CN105062937A - 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用。该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus？amyloliquefaciens)ZTS-06，保藏编号为CGMCC？No.11165。本发明还公开了一种含有上述菌株的活菌制剂及制备方法。它是将解淀粉芽孢杆菌ZTS-06经扩大培养后，接种于发酵培养基于培养，得到发酵液后加入没食子酸丙酯、β-环糊精与可溶性淀粉，再经喷雾干燥获得活菌原粉；再加入大量的可溶性淀粉混匀，即得活菌制剂。该菌株对苯烯丙酸、对羟基苯甲酸、和肉桂酸等均有较好的降解效果，可缓解酚酸类自毒物质引起的连作障碍。该菌剂发酵周期短，发酵液菌浓高，喷雾干燥过程中活菌损失少，活菌制剂在保存过程中的稳定性高。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于农业生物技术领域。

背景技术

黄瓜(CucumissativusLinn)也称胡瓜、青瓜，为葫芦科(Cucurbitaceae)黄瓜属(Cucumis)植物，是广泛栽培的蔬菜之一。连作障碍是影响黄瓜产量与品质主要制约因素之一，且随着连续种植年限的增加，连作障碍问题日益严重。引起连作障碍的原因复杂，主要包括：土壤板结与次生盐渍化、土壤养分分布不均衡、土壤微生态系统劣化、土传病虫害加重、植物自毒作用等。其中，植物自毒作用作为引发连作障碍的主要因素之一越来越受到关注。

所谓自毒作用是由植物产生的、可对同种或同科植物具有毒害作用的化学物质。这些化学物质可通过植物体的地上部淋溶、根系分泌物和植物残茬等途径释放到环境中，进而影响下茬作物的生长。酚酸类物质是黄瓜产生的主要自毒物质，包括苯丙烯酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸等，对黄瓜生长具有显著的抑制作用，可引起连作障碍。酚酸类物质引起连作障碍的作用机理包括影响植物的膜系统、酶活性与光合作用，影响土壤微生物区系的组成与数量、影响土壤酶活力和理化性质等。

土壤中酚酸类物质分解的主要途径是生物降解，其中微生物是引发生物降解作用的主要生物类群。从土壤中筛选对酚酸类物质降解作用强的微生物，制成活菌制剂，用于降解土壤中的酚酸类自毒物质，以减轻连作障碍，是一种很有前途的生物防治措施。据报道，很多微生物均具有降解酚酸类物质的能力，包括黄孢原毛平革菌、粘质沙雷菌、生脂固氮螺菌等20多个属，但罕有解淀粉芽孢杆菌降解酚酸类物质的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株自黄瓜根际土壤分离的微生物——解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZTS-06及其应用。本发明的解淀粉芽孢杆菌ZTS-06菌株能同时降解多种酚酸类自毒物质，如苯丙烯酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸等。

本发明所提供的菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZTS-06，它是从山东省泰安市岱岳区良庄镇的黄瓜根际土壤分离得到的，该菌株已于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.11165。经试验证明：该菌株对苯烯丙酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸等植物自毒物质具有很好的降解效果。

本发明解淀粉芽孢杆菌ZTS-06菌株的菌落及菌体特征：在NA培养基上于35℃培养48h后，菌落呈圆形，白色至灰白色，表面湿润，平坦，不透明。菌体呈杆状，产芽孢，芽孢圆形，不膨大，无伴孢晶体，革兰氏染色阳性。

本发明解淀粉芽孢杆菌ZTS-06菌株的生理生化特征：甲基红试验阳性、吲哚试验阳性、v-p试验阳性、淀粉水解试验阳性、酪素水解实验阳性、明胶液化试验阳性、D-葡萄糖实验阳性、L-阿拉伯糖试验阳性、D-木糖试验阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、氧化酶试验阳性、接触酶试验阳性、运动性试验阳性、厌氧生长实验阴性。

本发明的另一个目的是提供一种含有解淀粉芽孢杆菌ZTS-06菌株的活菌制剂及其制备方法。

上述活菌制剂的制备方法，其特征是，将解淀粉芽孢杆菌ZTS-06菌株经扩大培养后，接种于发酵培养基培养24-28h，得到发酵液然后加入没食子酸丙酯、β-环糊精与可溶性淀粉，再经喷雾干燥获得活菌原粉；再加入5～10倍质量的可溶性淀粉混匀，即得活菌制剂。具体包括以下步骤：

1)制备一级种子：将所述解淀粉芽孢杆菌ZTS-06菌株接种于NB培养基中，35℃培养20-24h，即为一级种子；

2)制备二级种子：将一级种子以2-5％(质量比)的接种量转接入NB培养基中，于35℃培养20-24h，即为二级种子；

3)发酵培养：将二级种子以2-5％(质量比)的接种量转接入发酵培养基中，35℃培养24-28h，即为解淀粉芽孢杆菌ZTS-06的发酵液。发酵液中解淀粉芽孢杆菌ZTS-06的活菌数为(4～6)×10¹⁰cfu/ml，芽孢生成率为90％～95％。

4)向步骤3)的发酵液中加入没食子酸丙酯(PG)0.008-0.012％(w/w)、β-环糊精0.8-1.2％(w/w)、可溶性淀粉4-6％(w/w)，搅拌均匀，然后进行喷雾干燥，获得活菌制剂原粉。

5)解淀粉芽孢杆菌ZTS-06活菌制剂原粉与可溶性淀粉按1：(5～10)的质量比混匀，即为解淀粉芽孢杆菌ZTS-06活菌制剂，其活菌含量为(1.0～2.0)×10¹⁰cfu/g。

其中，步骤3)所述发酵培养基的配方为：棉粕粉20g、玉米浆30g、乳清粉10g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁1.5g、硫酸锰0.1g、邻苯二甲酸800mg、复合酶制剂3g、蒸馏水1000mL，初始pH8.5。所述复合酶制剂的组成为(按质量比计)：碱性蛋白酶50％、中性蛋白酶20％、纤维素酶20％和木聚糖酶10％。上述发酵培养基的制备方法为：按照配方称取原料，溶于水中，加热至50-55℃，保温1-2h，然后升温至121℃，保温15min进行灭菌。

解淀粉芽孢杆菌ZTS-06活菌制剂的使用方法：解淀粉芽孢杆菌ZTS-06活菌制剂加水稀释10～20倍，移苗时蘸根或浇水时随水冲施。

本发明的有益效果：本发明解淀粉芽孢杆菌ZTS-06能够同时降解苯丙烯酸、对羟基苯甲酸和肉桂酸等植物自毒物质，培养7d后，对苯烯丙酸、对羟基苯甲酸和肉桂酸的降解率分别为84％、72％、91％。这表明解淀粉芽孢杆菌ZTS-06对苯丙烯酸、对羟基苯甲酸、肉桂酸等植物自毒物质具有很好的降解效果。由于解淀粉芽孢杆菌ZTS-06是从黄瓜根际土壤中筛选出来的，所以该菌株更适合在黄瓜根际土壤中生长，其活菌制剂用于降解黄瓜产生的自毒物质与减轻黄瓜的连作障碍更具针对性，颇具应用价值。

本发明解淀粉芽孢杆菌ZTS-06活菌制剂的生产方法科学，发酵液活菌数高，生产成本低。发酵培养基中添加复合酶制剂，灭菌时在升温过程中对棉粕与玉米浆等原料进行水解，可缩短延迟期，提高原料利用率，提高发酵液中的活菌浓度与芽孢生成率。喷雾干燥时加入抗氧化剂没食子酸丙酯与包埋剂环糊精，可以减少喷雾干燥过程中活菌数量的损失，并可提高活菌制剂在保存过程中的稳定性。

附图说明

图1为基于16SrDNA部分序列构建的系统发育树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：解淀粉芽孢杆菌ZTS-06的筛选

解淀粉芽孢杆菌ZTS-06分离自黄瓜根际土壤。土壤取样于山东省泰安市岱岳区良庄镇，为连续种植黄瓜3年以上的保护地土壤。具体分离方法为：土样混匀，称取5g，放入盛有100mL富集培养基和10粒玻璃珠的三角瓶中，于35℃、180rpm振荡培养3d。取富集培养物1mL进行10^-1～10^-5系列浓度梯度稀释，然后取10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度涂布至含选择培养基的平板上，于35℃倒置培养3d。分别挑取单菌落划线至含选择培养基的平板上，于35℃倒置培养3d。挑取单菌落转接至保藏培养基试管斜面上，于35℃培养3d，长满菌苔后，置于4℃冰箱中保存备用。共分离出10株菌落特征与菌体形态存在差异的分离物，依次标记为ZTS-01～ZTS-10。

所述富集培养基的配方为：邻苯二甲酸800mg、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.1g、氯化钾0.2g、氯化钠0.5g、磷酸氢二钾1.5g、蒸馏水1000mL，pH7.0。所述选择性培养基的配方为：邻苯二甲酸1000mg、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.1g、氯化钾0.2g、氯化钠0.5g、磷酸氢二钾1.5g、蒸馏水1000mL、琼脂20g，pH7.0。所述保藏培养基的配方为：对羟基苯甲酸1000mg、牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂20g、水1000ml，pH7.0。

将10株分离物分别转接入添加1000mg/L对羟基苯甲酸、1000mg/L苯丙烯酸或1000mg/L肉桂酸的基础培养基中，于35℃、180rpm振荡培养3d后，采用高效液相色谱法测定苯烯丙酸、对羟基苯甲酸与肉桂酸的降解率，筛选出1株对三种自毒物质均具有较好降解效果的分离物，即ZTS-06。所述基础培养基的配方为：蛋白胨5g、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.1g、氯化钾0.2g、氯化钠0.5g、水1000ml，pH7.0。

高效液相色谱法测定苯烯丙酸、对羟基苯甲酸与肉桂酸降解率时采用的条件为：以乙腈和水(用乙酸调节pH2.8)为流动相，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长280nm。采用梯度洗脱，0-30min，乙腈从5％提高到40％，30-40min，乙腈保持40％，40-45min，乙腈从40％下降到5％。

实施例2解淀粉芽孢杆菌ZTS-06的鉴定

(1)形态与生理生化特特征

ZTS-06菌株的形态特征为：在NA培养基上于35℃培养48h后，菌落呈圆形，白色至灰白色，表面湿润，平坦，不透明。菌体呈杆状，产芽孢，芽孢圆形，不膨大，无伴孢晶体，革兰氏染色阳性。所述NA培养基的配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂20g、水1000ml、pH7.0。

ZTS-06菌株的生理生化特征为：甲基红试验阳性、吲哚试验阳性、v-p试验阳性、淀粉水解试验阳性、酪素水解试验阳性、明胶液化试验阳性、D-葡萄糖试验阳性、L-阿拉伯糖试验阳性、D-木糖试验阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、氧化酶试验阳性、接触酶试验阳性、运动性试验阳性、厌氧生长试验阴性。

(2)16SrDNA序列分析

将ZTS-06菌株接种到NB培养基中，于35℃，180r/min摇床培养24h。收集菌体，提取总DNA，然后以其为模板，在原核生物16SrRNA基因的通用引物27F和1492R的引导下进行16SrDNA基因的PCR扩增。扩增条件为：95℃预变性3min，94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1.5min，共30个循环，72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用胶回收试剂盒回收，交由上海生工生物技术有限公司测序，所得序列如序列表SEQNo.1所示。将所测16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，并用MEGA4.0软件进行多序列同源性分析，并构建系统发育树，如图1所示。

通过形态、生理生化特征和16SrDNA序列分析可知，该菌株为解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZTS-06。该菌株已于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11165。

实施例3解淀粉芽孢杆菌ZTS-06对苯烯丙酸、对羟基苯甲酸与肉桂酸的降解试验

制备含苯丙烯酸的培养基，其配方为：苯丙烯酸1000mg、蛋白胨5g、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.1g、氯化钾0.2g、氯化钠0.5g、水1000ml，pH7.0。

制备含对羟基苯甲酸的培养基，其配方为：对羟基苯甲酸1000mg、蛋白胨5g、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.1g、氯化钾0.2g、氯化钠0.5g、水1000ml，pH7.0。

制备含肉桂酸的培养基，其配方为：肉桂酸1000mg、蛋白胨5g、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.1g、氯化钾0.2g、氯化钠0.5g、水1000ml，pH7.0。

将解淀粉芽孢杆菌ZTS-06转接入上述三种培养基中，于35℃、180rpm振荡培养7d。取培养液10mL，3500r/min离心15min，弃沉淀，上清液采用10mL二氯甲烷萃取。萃取相采用真空旋转蒸发仪蒸干，残留物用1mL甲醇溶解，备用。

采用高效液相色谱法检测样品中苯烯丙酸、对羟基苯甲酸与肉桂酸的残留量，并计算降解率。参数条件为：以乙腈和水(用乙酸调节pH2.8)为流动相，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长280nm。采用梯度洗脱，0-30min，乙腈从5％提高到40％，30-40min，乙腈保持40％，40-45min，乙腈从40％下降到5％。

高效液相色谱法检测结果表明，解淀粉芽孢杆菌ZTS-06培养7天，对自毒物质苯烯丙酸、对羟基苯甲酸与肉桂酸的降解率分别为84％、72％和91％。

实施例4解淀粉芽孢杆菌ZTS-06菌剂的制备

NA培养基的配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂20g、水1000ml，pH7.0。

NB培养基配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、水1000ml，pH7.0。

发酵培养基的配方为：棉粕粉20g、玉米浆30g、乳清粉10g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁1.5g、硫酸锰0.1g、邻苯二甲酸800mg、复合酶制剂3g、蒸馏水1000mL，初始pH8.5。所述复合酶制剂的组成为碱性蛋白酶50％、中性蛋白酶20％、纤维素酶20％、木聚糖酶10％。制备方法为：按照配方称取原料，溶于水中，加热至50-55℃，保温2h，然后升温至121℃，保温15min进行灭菌。其中，中性蛋白酶与碱性蛋白酶由泰安信得利生物科技有限公司生产，执行国家标准GB/T23527-2009《蛋白酶制剂》，产品规格分别为10万U/g与20万U/g。纤维素酶与木聚糖酶由山东隆大生物科技有限公司生产，纤维素酶执行中华人民共和国轻工行业标准QB2583-2003《纤维素酶制剂》，产品规格分别为10万U/g，木聚糖酶执行中华人民共和国轻工行业标准QB/T4483-2013《木聚糖酶制剂》，产品规格为5万U/g。

制备方法，包括以下步骤：

1)菌种活化：将解淀粉芽孢杆菌ZTS-06转接入NA培养基试管斜面，于35℃培养24h进行活化；

2)三角瓶种子制备：用接种环刮取活化后的解淀粉芽孢杆菌ZTS-06菌苔，接种于NB培养基中，35℃培养24h；

3)种子罐菌种制备：将三角瓶种子以2％(质量比)的接种量转接入装有6LNB培养基的10L种子罐中，于35℃培养20h，全程搅拌转速200rpm，0-6h通风量为3L/min，6-20h通风量为6L/min；

4)发酵培养：将种子罐菌种以2％(质量比)的接种量转接入500L的发酵罐。发酵罐内装发酵培养基中300L，35℃培养28h，即为解淀粉芽孢杆菌ZTS-06的发酵液。全程搅拌转速为180rpm，0-6h通风量为200L/min，6-28h通风量为300L/min。发酵结束后，发酵液中解淀粉芽孢杆菌ZTS-06的活菌数为(4～6)×10¹⁰cfu/ml，芽孢生成率为90％～95％。

5)发酵结束后，向发酵液中加入没食子酸丙酯(PG)0.01％(w/w)、β-环糊精1％(w/w)、可溶性淀粉5％(w/w)，搅拌均匀，然后于进口温度200℃，出口温度80℃的条件下进行喷雾干燥，获得活菌制剂原粉。

6)解淀粉芽孢杆菌ZTS-06活菌制剂原粉与可溶性淀粉按1：(5～10)的比例混匀，即为解淀粉芽孢杆菌ZTS-06活菌制剂，其活菌含量为(1.0～2.0)×10¹⁰cfu/g。

Claims (10)

1.解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株ZTS-06，所述菌株的保藏编号为CGMCCNo.11165。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株ZTS-06在降解酚酸类自毒物质方面的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征是，所述酚酸类自毒物质为苯丙烯酸、对羟基苯甲酸或肉桂酸。

4.一种含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌ZTS-06菌株的活菌制剂。

5.权利要求4所述活菌制剂的制备方法，其特征是，将解淀粉芽孢杆菌ZTS-06菌株经扩大培养后，接种于发酵培养基培养24-28h，得到发酵液然后加入没食子酸丙酯、β-环糊精与可溶性淀粉，再经喷雾干燥获得活菌原粉；再加入5～10倍质量的可溶性淀粉混匀，即得活菌制剂。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是，所述发酵培养基为：棉粕粉20g、玉米浆30g、乳清粉10g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁1.5g、硫酸锰0.1g、邻苯二甲酸800mg、复合酶制剂3g、蒸馏水1000mL，初始pH8.5；按质量比计，所述复合酶制剂为：碱性蛋白酶50％、中性蛋白酶20％、纤维素酶20％和木聚糖酶10％。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征是，所述发酵培养基的制备方法为：将各原料溶于水中，加热至50-55℃，保温1-2h，然后升温至121℃，保温15min进行灭菌。

8.如权利要求5-7中任意一项所述的制备方法，其特征是，将发酵液中加入没食子酸丙酯0.008-0.012％(w/w)、β-环糊精0.8-1.2％(w/w)、可溶性淀粉4-6％(w/w)，搅拌均匀，然后进行喷雾干燥，获得活菌制剂原粉。

9.如权利要求5-7中任意一项所述的制备方法，其特征是，具体包括以下步骤：

1)制备一级种子：将解淀粉芽孢杆菌ZTS-06菌株接种于NB培养基中，35℃培养20-24h，即为一级种子；

2)制备二级种子：将一级种子以质量比2-5％的接种量转接入NB培养基中，于35℃培养20-24h，即为二级种子；

3)发酵培养：将二级种子以质量比2-5％的接种量转接入发酵培养基中，35℃培养24-28h，即为解淀粉芽孢杆菌ZTS-06的发酵液；

4)向步骤3)的发酵液中加入没食子酸丙酯0.008-0.012％(w/w)、β-环糊精0.8-1.2％(w/w)、可溶性淀粉4-6％(w/w)，搅拌均匀，然后进行喷雾干燥，获得活菌制剂原粉；

5)解淀粉芽孢杆菌ZTS-06活菌制剂原粉与可溶性淀粉按1：(5～10)的质量比混匀，即为解淀粉芽孢杆菌ZTS-06活菌制剂。

10.权利要求4所述活菌制剂的使用方法，其特征是，活菌制剂加水稀释10～20倍，移苗时蘸根或浇水时随水冲施。