CN104099272A - 一株酚酸类化感物质降解菌及其菌剂的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株酚酸类化感物质降解菌及其菌剂的制备和应用；本发明涉及的BJS-1-3菌株，来源于泰安多年生杨树根际土壤，经人工富集、筛选及纯化得到；该菌株对苯甲酸具有较强的降解能力；能够分别利用阿魏酸、对羟基苯甲酸、香草醛、肉桂酸、根皮苷等酚酸类化感物质作为唯一碳源生长繁殖；能够在杨树、苹果、黄瓜根际稳定定殖。利用该菌株制备的菌剂可有效防治因酚酸类化感物质积累造成的杨树、苹果、黄瓜等植物的连作障碍；菌剂的制备工艺简单、发酵周期短、成本低，利于工业化生产。

Description

一株酚酸类化感物质降解菌及其菌剂的制备和应用

技术领域

本发明涉及一株酚酸类化感物质降解菌及其菌剂的制备和应用，属于农用微生物技术领域。

背景技术

某些植物可通过地上部淋溶、根系分泌和植株残茬腐解等途径，释放一些物质对同茬或下茬同种或同科植物生长产生抑制作用，这种现象称为自毒作用。产生自毒作用的物质有有机酸、直链醇、简单酚类、酚酸、单宁、醛类、萜类、氨基酸和生物碱等。研究证明，苯甲酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸、根皮苷等酚酸类化合物是杨树、黄瓜、苹果等植物主要的自毒物质。连作条件下，自毒物质的积累是造成连作障碍的主要原因之一。酚酸类化感物质主要通过以下方式维持自毒作用。

(1)影响细胞膜的功能，抑制植物对养分的吸收。酚酸类化感物质对细胞膜的破坏可能是化感物质所产生的自毒效应的起点。研究发现，苯甲酸和肉桂酸处理12h后能增加大豆根系离子的渗透量，诱导类脂的过氧化作用、抑制抗氧化酶系统的活性，从而破坏细胞膜的完整性而影响大豆对营养物质的吸收。

(2)影响各种酶的功能和活性。酚酸类化感物质可影响许多酶的活性，研究发现，对羟基苯甲酸和苯丙烯酸能够强烈抑制黄瓜根系脱氢酶、根系结合ATP酶、硝酸还原酶、超氧化物歧化酶的活性，且随处理浓度的增大抑制作用增强。酚类化合物如肉桂酸及其衍生物抑制ATP酶的水解作用，丹宁等可强烈抑制纤维素酶的活性，使纤维素、半纤维素的分解减慢，也可以使过氧化氢酶的活性降低。

(3)影响植物的光合、呼吸作用和根尖的生长。酚酸类化感物质对呼吸作用的影响主要是抑制线粒体的电子传递和氧化磷酸化，而对光合作用的影响主要表现为使叶绿素含量和光合速率降低。据报道，苯丙烯酸浓度在80μmol·L^-1时，显著降低了黄瓜幼苗的叶面积、叶绿素a含量、光合速率、蒸腾速率、根系活力，叶绿体和线粒体超微结构也受到破坏，浓度达到150μmol·L^-1时，显著减少了全株干重和气孔总数，细胞器出现解体现象。另外，研究表明，茄子的自毒物质2，6-二叔基苯酚和邻苯二甲酸二甲酯使叶绿素含量、光合速率、气孔导度下降，并且对叶片的光合机构造成了伤害。

微生物可以影响自毒物质的数量和种类，对缓解自毒作用起到重要作用。一方面，某些微生物能够利用苯甲酸等酚酸类自毒物质作为唯一碳源，减弱或消除自毒作用。另一方面，某些有益微生物能够抑制土壤中病原菌的数量或干扰病原菌对寄主植物的侵染，改善植株根际的土壤生态环境，从而间接缓解自毒作用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一株酚酸类化感物质降解菌及其菌剂的制备和应用，能够降解酚酸类化感物质的细菌，可用于防治杨树、苹果、黄瓜等植物的连作障碍。

一株保藏编号为CGMCC No.6635的蜡状芽孢杆菌BJS-1-3(Bacillus cereus BJS-1-3)，已于2012年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；其16S rDNA核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

该菌株对苯甲酸具有较强的降解能力；能够分别利用阿魏酸、对羟基苯甲酸、香草醛、肉桂酸或根皮苷作为唯一碳源生长繁殖；能够在杨树、苹果、黄瓜根际稳定定殖。

利用上述蜡状芽孢杆菌BJS-1-3生产的微生物菌剂，其活性成分为蜡状芽孢杆菌BJS-1-3芽孢，所述的微生物菌剂为液体菌剂或固体粉剂。

一种蜡状芽孢杆菌BJS-1-3微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)菌种活化：将低温保存的蜡状芽孢杆菌BJS-1-3菌株接种于LB固体培养基平板上，在32℃下培养24-36h；挑取单菌落转接于LB斜面培养基上，在32℃下培养16-24h，用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液。

(2)一级种子液制备：按照0.1％-0.5％(体积百分比)的接种量向LB液体培养基接入步骤(1)制备的接种液，转速200r/m，温度32℃，摇瓶培养12-16h，作为一级种子液。

(3)二级种子液制备：按照5％-10％(体积百分比)的接种量向LB液体培养基中接入步骤2)制备的一级种子液，转速180r/m，温度32℃，摇瓶培养6-12h，作为二级种子液。

(4)发酵培养：将步骤3)所得二级种子液按照1％-2％(体积百分比)的接种量接入发酵培养基中进行发酵，培养温度为28-32℃，通气量为1:0.5-1:1.5，搅拌速度为200-300r/m，培养时间为20-24h，得到BJS-1-3菌株的液体菌剂。

所述发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖1％，玉米粉5％，脱脂豆粉4％，玉米浆3％，NaCl6％，MnSO₄0.2％，余者为水；

所述的通气量为每分钟通入发酵罐的空气体积与发酵罐中发酵液体积的比值。

本发明还提供了利用蜡状芽孢杆菌BJS-1-3生产的微生物菌剂在防治杨树、苹果、黄瓜等植物连作障碍中的应用。

上述蜡状芽孢杆菌BJS-1-3菌剂可应用于防治因酚酸类化感物质积累造成的杨树、苹果、黄瓜等植物的连作障碍。

本发明的优点

1、蜡状芽孢杆菌BJS-1-3能够在较高浓度酚酸类物质的条件下正常生长，能够在杨树、苹果、黄瓜等植物根际稳定定殖并发挥高效降解作用。

2、该菌株具有底物多样性，能够利用阿魏酸、对羟基苯甲酸、香草醛、肉桂酸、根皮苷等多种酚酸类化合物作为唯一碳源。

3、利用该菌株发酵生产微生物菌剂，成本低廉，发酵周期短，利于工业化生产。

附图说明

图1为根据16S rDNA序列利用Mega4.0分析获得的BJS-1-3菌株的系统进化树。

由图1可以看出，BJS-1-3菌株与芽胞杆菌属的遗传进化距离最近，与已知菌株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus,JN411277)的16S rRNA的同源性达到99％，结合其菌体形态和菌落特征观察结果及生理生化指标的测定结果，将其鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。

图2为苯甲酸含量测定标准曲线。

决定系数R²＝0.9997，符合测定要求；P﹤0.0001，表明模型极显著；得到的线性回归方程为y＝0.0696x-0.0414。

具体实施方式：

实施例一

1、酚酸类化感物质降解菌BJS-1-3的分离

苯甲酸降解菌的驯化：采集连作多年的杨树根际土壤，取5g，加入到装有45ml富集培养基的三角瓶中，30℃、150r/m摇瓶培养，3d为一个驯化周期，共4个周期，每个周期期满将培养液以10％(体积百分比)的接种量接到富集培养基中30℃、150r/m摇瓶培养继续培养。富集培养基中苯甲酸的浓度根据驯化周期依次增加，4个周期苯甲酸的初始浓度分别为500mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2500mg/L。

以苯甲酸为唯一碳源的降解菌的分离：在含2500mg/L苯甲酸的富集培养基中驯化完成后，按所述苯甲酸降解菌的驯化方法，再接种到含苯甲酸的无机盐培养基(MM)中培养3个周期，3个周期苯甲酸的初始浓度分别为1000mg/L、1500mg/L、2500mg/L。选择苯甲酸初始浓度2500mg/L的处理中浑浊度较高者划线得单菌落，获得一株酚酸类化感物质降解菌BJS-1-3。

富集培养基的组成为：蛋白胨10.0g、NaCl1.0g、KH₂PO₄1.0g和水1000ml，pH值7.0-7.2。

无机盐培养基(MM)的组成为：NH₄NO₃1.0g、MgSO₄·7H₂O0.5g、(NH₄)₂SO₄0.5g、NaCl0.5g、K₂HPO₄1.5g和水1000ml，pH值7.0。

酚酸类化感物质降解菌BJS-1-3的保存方法：短期保存采用LB固体培养基平板保存，长期保存采用甘油管保存。

2、BJS-1-3菌株的鉴定

(1)菌体形态特征

BJS-1-3菌株在LB培养基上生长12h后菌落呈乳白色，圆形，边缘整齐，光滑湿润。显微镜下观察该菌体的形态为杆状。

(2)生理生化特征

BJS-1-3菌株的生理生化特征见表1。

表1 BJS-1-3菌株的生理生化特征

注:+：阳性反应；－：阴性反应

(3)16S rDNA序列分析

BJS-1-3菌株的16S rDNA序列长度为1450bp，具体序列如下：

将此序列与GenBank数据库中序列进行Blast分析比对，发现与其同源性较高的菌株均属于芽孢杆菌属，选取9株与BJS-1-3菌株序列相似性高的菌株进行系统发育分析，利用Mega4.0软件，采取Neighbor-Joining法构建以16S rDNA全序列为基础的系统进化树(见图1)。BJS-1-3菌株的16S rDNA序列同公开发表的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus,JN411277)的16S rRNA的同源性达到98％，结合其形态和生理生化特征指标，将其鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。

实施例二

苯甲酸标准曲线制作：将浓度为1mg/ml的苯甲酸标液配制成浓度为0.1mg/ml的苯甲酸标准使用液。分别取苯甲酸标准使用液0.00ml、1.00ml、2.00ml、4.00ml和6.00ml于100ml容量瓶中，加水定容至100ml，摇匀。以空白作参比，用石英比色皿于230nm处，测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，以苯甲酸的浓度为横坐标制作标准曲线(图2)。

苯甲酸降解能力测定：用接种环挑取2环平板培养的BJS-1-3菌种，接种到含1000mg/L苯甲酸的无机盐培养基(MM)中，30℃、200r/min摇床培养24h，作为种子液。再将种子液以2％(体积百分比)的接种量接种到含1000mg/L苯甲酸的MM培养基中，30℃、200r/min摇床培养48h。将含苯甲酸的培养基稀释适当倍数进行吸光度的测定，使其吸光度处于0.2～0.8之间，根据上述苯甲酸标准曲线(图2)计算苯甲酸的浓度。经测定，BJS-1-3菌株对苯甲酸的降解率为80.23％。

本实施例说明分离得到的蜡状芽孢杆菌BJS-1-3菌株可以利用苯甲酸为唯一碳源进行生长繁殖，并具有较高的降解苯甲酸的能力。

实施例三

用接种环挑取2环平板培养的BJS-1-3菌种，接种到含1000mg/L苯甲酸的无机盐培养基(MM)中，30℃、200r/min摇床培养24h，作为种子液。再分别将种子液以2％(体积百分比)的接种量接种到分别含1000mg/L的阿魏酸、对羟基苯甲酸、香草醛、水杨酸、肉桂酸、根皮苷的六种无机盐培养基中，30℃，200r/min摇床培养，在2d-7d期间观察培养液是否变浑浊，变浑浊就说明能利用上述碳源；反之，则不能。结果发现BJS-1-3菌株能够利用上述除水杨酸之外的另五种酚酸类物质。说明BJS-1-3菌株具有底物多样性，能够分别利用阿魏酸、对羟基苯甲酸、香草醛、肉桂酸、根皮苷作为唯一碳源生长繁殖。

实施例四

BJS-1-3菌株在杨树、苹果、黄瓜根际的定殖能力的测定。

1、BJS-1-3菌株的双抗生素筛选及稳定性检测

将BJS-1-3菌株接种到不含利福平的LB液体培养基中，30℃，200r/min培养24h，作为种子液。将种子液以4％(体积百分比)的接种量接种到含5μg/mL利福平(Rif)的LB液体培养基中，摇瓶培养24h，再将该培养液以4％(体积百分比)的接种量接种到含10μg/mL利福平的LB液体培养基中，摇床培养24h，依次类推，使利福平的浓度逐渐由10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL…..直至增加到300μg/mL，最后将得到的抗性菌株接种到含利福平300μg/mL的LB固体培养基平板上。再对利福平抗性菌株进行壮观霉素抗性的筛选，方法同上，以筛选双抗菌株。

将筛选的双抗菌株在不含利福平和壮观霉素的LB固体培养基和LB液体培养基中交替培养3～5代，再分别回接到含利福平300μg/mL和壮观霉素300μg/mL的LB液体培养基中进行检测，以证实耐药性的稳定性，当耐药性稳定遗传后，即得到双抗生素标记菌株。

2、灌根及回收试验

将双抗生素标记菌株接种到LB液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养18～20h，作为接种液。将接种液以2％(体积百分比)的接种量接种到同时含有利福平300μg/mL和壮观霉素300μg/mL的LB液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养18～20h；再将该培养液以2％(体积百分比)的接种量接种到LB液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养18～20h，即得到BJS-1-3双抗生素标记菌株菌液。

将杨树、苹果、黄瓜根部的表土去除，将培养好的BJS-1-3双抗生素标记菌株菌液分别接种到杨树、苹果和黄瓜根际，每株20ml菌液。然后将表土重新覆盖好。

接种菌液后的第5、10、20和30d取杨树、苹果和黄瓜根际土样，检测双抗生素标记菌株的定殖情况。称取10g根际土，加到装有90mL无菌水的三角瓶中，常温振荡30min，使土壤颗粒及微生物充分分散。用移液器吸取500μL土壤悬液，加到4.5mL无菌水中，振荡混匀，制得10^-2土壤稀释液，再从10^-2土壤稀释液中吸取500μL加到4.5mL无菌水中，充分混匀得10^-3土壤稀释液，以此类推，制备10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9等一系列梯度的土壤稀释液，涂布在同时含有壮观霉素300μg/mL和利福平300μg/mL的LB固体平板上。平板置于30℃恒温培养箱培养24～36h，进行菌落计数。

杨树、苹果和黄瓜根际土含水率测定。各根际土样置于100℃烘箱中烘干，称量土壤干重，计算其含水率。

根据各根际土样的含水率及菌落计数情况，计算各根际土样中BJS-1-3双抗生素标记菌株的数量〔菌落数/cfu·g-1(干土)〕。

3、BJS-1-3菌株在杨树、苹果、黄瓜根际的定殖试验结果

BJS-1-3双抗生素标记菌株在杨树、苹果、黄瓜根际的定殖结果见表2。从表2可以看出BJS-1-3菌株可以在杨树、苹果、黄瓜根际稳定定殖。

表2BJS-1-3菌株在杨树、苹果、黄瓜根际的定殖结果

实施例五

选取葡萄糖、玉米粉、脱脂豆粉、玉米浆、Nacl、Mnso₄为BJS-1-3菌株芽孢发酵的培养基组成成分，进行正交试验设计，试验因素与水平的设置见表3，各培养基的配方见表4，对BJS-1-3菌株的产芽孢最佳发酵培养基进行优化。

表3 因素与水平的设置

表4 正交优化试验设计

用接种环挑取BJS-1-3菌株菌落，接种到含50ml LB培养基的250ml三角瓶中，30℃，200r/m培养12h后得BJS-1-3菌株种子液，然后将种子液均以2％(体积百分比)的接种量分别接种到表4所列的18种培养基中，30℃，200r/m摇瓶培养24h。对发酵液进行80℃，15min处理后，进行系列梯度稀释，即吸取1ml处理后的发酵液加入9ml的无菌水中，为10^-1梯度，混匀后吸取1ml10^-1梯度中的液体加入9ml无菌水中，为10^-2梯度，依次稀释获得10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7梯度发酵液稀释液，然后选择10^-5、10^-6、10^-7梯度发酵液稀释液，分别进行涂布平板，30℃条件下培养1-2d，进行计数，计算发酵液中的芽孢数。结果发现，发酵培养基配方为(即处理11)：葡萄糖1g，玉米粉5g，脱脂豆粉4g，玉米浆3g，NaCl6g，MnSO₄0.2g，水1000mL时芽孢数量最多，该培养基即为BJS-1-3菌株的产芽孢最佳发酵培养基。

实施例六

蜡状芽孢杆菌BJS-1-3菌剂的制备：

(1)菌种活化：将低温保存的蜡状芽孢杆菌BJS-1-3菌株接种于LB固体培养基平板上，在32℃下培养24-36h；挑取单菌落转接于LB斜面培养基上，在32℃下培养16-24h，用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液。

(2)一级种子液制备：按照0.5％(体积百分比)的接种量向装有LB液体培养基的三角瓶中接入步骤1)制备的接种液，装液量50mL/250mL，转速200r/m，温度32℃，摇瓶培养12-16h，作为一级种子液。

(3)二级种子液制备：按照5％(体积百分比)的接种量向装有LB液体培养基的三角瓶中接入步骤(2)制备的一级种子液，装液量500mL/3000mL，转速180r/m，温度32℃，摇瓶培养6-12h，作为二级种子液。

(4)发酵培养：发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖1％，玉米粉5％，脱脂豆粉4％，玉米浆3％，NaCl6％，MnSO₄0.2％，余者为水。将步骤(3)所得二级种子液按照2％(体积百分比)的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，培养温度为28-32℃，通气量为1:0.5-1:1.5，搅拌速度为200-300r/m，培养时间为20-24h，得到BJS-1-3菌株的液体菌剂。

实施例七

蜡状芽孢杆菌BJS-1-3菌剂对酚酸类化感物质的降解作用盆栽试验：取花盆100个，各装入8Kg土，栽植经生根处理的杨树扦插苗，每盆1棵，栽植时，以二代连作杨树林地中各酚酸类物质含量为1X，根据盆中土的重量确定加入酚酸类混合物(阿魏酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸、香草醛)的量，使酚酸类混合物的浓度分别为0X(空白)、0.5X、1X、1.5X和2X(表5)，每个浓度各20盆。

5个处理各取10盆，将蜡状芽孢杆菌BJS-1-3菌剂溶入适量水后加入各花盆，菌剂的施用量为20mL/盆。以施加灭活的BJS-1-3菌剂为对照。60d后测定新梢的生长长度，结果见表6。表中数据经SAS9.0数据分析中的ANOVA分析，发现施用灭活菌剂的各处理之间存在显著差异，说明外源的酚酸类物质能够显著地影响杨树的生长，导致杨树苗生长缓慢；施用菌剂和施用灭活菌剂的处理之间，也存在显著差异，说明BJS-1-3菌剂可有效降解酚酸类化感物质，解除了其对杨树苗的危害。

表5各处理中酚酸类物质的含量

表6各处理新梢生长长度

田间试验：

选择连作3代杨树人工林，2012年12月伐掉8年生大树，2013年3月整平土地，去除树桩树根，栽植一年生杨树苗，共10行(南北向)，每行30株，株距：3米，行距：4米。其中的5行，施加BJS-1-3菌剂，每株50mL，菌剂的施加结合浇水进行，即每棵树将50mL BJS-1-3菌剂溶入8升水浇入。另5行以同样方法施加灭活的BJS-1-3菌剂为对照。当年10月份调查杨树胸径(见表7)。从表中可以看出，施加菌剂的杨树平均胸径为47.46mm，施加灭活菌剂(对照)的杨树平均胸径为35.34mm，施用菌剂组杨树平均胸径比对照组增加4.68％，表中数据经SAS9.0数据分析中的ANOVA分析，发现施用菌剂组与对照组存在显著差异。说明，BJS-1-3菌剂可有效防治杨树连作障碍。

表7BJS-1-3菌剂田间试验结果

处理	平均胸径mm
		施加菌剂	47.46
施加灭活菌剂	45.34

Claims (3)

1.一株保藏编号为CGMCC No.6635的蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus BJS-1-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.使用如权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌BJS-1-3制备的蜡状芽孢杆菌BJS-1-3微生物菌剂，其特征在于其制备方法如下：

(1)菌种活化：将低温保存的蜡状芽孢杆菌BJS-1-3菌株接种于LB固体培养基平板上，在32℃下培养24-36h；挑取单菌落转接于LB斜面培养基上，在32℃下培养16-24h，用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液；

(2)一级种子液制备：按照体积百分比0.1％-0.5％的接种量向LB液体培养基接入步骤1)制备的接种液，转速200r/m，温度32℃，摇瓶培养12-16h，作为一级种子液；

(3)二级种子液制备：按照体积百分比5％-10％的接种量向LB液体培养基中接入步骤2)制备的一级种子液，转速180r/m，温度32℃，摇瓶培养6-12h，作为二级种子液；

(4)发酵培养：将步骤3)所得二级种子液按照体积百分比1％-2％的接种量接入发酵培养基中进行发酵，培养温度为28-32℃，通气量为1:0.5-1:1.5，搅拌速度为200-300r/m，培养时间为20-24h，得到BJS-1-3菌株的液体菌剂；

所述发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖1％，玉米粉5％，脱脂豆粉4％，玉米浆3％，NaCl6％，MnSO₄0.2％，余者为水；

所述的通气量为每分钟通入发酵罐的空气体积与发酵罐中发酵液体积的比值。

3.如权利要求2所述的状芽孢杆菌BJS-1-3微生物菌剂在防治杨树、苹果和黄瓜植物连作障碍中的应用。