| 实施例5 | 40 | 40 | 40 | 20 | 1 |
| 实施例6 | 20 | 20 | 20 | 40 | 1.25 |
| 实施例7 | 20 | 20 | 40 | 40 | 0.25 |
| 实施例8 | 20 | 40 | 40 | 40 | 1 |
| 实施例9 | 30 | 25 | 25 | 20 | 0.25 |
| 实施例10 | 50 | 20 | 20 | 10 | 0.5 |
本发明所述的微生物肥料促进热带林木生长对比试验
为了排除土壤、气候等因素的影响，更好的比较试验效果，本发明在大棚内进行栽培实验。本实验选择酸枝、大果紫檀和橡胶树等林木，种植密度为酸枝25株/每亩、大果紫檀25株/每亩、橡胶树25株/每亩。将红土壤与草炭3:1混合均匀后装入塑料盆作为栽培基质，按照每亩地肥料施用量为8~10kg，分别计算每株作物的肥料用量，并将不同的肥料分别加入到栽培基质中，搅拌均匀。（1）CK组：加入鸡粪、草炭、椰糠和油棕叶混合物。
（2）化肥：选择史丹利牌复合肥，NPK：25-15-5，有效成分≥45%，生产厂家：史丹利农业集团股份有限公司。
（3）商品菌肥：联盟有机肥，氮磷钾≥4% 有机质≥30%，主要成分为草炭土等，生产厂家：山东联盟化工集团有限公司
（4）微生物肥料1：本发明实施例2微生物肥料。
（5）微生物肥料2：商品菌肥加入鸡粪、草炭、椰糠和油棕叶，按照实施例2的方式进行发酵。
将橡胶树、大果紫檀和酸枝等种子分别播种到栽培基质中，定期浇水管理，待生长至120天后，收集植株并测量其株高和根长，并以CK计算株高增长率和根长增长率。
表2 微生物肥料促进酸枝、大果紫檀和橡胶树生长对比结果
表2结果表明，鸡粪、草炭、椰糠和油棕叶混合物培养珍贵树种酸枝120d后的株高和根长分别为35.5cm和21cm，化肥处理后增长率分别为18.31和47.62%，商品菌肥的增长率30.99和-14.29%，解淀粉芽孢杆菌HNU1制成的微生物肥料1增长率分别为57.75和4.76%，商品菌肥加入鸡粪、草炭、椰糠和油棕叶1:1:1:1比例混合物培养15d获得的微生物肥料2增长率分别为35.21和-9.52%。说明解淀粉芽孢杆菌HNU1制成的微生物肥料1对酸枝生长具有显著的促进作用。
鸡粪、草炭、椰糠和油棕叶混合物培养珍贵树种大果紫檀120d后的株高和根长分别为30.5cm和22cm，化肥处理后增长率分别为-36.07和4.55%，商品菌肥的增长率-24.59和9.09%，解淀粉芽孢杆菌HNU1制成的微生物肥料1增长率分别为9.84和54.55%，商品菌肥加入鸡粪、草炭、椰糠和油棕叶1:1:1:1比例混合物培养15d获得的微生物肥料2增长率分别为-18.03和13.64%。说明解淀粉芽孢杆菌HNU1制成的微生物肥料1对大果紫檀生长具有显著的促进作用。
鸡粪、草炭、椰糠和油棕叶混合物培养橡胶树品种RY73397120d后的株高和根长分别为42.5cm和19cm，化肥处理后增长率分别为35.29和15.79%，商品菌肥的增长率32.94和36.84%，解淀粉芽孢杆菌HNU1制成的微生物肥料1增长率分别为97.65和52.63%，商品菌肥加入鸡粪、草炭、椰糠和油棕叶1:1:1:1比例混合物培养15d获得的微生物肥料2增长率分别为38.12和42.11%。说明解淀粉芽孢杆菌HNU1制成的微生物肥料1对橡胶树品种RY73397生长具有显著的促进作用。
本发明所述的微生物肥料促进瓜果蔬菜生长的对比实验
将红土壤与草炭3:1混合均匀后装入塑料盆中作为栽培基质，按照每亩施用量为8-10kg，分别加入微生物肥料和商品菌肥，搅拌均匀，以不添加任何肥料处理为对照处理组。将等量的番茄种子按照每亩地2000株的种植密度，分别播种到添加了不同肥料的栽培基质中，定期浇水管理，待生长至40天后，收集植株并测量其株高和根长，并以CK计算株高增长率和根长增长率。
将红土壤装入塑料盆中，按照每亩施用量为8-10kg，加入微生物肥料，搅拌均匀，以不添加任何肥料处理为对照处理组。将等量小白菜种子按照每亩地200g种子的播种密度，分别播种到添加了不同肥料的栽培基质中，待生长至40天后，收集植株并测量其株高、地上部分鲜重和干重，并以CK计算株高增长率和干重增长率。
表3 微生物肥料促进番茄生长对比结果
| 处理 | 株高 | 根长 | 株高增长率（%） | 根长增长率（%） |
| CK | 11.4 | 14.5 | ||
| 商品菌肥 | 35.5 | 28.5 | 211.40 | 96.55 |
| 微生物肥料 | 59.8 | 28 | 424.56 | 93.10 |
表3结果表明，CK处理组培养番茄40d后的株高和根长分别为11.4cm和14.5cm，施用商品菌肥组番茄的增长率分别211.40和96.55%，以解淀粉芽孢杆菌HNU1制成的微生物肥料的增长率分别为424.56和93.10%。说明解淀粉芽孢杆菌HNU1制成的微生物肥料对番茄生长具有显著的促进作用。
表4 微生物肥料促进小白菜生长对比结果
表4结果表明，CK处理组培养小白菜40d后的株高和地上部分干重分别为3.75cm和0.03g，以解淀粉芽孢杆菌HNU1制成的微生物肥料处理后增长率分别为328.27%和1200%。说明解淀粉芽孢杆菌HNU1制成的微生物肥料对小白菜生长具有显著的促进作用。
综上所述，与对照和普通化肥处理组相比较，施用本发明微生物肥料能够显著促进橡胶等林木的生长，说明本发明微生物肥料具有良好的肥效；与市面上的商品菌肥处理组相比较，本发明微生物肥料对橡胶等林木的促生长效果更显著，即使商品菌肥和鸡粪、草炭、椰糠和油棕叶混合使用，其促生效果也明显低于本申请。说明本发明微生物肥料具有更高的肥效，具有较高的应用价值。
将本发明实例所得微生物肥料施用到番茄和小白菜等瓜果蔬菜上，观察到本发明所述的微生物肥料对瓜果蔬菜同样具有良好的肥效作用，能显著促进其生长及提高其产量。说明本发明微生物肥料具有广泛的应用范围，具有较高的应用价值。另外，在实验过程中还发现，由于小白菜、番茄等农作物长势良好，其植株颜色更好，果实更加饱满，甜度等也均有不同程度的改善，商品品质明显提升。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种制备微生物肥料的菌株，其特征在于，为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）HNU1，保藏编号为CGMCC No. 17834，其16SrDNA序列为SEQ ID NO.1所示。
2.一种微生物肥料，包括以下质量份数的组分：鸡粪20-50份、草炭20-40份、椰糠20-40份、油棕叶片10-40份，权利要求1中所述的解淀粉芽孢杆菌HNU1发酵液 0.25-1.25份；所述的解淀粉芽孢杆菌HNU1菌株发酵液的菌株浓度大于1×108cfu/g。
3.如权利要求2的微生物肥料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将鸡粪、草炭、椰糠和油棕叶按配比混合均匀，加水搅拌均匀，再加入配方量的解淀粉芽孢杆菌HNU1菌株发酵液，发酵获得微生物肥料。
4.如权利要求3所述的微生物肥料的制备方法，其特征在于，所述的解淀粉芽孢杆菌HNU1菌株发酵液，其制备方法为：取解淀粉芽孢杆菌HNU1菌种原液，按培养基质量的0.1-1%的接种量接入LB液体培养基中进行活化培养18-24h；将活化菌液按培养基质量1-5%的接种量，接入LB液体培养基中进行扩大培养24-36h，获得发酵种子液；发酵种子液接种至LB液体培养基中进行液体发酵，得到解淀粉芽孢杆菌发酵液。
5.如权利要求4所述的微生物肥料的制备方法，其特征在于，所述的LB液体培养基中，以培养基的总体积计，各组分的质量浓度为：蔗糖1.0-3.0 g/L、酵母提取物1.0-4.0 g/L、蛋白胨1.0-6.0 g/L、MgSO4 1.0-5.0 g/L，液体发酵条件为：温度为20-50℃，转速为120-240rpm之间，pH 4.0-10.0，解淀粉芽孢杆菌HNU1发酵液接种量为LB液体培养基质量的0.1-2%。
6.如权利要求3所述的微生物肥料的制备方法，其特征在于，水的加入量为物料总质量的60-70%，发酵温度为20-25℃，发酵时间为15-30天。
7.如权利要求2所述的微生物肥料或者权利要求3-6任一项所述的制备方法制得的微生物肥料在制备促进植物生长的肥料的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的植物为热带林木。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的植物为瓜果蔬菜。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于：上述应用中，微生物肥料的用量为每亩施8-10kg。
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