CN115181717B - 一种植物促生菌的液体发酵方法 - Google Patents

一种植物促生菌的液体发酵方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115181717B
CN115181717B CN202210840329.3A CN202210840329A CN115181717B CN 115181717 B CN115181717 B CN 115181717B CN 202210840329 A CN202210840329 A CN 202210840329A CN 115181717 B CN115181717 B CN 115181717B
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
bacillus
fermentation
plant growth
liquid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210840329.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115181717A (zh
Inventor
李平兰
谭春明
韩飞
穆文强
张世奇
康慎敏
尚楠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN202210840329.3A priority Critical patent/CN115181717B/zh
Publication of CN115181717A publication Critical patent/CN115181717A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115181717B publication Critical patent/CN115181717B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种植物促生菌的液体发酵方法。本发明植物促生菌的液体发酵方法，包括如下步骤：S1、在通气条件下，将发酵培养液灭菌后接入植物促生菌进行第一次培养；S2、在第一培养结束后的培养体系中接入蔬菜苗的根系分泌物提取液进行第二次培养；S3、在第二次培养结束后的培养体系中添加补料液，降低通气量进行第三次培养；S4、关闭通气，对第三次培养结束后的培养体系进行第四次培养，得到发酵液。本发明所制得的发酵液中活菌数可达到10^10CFU/mL，芽孢率80％以上，显著提高了菌剂产品质量和货架期。

Description

一种植物促生菌的液体发酵方法
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种植物促生菌的液体发酵方法。
背景技术
农作物的生长受到土壤肥力、土壤微生物、病虫害等外部环境因素的影响。土壤肥力是农作物赖以生存的物质基础，是作物获得高产的必备因素。然后，过量的使用氮、磷等肥料最终导致土壤中矿物质元素富集、重金属污染、土壤酸化和板结，作物能吸收利用的有效矿物质元素的比例下降，从而影响作物生长，也给生态环境质量带来负面影响。特别是迅速发展的大棚蔬菜，几乎没有雨水淋溶作用，使得磷的利用率进一步下降。另外，植物病原微生物是引起植物病害的主要因素，常造成组织病变或死亡。目前，常用的防治手段主要有物理防治、化学防治、生物防治和栽培防治等，其中，化学防治所起到的效果虽然显著，但容易污染环境、增强病原菌的抗逆性，严重危害人畜健康。
随着现代生物技术的迅速发展，具有生防能力的微生物肥料或菌剂成为一种理想的新型复合肥料。微生物肥料以生防菌为中心，使用天然基质进行混合，具有无毒、无害、环保、靶向性强等优点。然而，植物促生生物菌肥的大规模开发的前提是需要获得大量的植物促生菌。现有技术的植物促生菌发酵的产量较低，生产成本较高，并不能满足正常对植物促生菌使用的需求，而且要提高促生菌剂的保质期，需要让更多的促生菌处在芽孢状态。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物促生菌的液体发酵方法，该方法不仅生物获得量高，还大大提高了芽孢率，使促生菌剂保存期延长，而且成本更低。
本发明提供的一种植物促生菌的液体发酵方法，包括如下步骤：
S1、在通气条件下，将发酵培养液灭菌后接入植物促生菌进行第一次培养；
S2、在第一培养结束后的培养体系中接入蔬菜苗的根系分泌物提取液进行第二次培养；
S3、在第二次培养结束后的培养体系中添加补料液，降低通气量进行第三次培养；
S4、关闭通气，对第三次培养结束后的培养体系进行第四次培养，得到发酵液。
上述的方法中，所述植物促生菌可为芽孢杆菌；所述植物促生菌具体可为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis Z48，其保藏编号为CGMCC No.7749；
或，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Z48；
或，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)C812、甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Z48(菌落形成单位比为1：1：1)；
或，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)L-S60、甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloidquefaciens)L-H15(CGMCC No.10044)(菌落形成单位比为1：1：1)。
上述的方法中，所述发酵培养液可由下述组分组成：10～15g/L的玉米浆干粉、5～10g/L豆饼粉、3～5g/L豆粕提取物、7.5～12.5g/L糖蜜、1～3g/L柠檬酸、0.4～0.6g/L氯化钾、0.2～0.4g/L硫酸镁、0.025～0.05g/L氯化锰、0.2～0.4g/L氯化钙、0.05～0.1g/L有机硅消泡剂、调节pH至7.0～8.5的调节量的pH调节剂和余量的水；
优选地，所述植物促生芽孢杆菌发酵培养液由下述终浓度的组分组成：12.5g/L玉米浆干粉、7.5g/L豆饼粉、5g/L豆粕提取物、10g/L糖蜜、2g/L柠檬酸、0.5g/L氯化钾、0.25g/L硫酸镁、0.03g/L氯化锰、0.3g/L氯化钙、0.05g/L有机硅消泡剂、调节pH至8.0的调节量的pH调节剂和余量的水。
进一步地，所述有机硅消泡剂可为有机硅油。
所述pH调节剂可为NaOH固体颗粒或6M盐酸的水溶液。
上述的方法中，所述灭菌的温度可为121℃，时间可为20min；
所述植物促生菌以其种子液的形式接入，所述种子液的接入量可为所述发酵培养液体积的2％～10％，具体可为7％；
所述种子液的菌种浓度具体可为10^9CFU/mL。
进一步地，所述植物促生菌的种子液按照包括如下步骤的方法制备：将促生芽孢杆菌菌株活化后接种于LB种子培养基中，在34～38℃下培养12～18h，如在37℃下培养12h；
优选地，所述促生芽孢杆菌菌株的活化步骤如下：挑取保存至-80℃的菌种划线至LB固体培养基中，34～38℃静置培养2～3d，如在37℃下培养2d。
所述第一次培养的温度可为34～38℃(如37℃)，时间可为18～24h(如24h)，通气量可为0.12～0.18L/min(如0.15L/min)。
上述的方法中，所述蔬菜苗可为黄瓜、番茄或茄子；
制备所述根系分泌物提取液的方法，包括如下步骤：
1)取定植期蔬菜苗，对蔬菜苗的根系进行消毒；
2)将经所述消毒的蔬菜苗进行定植，用蔬菜苗培养液进行培育；
3)将经所述培育的培养液中的杂质和矿物质离子依次去除，然后再进行过滤除菌，得到所述根系分泌物提取液。
进一步地，所述消毒可为采用水培植物消毒液浸泡根系10～15min；
所述消毒的具体操作如下：用清水洗掉根系的土壤或栽培基质，然后对根系消毒，再用清水冲洗根系。
所述定植具体为定植到栽培容器上。
所述蔬菜苗培养液可由硝酸钾0.4～0.6g/L、磷酸二氢钾0.1～0.15g/L、硫酸镁0.3～0.4g/L、硝酸钙1～1.5g/L、硼酸钠0.01～0.015mg/L、EDTA铁钠0.2～0.3mg/L、硫酸锰0.03～0.05mg/L、硫酸铜0.06～0.1mg/L和硫酸锌0.01～0.02mg/L组成；
优选地，所述蔬菜小苗培养液由硝酸钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.12g/L、硫酸镁0.3g/L、硝酸钙1.2g/L、硼酸钠0.015mg/L、EDTA铁钠0.25mg/L、硫酸锰0.04mg/L、硫酸铜0.08mg/L和硫酸锌0.015mg/L组成。
所述培育的温度可为25～35℃(如30℃)，时间可为1～2周(如2周)；
在本发明实施例中，采用孔径为0.45μm的滤膜过滤去除所述培养液中的杂质；
在本发明实施例中，采用大孔吸附树脂去除所述培养液中的矿物质离子；
所述吸附树脂具体可为大孔吸附树，经吸附后用乙醇洗脱，便可除去蔬菜苗营养液中的矿物质离子；其中，每500mL蔬菜小苗培养液，用100～200mL(如125mL)乙醇洗脱，收集流出液，蒸发浓缩至5～10mL(如10mL)，等体积水复溶；
在本发明实施例中，所述过滤除菌为采用孔径为0.22μm的滤膜过滤。
上述的方法中，所述蔬菜苗的根系分泌物提取液的接入量可为第一培养结束后的发酵液体积的0.5％～1％，具体可为1％；
所述第二次培养的温度可为34～38℃(如37℃)，时间可为18～24h(如24h)，通气量可为0.12～0.18L/min(如0.15L/min)。
上述的方法中，以质量百分含量计，所述补料液可由20％～25％氢氧化钠、50％有机硅消泡剂和余量的水组成；在本发明实施例中，所述补料液由20wt％氢氧化钠、50wt％有机硅消泡剂和余量的水组成。
所述补料液的体积可为第二次培养结束后的发酵液的体积的15％～25％，具体可为20％；
所述第三次培养的温度可为34～38℃(如37℃)，时间可为12～24h(如18h)，通气量可为0.06～0.1L/min(如0.08L/min)。
上述的方法中，所述第四次培养的温度可为34～38℃(如37℃)，时间可为1～2h(如2h)。
本发明进一步提供了上述任一项所述的植物促生菌的液体发酵方法获得的植物促生菌发酵液。
本发明还提供了所述的植物促生菌的发酵液在制备植物促生菌菌剂中的应用。
一种植物促生菌菌剂，其由所述的植物促生菌发酵液制成，也在本发明的保护范围内。
本发明的有益效果在于：
1.本发明通过对培养基成分的选择和优化，提供了一种用于微生物促生菌剂发酵的优良培养基配方，原料易获取、成本低、清洁环保、活菌数高；
2.本发明在发酵过程中添加植物根际分泌物提取液，促进了芽孢杆菌的生物获得量；
3.本发明通过分步控制发酵条件的方式，大大提高了芽孢率；
4.本发明所制得的发酵液中活菌数可达到10^10CFU/mL，芽孢率80％以上，显著提高了菌剂产品质量和货架期。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的蔬菜小苗均为黄瓜苗，取自农科院蔬菜大棚。
下述实施例中所用的培养基的配方如下：
蔬菜小苗培养液：硝酸钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.12g/L、硫酸镁0.3g/L、硝酸钙1.2g/L、硼酸钠0.015mg/L、EDTA铁钠0.25mg/L、硫酸锰0.04mg/L、硫酸铜0.08mg/L和硫酸锌0.015mg/L；
LB种子培养基：胰蛋白栋10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；
发酵培养液：12.5g/L玉米浆干粉、7.5g/L豆饼粉、5g/L豆粕提取物、10g/L糖蜜、2g/L柠檬酸、0.5g/L氯化钾、0.25g/L硫酸镁、0.03g/L氯化锰、0.3g/L氯化钙、0.05g/L有机硅消泡剂、调节pH至8.0的调节量的固体氢氧化钠颗粒和余量的水。
补料液：20wt％氢氧化钠、50wt％有机硅消泡剂和余量的水组成。
玉米浆干粉购自北京鸿润宝顺科技有限公司，产品名称为玉米浆干粉，货号为Y042。
豆饼粉购自北京鸿润宝顺科技有限公司，产品名称为豆饼粉，货号为Y030A。
豆粕粉购自北京鸿润宝顺科技有限公司，产品名称为豆粕提取物，货号为HEBS-Y024LP。
糖蜜的产品名称为EM菌扩繁营养液糖蜜。
有机硅油购自麦克林，产品名称为有机硅消泡剂，货号为0874979-1kg。
用于去除细菌的0.22μm的滤膜，其材质为聚醚砜(PES)，购自北京易秀博古生物科技有限公司，型号为NYLON 0.22μm。
0.45μm的滤膜，其材质为NY66，购自天津津腾，型号为50mm*0.45um。
吸附树脂，产品名称为大孔吸附树脂，购自依莱思特(上海)新材料科技有限公司，型号为AB-8。
实施例1、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117的发酵
甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117记载于中国专利CN104152383A“一种复合芽孢菌剂及其制备方法和应用”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
对上述甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117进行发酵，具体步骤如下：
(1)用清水洗掉定植期蔬菜小苗根系的土壤或栽培基质，用水培植物消毒液浸泡根系15min，再次清水冲洗几遍后，定植到栽培容器上，在室温为30℃的环境下用2000mL蔬菜小苗培养液对蔬菜苗培育2周，收集培养液并用0.45μm滤膜过滤除杂，收集滤液，经大孔吸附树脂吸附后用总计500mL乙醇洗脱，便可除去蔬菜苗营养液中的矿物质离子，收集流出液，蒸发浓缩至40mL并等体积水复溶，0.22μm滤膜过滤除菌后即得根系分泌物提取液，作为植物促生菌信号分子；
(2)挑取保存至-80℃冰箱的菌种划线至LB固体培养基种，37℃静置培养2d，取活化后促生芽孢杆菌菌株接种于LB种子培养基(胰蛋白栋10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)中，37℃下培养12h，制成种子液(菌种浓度为10^9CFU/mL)；
(3)配制发酵培养液并装入发酵罐中，121℃灭菌20min，将步骤(2)中的种子液按体积百分含量为发酵培养基的7％接入发酵培养基中，在37℃下培养24h，通气量为0.15L/min，按照1％接入步骤(1)中信号分子提取液，继续培养24h(温度和通气量保持不变)，按发酵液体积百分比的20％添加补料液，再降低通气量(由0.15L/min降低到0.08L/min)培养18h(温度不变)后，关闭通气培养2h即得。
实施例2、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Z48的发酵
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Z48促生：
菌株固氮能力的定性测定:取5μL菌液(活菌数10^8CFU/mL)点接种于无氮固体培养基表面的灭菌滤纸片上，待菌液晾干后置于28℃培养箱中培养3d，观察能否在选择培养基上生长。
菌株溶磷能力的测定:①定性测定：取5μL菌液(活菌数10^8CFU/mL)点接种于PKO无机培养基和蒙金娜有机培养基表面的灭菌滤纸片上，待菌液晾干后置于28℃培养箱中培养3d，观察有无溶磷圈，并根据溶磷圈的大小初步确定菌株解磷能力。②定量测定:将菌株以活菌数约为108CFU/mL按2％接种量接种于液体培养基中，28℃、200r/min培养5d，以加入等量无菌水的培养基为对照，超声波破碎20min后4℃、8 000r/min离心10min，取上清液采用钼锑抗比色法测定可溶性磷的含量。
结果：固氮量0.279μg/mL，溶磷圈直径2.71cm，溶磷量为95.52mg/L。
对上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Z48进行发酵，具体步骤如下：
(1)用清水洗掉定植期蔬菜小苗根系的土壤或栽培基质，用水培植物消毒液浸泡根系15min，再次清水冲洗几遍后，定植到栽培容器上，在室温为30℃的环境下用2000mL蔬菜小苗培养液对蔬菜苗培育2周，收集培养液并0.45μm滤膜过滤除杂，收集滤液，经大孔吸附树脂吸附后用总计500mL乙醇洗脱，便可除去蔬菜苗营养液中的矿物质离子，收集流出液，蒸发浓缩至40mL并等体积水复溶，0.22μm滤膜过滤除菌后即得根系分泌物提取液，作为植物促生菌信号分子；
(2)挑取保存至-80℃冰箱的菌种划线至LB固体培养基种，37℃静置培养2d，取活化后促生芽孢杆菌菌株接种于LB种子培养基(胰蛋白栋10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)中，37℃下培养12h，制成种子液(菌种浓度为10^9CFU/mL)；
(3)配制发酵培养液并装入发酵罐中，121℃灭菌20min，将步骤(2)中的种子液按7％接入发酵培养基中，在37℃下培养24h，通气量为0.15L/min，按照1％接入步骤(1)中信号分子提取液，继续培养24h(温度和通气量保持不变)，按发酵液体积百分比的20％添加补料液，再降低通气量(由0.15L/min降低到0.08L/min)培养18h(温度不变)后，关闭通气培养2h即得。
实施例3、复合芽孢杆菌菌剂(Bacillus velezensis C812、Bacillusmethylotrophicus LPL-117和Bacillus velezensis Z48)的发酵
甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117同实施例1。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Z48同实施例2。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)C812促生：
菌株溶磷能力的测定：①定性测定：取5μL菌液(活菌数10^8CFU/mL)点接种于PKO无机培养基和蒙金娜有机培养基表面的灭菌滤纸片上，待菌液晾干后置于28℃培养箱中培养3d，观察有无溶磷圈，并根据溶磷圈的大小初步确定菌株解磷能力。②定量测定：将菌株以活菌数约为108CFU/mL按2％接种量接种于液体培养基中，28℃、200r/min培养5d，以加入等量无菌水的培养基为对照，超声波破碎20min后4℃、8 000r/min离心10min，取上清液采用钼锑抗比色法测定可溶性磷的含量。
结果：溶磷圈直径2.73cm，溶磷量为64.51mg/L。
对芽孢杆菌(Bacillus velezensis C812、Bacillus methylotrophicus LPL-117和Bacillus velezensis Z48)进行发酵，具体步骤如下：
(1)用清水洗掉定植期蔬菜小苗根系的土壤或栽培基质，用水培植物消毒液浸泡根系15min，再次清水冲洗几遍后，定植到栽培容器上，在室温为30℃的环境下用2000mL蔬菜小苗培养液对蔬菜苗培育2周，收集培养液并0.45μm滤膜过滤除杂，收集滤液，经大孔吸附树脂吸附后用总计500mL乙醇洗脱，便可除去蔬菜苗营养液中的矿物质离子，收集流出液，蒸发浓缩至40mL并等体积水复溶，0.22μm滤膜过滤除菌后即得根系分泌物提取液，作为植物促生菌信号分子；
(2)挑取保存至-80℃冰箱的菌种划线至LB固体培养基种，37℃静置培养2d，取活化后促生芽孢杆菌菌株接种于LB种子培养基(胰蛋白栋10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)中，37℃下培养12h，制成种子液(菌种浓度为10^9CFU/mL)；
(3)配制发酵培养液并装入发酵罐中，121℃灭菌20min，将步骤(2)中的种子液按7％接入发酵培养基中，在37℃下培养24h，通气量为0.15L/min，按照1％接入步骤(1)中信号分子提取液，继续培养24h(温度和通气量保持不变)，按发酵液体积百分比的20％添加补料液，再降低通气量(0.15L/min降低到0.08L/min)培养18h后(温度不变)，关闭通气培养2h即得。
本实施例中，发酵液中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)C812、甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)Z48的菌落形成单位数目比为1：1：1。
实施例4、复合芽孢杆菌菌剂(Bacillus amyloliquefaciens L-S60、Bacillusmethylotrophicus LPL-117和Bacillus amyloidquefaciens L-H15)的发酵
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)L-S60记载于“张莹，秦宇轩，尚庆茂，张一凡，李昌辉，李平兰.解淀粉芽孢杆菌L-S60与黄瓜互作特性研究.农业机械学报，2019,50(2):258-265”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117同实施例1。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)L-H15记载于“张莹，秦宇轩，尚庆茂，张志刚，赖孟瑄，李平兰.解淀粉芽孢杆菌L-H15的促生与抗病特性研究.农业机械学报，2017，48(12):284-298”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
对复合芽孢杆菌(Bacillus velezensis L-S60、Bacillus methylotrophicusLPL-117和Bacillus amyloidquefaciens L-H15)进行发酵，具体步骤如下：
(1)用清水洗掉定植期蔬菜小苗根系的土壤或栽培基质，用水培植物消毒液浸泡根系15min，再次清水冲洗几遍后，定植到栽培容器上，在室温为30℃的环境下用2000mL蔬菜小苗培养液对蔬菜苗培育2周，收集培养液并0.45μm滤膜过滤除杂，收集滤液，经大孔吸附树脂吸附后用总计500mL乙醇洗脱，便可除去蔬菜苗营养液中的矿物质离子，收集流出液，蒸发浓缩至40mL并等体积水复溶，0.22μm滤膜过滤除菌后即得根系分泌物提取液，作为植物促生菌信号分子；
(2)挑取保存至-80℃冰箱的菌种划线至LB固体培养基种，37℃静置培养2d，取活化后促生芽孢杆菌菌株接种于LB种子培养基(胰蛋白栋10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)中，37℃下培养12h，制成种子液(菌种浓度为10^9CFU/mL)；
(3)配制发酵培养液并装入发酵罐中，121℃灭菌20min，将步骤(2)中的种子液按7％接入发酵培养基中，在37℃下培养24h，通气量为0.15L/min，按照1％接入步骤(1)中信号分子提取液，继续培养24h(温度和通气量保持不变)，按发酵液体积百分比的20％添加补料液，再降低通气量(0.15L/min降低到0.08L/min)培养18h后(温度不变)，关闭通气培养2h即得。
本实施例中，发酵液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)L-S60、甲基营养化芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)LPL-117和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)L-H15的菌落形成单位数目比为1：1：1。
对比例1、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus LPL-117)的发酵(采用LB作为发酵培养基)
LB培养液组成如下：胰蛋白栋10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L。
同实施例1，仅将发酵培养基替换为LB培养液，具体步骤如下：
(1)用清水洗掉定植期蔬菜小苗根系的土壤或栽培基质，用水培植物消毒液浸泡根系15min，再次清水冲洗几遍后，定植到栽培容器上，在室温为30℃的环境下用2000mL蔬菜小苗培养液对蔬菜苗培育2周，收集培养液并用0.45μm滤膜过滤除杂，收集滤液，经大孔吸附树脂吸附用总计500mL乙醇后洗脱，便可除去蔬菜苗营养液中的矿物质离子，收集流出液，蒸发浓缩至40mL并等体积水复溶，0.22μm滤膜过滤除菌后即得根系分泌物提取液，作为植物促生菌信号分子；
(2)取活化后促生芽孢杆菌菌株接种于LB种子培养基中，37℃下培养12h，制成种子液；
(3)配制LB培养液并装入发酵罐中，121℃灭菌20min，将步骤(2)中的种子液按7％接入发酵培养基中，在37℃下培养24h，通气量为0.15L/min，接入步骤(1)中信号分子提取液，继续培养24h(温度和通气量保持不变)，按发酵液体积百分比的20％添加补料液，再降低通气量(0.15L/min降低到0.08L/min)培养18h后(温度不变)，关闭通气培养2h即得。
对比例2、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis Z48)的发酵(不加植物促生菌信号分子)
同实施例2，仅在发酵过程中未添加植物促生菌信号分子，具体步骤如下：
(1)取活化后促生芽孢杆菌菌株接种于LB种子培养基中，37℃下培养12h，制成种子液；
(2)配制发酵培养液并装入发酵罐中，121℃灭菌20min，将步骤(1)中的种子液按7％接入发酵培养基中，在37℃下培养48h，通气量为0.15L/min，按发酵液体积百分比的20％添加补料液，再降低通气量(由0.15L/min降低到0.08L/min)培养18h(温度不变)后，关闭通气培养2h即得。
对比例3、复合芽孢杆菌菌剂(Bacillus velezensis C812、Bacillusmethylotrophicus LPL-117和Bacillus velezensis Z48)的发酵(采用LB培养基且不加植物促生菌信号分子)
同实施例3，仅将发酵培养基替换为LB培养液且发酵过程中不添加植物促生菌信号分子，具体步骤如下：
(1)取活化后促生芽孢杆菌菌株接种于LB种子培养基中，37℃下培养12h，制成种子液；
(2)配制LB并装入发酵罐中，121℃灭菌20min，将步骤(1)中的种子液按7％接入发酵培养基中，在37℃下培养48h，通气量为0.15L/min，按发酵液体积百分比的20％添加补料液，再降低通气量(0.15L/min降低到0.08L/min)培养18h后(温度不变)，关闭通气培养2h即得。
对比例4、复合芽孢杆菌菌剂(Bacillus velezensis L-S60、Bacillusmethylotrophicus LPL-117和Bacillus amyloidquefaciens L-H15)的发酵(采用LB培养基且不加植物促生菌信号分子、不降低及关闭通气)
同实施例4，仅将发酵培养基替换为LB培养液，且不添加植物促生菌信号分子，在发酵过程中不降低和关闭通气，具体步骤如下：
(1)取活化后促生芽孢杆菌菌株接种于LB种子培养基中，37℃下培养12h，制成种子液；
(2)配制LB并装入发酵罐中，121℃灭菌20min，将步骤(1)中的种子液按7％接入发酵培养基中，在37℃下培养48h，按发酵液体积百分比的20％添加补料液，继续培养20h(温度不变)后即得，发酵过程中通气量保持0.15L/min。
实施例5、性能测试
1活菌数的测定：
对上述各实施例和对比例的发酵菌剂的活菌数进行测定，具体如下：
取发酵液10mL，加入带玻璃珠的90mL的无菌水中，在15℃、200r/min摇床上充分振荡30min，取出1mL按1:10比例进行系列梯度稀释，取适合稀释梯度菌悬液0.1mL于PDA固体培养基平板上，涂布均与后置于37℃培养24h后计数，每个梯度3个平行。
2芽孢率的测定
对上述各实施例和对比例的发酵菌剂的芽孢率进行测定，具体如下：
取发酵液在80℃下水浴加热20min，冷却后加入带玻璃珠的90mL的无菌水中，在15℃、200r/min摇床上充分振荡30min，取出1mL按1:10比例进行系列梯度稀释，取适合稀释梯度菌悬液0.1mL于PDA固体培养基平板上，涂布均与后置于37℃培养24h后计数，每个梯度3个平行。
3α-淀粉酶的测定
对上述各实施例和对比例发酵菌剂的α-淀粉酶进行测定，具体操作根据购买自南京建成的α-淀粉酶检测试剂盒(C016-1-1)进行。
4蛋白酶的测定
对上述各实施例和对比例的发酵菌剂的蛋白酶进行测定，具体操作如下：
微生物产生的蛋白酶活性采用GB/T 23527-2009中的方法进行测定。用50mmol/L磷酸盐缓冲液pH 7.5配制浓度为1％的酪蛋白作为反应底物。将1mL待测粗酶液与1mL酪蛋白溶液混匀，于40℃下放置反应10min后，加入2mL三氯乙酸(0.4M)终止反应，12000rpm离心3min,取1mL上清液加入5mL Na2CO3(0.4M)和1mL Folin试剂使用液，40℃放置20min后，采用酶标仪在680nm下测定吸光值。空白对照组在加入粗酶液前，先加入三氯乙酸终止反应。每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量，定义为1个酶活力单位(U)。
X＝A×K×4/10×n
X：样品的酶活力，U/g或U/mL；A：样品平行试验的平均吸光度；K：吸光常数(K＝97.86实验室测定值)；4：反应试剂的总体积，mL；10：反应时间10min，以1min计；n：稀释倍数。
5脂肪酶的测定
对上述各实施例和对比例的发酵菌剂的脂肪酶进行测定，具体操作根据购买自南京建成的脂肪酶检测试剂盒(BC2340)进行。
表1各实施例试验结果
对比实施例1和对比例1发现，实施例1的发酵培养液活菌数、芽孢率、α-淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的含量更高，尤其是活菌数相差1个数量级，说明本发明发酵培养液更适合促生菌的发酵。
对比实施例2和对比例2可以看出，实施例2的发酵培养液活菌数、芽孢率、α-淀粉酶和蛋白酶的含量更高，说明发酵过程中添加蔬菜苗的根系分泌物提取液即植物促生菌信号分子促进了芽孢杆菌的生物获得量。
对比实施例3和对比例3可以看出，实施例3的发酵培养液活菌数、芽孢率、α-淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的含量更高，且活菌数相差2个数量级，芽孢率相差约60％。
对比实施例4和对比例4可以看出，实施例4的发酵培养液活菌数、芽孢率、α-淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的含量更高，且活菌数相差2个数量级，芽孢率相差约60％，尤其是脂肪酶相差约几十倍。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (9)

1.一种植物促生菌的液体发酵方法，包括如下步骤：
S1、在通气条件下，将发酵培养液灭菌后接入植物促生菌进行第一次培养；
所述植物促生菌为如下任一种：
1）贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis Z48，其保藏编号为CGMCC No.7749；
2）甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus LPL-117；
3）贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis C812、甲基营养化芽孢杆菌Bacillus methylotrophicusLPL-117和贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis Z48；
4）贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis L-S60、甲基营养化芽孢杆菌Bacillus methylotrophicusLPL-117和解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloidquefaciens L-H15 CGMCCNo.10044；
所述发酵培养液由下述组分组成：10~15 g/L的玉米浆干粉、5~10 g/L豆饼粉、3~5 g/L豆粕提取物、7.5~12.5 g/L糖蜜、1~3 g/L柠檬酸、0.4~0.6 g/L氯化钾、0.2~0.4 g/L硫酸镁、0.025~0.05 g/L氯化锰、0.2~0.4 g/L氯化钙、0.05~0.1 g/L有机硅消泡剂、调节pH至7.0~8.5的调节量的pH调节剂和余量的水；
S2、在第一培养结束后的培养体系中接入蔬菜苗的根系分泌物提取液进行第二次培养；
所述蔬菜苗为黄瓜；
制备所述根系分泌物提取液的方法，包括如下步骤：
1）取定植期蔬菜苗，对蔬菜苗的根系进行消毒；
2）将经所述消毒的蔬菜苗进行定植，用蔬菜苗培养液进行培育；
3）将经所述培育的培养液中的杂质和养分离子依次去除，然后再进行过滤除菌，得到所述根系分泌物提取液；
所述蔬菜苗培养液由硝酸钾0.4~0.6g/L、磷酸二氢钾0.1~0.15g/L、硫酸镁0.3~0.4 g/L、硝酸钙1~1.5 g/L、硼酸钠0.01~0.015mg/L、EDTA铁钠0.2~0.3mg/L、硫酸锰0.03~0.05mg/L、硫酸铜0.06~0.1mg/L和硫酸锌0.01~0.02mg/L组成；
S3、在第二次培养结束后的培养体系中添加补料液，降低通气量进行第三次培养；
S4、关闭通气，对第三次培养结束后的培养体系进行第四次培养，得到发酵液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物促生菌以其种子液的形式接入，所述种子液的接入量为所述发酵培养液体积的2%~10%；
所述第一次培养的温度为34~38℃，时间为18~24h，通气量为0.12~0.18 L/min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述消毒为采用水培植物消毒液浸泡根系10~15min；
所述培育的温度为25~35℃，时间为1~2周；
采用孔径为0.45μm的滤膜过滤去除所述培养液中的杂质；
采用大孔吸附树脂去除所述培养液中的矿物质离子，其中，每500mL蔬菜小苗培养液，用100~200mL乙醇洗脱，收集流出液，蒸发浓缩至5~10mL，等体积水复溶；
所述过滤除菌为采用孔径为0.22μm的滤膜过滤。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述蔬菜苗的根系分泌物提取液的接入量为第一培养结束后的发酵液体积的0.5%~1%；
所述第二次培养的温度为34~38℃，时间为18~24h，通气量为0.12~0.18 L/min。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：以质量百分含量计，所述补料液由20%~25%氢氧化钠、50%有机硅消泡剂和余量的水组成；
所述补料液的体积为第二次培养结束后的发酵液的体积的15％~25％；
所述第三次培养的温度为34~38℃，时间为12~24h，通气量为0.06~0.1 L/min。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述第四次培养的温度为34~38℃，时间为1~2h。
7.权利要求1-6中任一项所述的植物促生菌的液体发酵方法获得的植物促生菌发酵液。
8.权利要求7所述的植物促生菌的发酵液在制备植物促生菌菌剂中的应用。
9.一种植物促生菌菌剂，其由权利要求7所述的植物促生菌的发酵液制成。
CN202210840329.3A 2022-07-18 2022-07-18 一种植物促生菌的液体发酵方法 Active CN115181717B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210840329.3A CN115181717B (zh) 2022-07-18 2022-07-18 一种植物促生菌的液体发酵方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210840329.3A CN115181717B (zh) 2022-07-18 2022-07-18 一种植物促生菌的液体发酵方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115181717A CN115181717A (zh) 2022-10-14
CN115181717B true CN115181717B (zh) 2023-12-26

Family

ID=83520028

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210840329.3A Active CN115181717B (zh) 2022-07-18 2022-07-18 一种植物促生菌的液体发酵方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115181717B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102409014A (zh) * 2011-11-23 2012-04-11 山东省林业科学研究院 一株冬枣根际促生枯草芽孢杆菌及其应用
CN104130958A (zh) * 2014-07-24 2014-11-05 山东省林业科学研究院 一株枯草芽孢杆菌及其在防治牡丹根结线虫病上的应用
CN105062937A (zh) * 2015-09-24 2015-11-18 山东佐田氏生物科技有限公司 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN105255785A (zh) * 2015-11-17 2016-01-20 山东省农业科学院农业资源与环境研究所 一种高芽孢率的巨大芽孢杆菌的发酵方法
CN113875548A (zh) * 2021-11-09 2022-01-04 山东省科学院生态研究所(山东省科学院中日友好生物技术研究中心) 贝莱斯芽孢杆菌bv03在制备促进蔬菜生长的育苗基质中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102409014A (zh) * 2011-11-23 2012-04-11 山东省林业科学研究院 一株冬枣根际促生枯草芽孢杆菌及其应用
CN104130958A (zh) * 2014-07-24 2014-11-05 山东省林业科学研究院 一株枯草芽孢杆菌及其在防治牡丹根结线虫病上的应用
CN105062937A (zh) * 2015-09-24 2015-11-18 山东佐田氏生物科技有限公司 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN105255785A (zh) * 2015-11-17 2016-01-20 山东省农业科学院农业资源与环境研究所 一种高芽孢率的巨大芽孢杆菌的发酵方法
CN113875548A (zh) * 2021-11-09 2022-01-04 山东省科学院生态研究所(山东省科学院中日友好生物技术研究中心) 贝莱斯芽孢杆菌bv03在制备促进蔬菜生长的育苗基质中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN115181717A (zh) 2022-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111849815B (zh) 一种植物根际促生菌株Gxun-20及其在植物促生中的应用
CN103627662B (zh) 一种花生慢生根瘤菌及其用途
CN103275895B (zh) 一株耐盐碱产吲哚乙酸的枯草芽孢杆菌及其应用
CN102391960B (zh) 一种氯酚节杆菌及其应用
CN103333845B (zh) 一种绿针假单胞菌及其发酵培养方法
CN103243055B (zh) 一株具有荧蒽降解能力的耐盐碱产吲哚乙酸菌及其应用
CN110468080B (zh) 促生水稻与降镉的微生物菌剂及其制备方法和使用方法
CN109868242B (zh) 一株耐盐产乙偶姻的枯草芽孢杆菌及其应用
CN103243059B (zh) 一株具有荧蒽降解能力的产吲哚乙酸耐盐节杆菌及其应用
CN107628894A (zh) 提高土壤肥力的复合生物菌剂及其制备方法和应用
CN102634460A (zh) 米根霉rh1-5及其分离培养方法
CN114250164B (zh) 一种具有固氮、解磷能力的不动杆菌1502ipr-05及其应用
CN107467075B (zh) 一种短小芽孢杆菌作为水稻生长促进剂的用途
CN102703420A (zh) 一种城市垃圾及污水微生物降解制剂及其制备方法
CN113736661A (zh) 耐盐性的根际促生细菌的筛选方法、菌株及其应用
CN111363696B (zh) 一种链霉菌及其筛选方法与应用
CN108504598A (zh) 一种改善草莓根际土壤生态结构的生物菌肥发酵剂
CN116121147B (zh) 一株土荆芥种子内生拉里摩尔土壤杆菌及其应用
CN115181717B (zh) 一种植物促生菌的液体发酵方法
CN113355258B (zh) 一株鞘氨醇杆菌hp10及其应用
CN103451116A (zh) 一种荧光假单胞菌y13及制备方法和应用
CN1958525B (zh) 玫瑰黄链霉菌变种0116发酵液菌渣作为肥料的应用
CN108330085B (zh) 一种适用于低温环境的解钾菌株及基于该菌株制备微生态制剂的发酵方法
CN112226380A (zh) 一株降解纤维素生防芽孢杆菌及其应用和制剂
CN116286437B (zh) 一种枯草芽孢杆菌2-20及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant