CN105132332A

CN105132332A - 一株葡糖醋杆菌及其作为植物促生菌的应用

Info

Publication number: CN105132332A
Application number: CN201510626600.3A
Authority: CN
Inventors: 黄志勇; 王敬敬; 徐松; 王欢
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2015-09-28
Filing date: 2015-09-28
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2035-09-28
Also published as: CN105132332B

Abstract

本发明一种产液葡糖酸醋杆菌qzr14，保藏号为CGMCC？NO.10983。本发明提供的产液葡糖酸醋杆菌qzr14，还具有固氮作用、解钾作用，还能够合成吲哚乙酸、拮抗尖孢镰刀菌，且能够在土壤中有效定殖，并可在土壤中发挥磷转换能力，能够促进植物对氮和钾的吸收，为植物提供吲哚乙酸，从而起到促植物生长的作用，还可抑制枯萎病病原菌尖孢镰刀菌的生长，因而具有防治植物病害的作用。因此，虽然该菌是从茄子根际土中所筛选分离到的，由于上述作用所具有的促植物生长的共性，所以该菌还能够作为一种广泛的促生菌应用于其他植物当中。

Description

一株葡糖醋杆菌及其作为植物促生菌的应用

技术领域

本发明涉及促生菌生物技术领域，具体涉及一株葡糖醋杆菌及其作为植物促生菌应用的技术领域。

背景技术

随着我国工业化和现代化的发展，耕地面积逐年锐减。肥料在保障我国粮食安全和国家安全方面发挥着重大的作用。自20世纪60年代以来，化肥的使用对我国农业的增产、增收起到了巨大作用，但随着化肥的大量使用，不仅利用率和增产作用急剧下降，而且还带来了严重的环境污染(如土壤酸化、板结，水体污染)、食品安全(硝酸盐含量超标、重金属残留)、资源消耗等问题，亟需研发环境友好的新型肥料，以实现农业的可持续发展。

植物促生菌(Plantgrowth-promotingmicroorganisms，简称PGPM)是指能促进植物生长的微生物。以植物促生菌为核心的微生物肥料，是一种绿色、环保的新型肥料，具有提高土壤肥力、促进作物生长、抑制土传病害、增加作物产量、提升作物品质、改良土壤结构、减少化肥用量、提高化肥利用率、净化环境、维持生态平衡等作用。

在我国面临能源危机、资源紧缺、环境污染等压力的当下，为了实现农业的可持续发展，研究和应用以植物促生菌为核心的微生物肥料是一条必由之路。我国自2008年起，已将微生物肥料列为新兴产业和生物产业给予全方位的支持，为我国微生物肥料进一步发展提供了良好的机遇。近年来，我国微生物肥料行业发展迅猛，已逐渐成为肥料家族中的重要成员，并逐步成为中国国家生态示范区、绿色和有机农产品基地等肥料的主力军，正在农业生产中发挥着越来越明显的经济效益、社会效益和生态效益。

但是在微生物肥料产业中，多年来使用的菌种均为芽孢杆菌、假单胞菌等，存在着菌种单一、应用效果不稳定等问题，制约着微生物肥料行业的健康发展。亟需筛选新的、活性高、功能稳定的菌种，以促进微生物行业的蓬勃发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种葡糖醋杆菌及其应用，该菌具有固氮、解磷、解钾、分泌吲哚乙酸、拮抗病原菌等能力，且在土壤中具有定殖能力和磷转换能力，可应用于植物促生菌剂或微生物肥料的制备，从而弥补现有微生物肥料菌种单一、应用效果不稳定等不足。

本发明首先提供一种葡糖醋杆菌(Gluconacetobactersp)qzr14，其于2015年6月16日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.10983。

上述的葡糖醋杆菌qzr14在制备肥料中的应用，包括有如下的应用：

所述的菌株具有较好的溶磷作用。

所述的菌株具有固氮作用。

所述的菌株具有解钾作用。

所述的菌株还可以用于合成吲哚乙酸。

所述的菌株在制备抑制尖孢镰刀菌制剂中的应用。

所述的菌株在制备促植物生长的制剂的应用。

所述的制剂为促进氮元素吸收的制剂、促进磷元素吸收的制剂、促进钾吸收的制剂、促吲哚乙酸合成的制剂、抑制尖孢镰刀菌生长的制剂中的任一种或几种。

所述的制剂为微生物菌剂或微生物肥料。

本发明还提供一种微生物菌制剂，使用上述的菌株发酵制备的。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的葡糖醋杆菌qzr14，是以磷酸钙作为唯一P源的培养基对从茄子的根际土中的微生物进行筛选分离，得到的能够以磷酸钙作为唯一P源生长的微生物，检测结果表明该菌是一种能够降解无机磷的新的葡糖醋杆菌，分类命名为Gluconacetobactersp。

本发明提供的葡糖醋杆菌qzr14，由于其能将土壤中不溶性磷转换为可被植物直接吸收、利用的有效磷，因而可促进作物生长。

本发明提供的葡糖醋杆菌qzr14，还具有固氮作用、解钾作用，还能够合成吲哚乙酸、拮抗尖孢镰刀菌，且能够在土壤中有效定殖，并可在土壤中发挥磷转换能力，能够促进植物对氮和钾的吸收，为植物提供吲哚乙酸，从而起到促植物生长的作用，还可抑制枯萎病病原菌尖孢镰刀菌的生长，因而具有防治植物病害的作用。因此，虽然该菌是从茄子根际土中所筛选分离到的，由于上述作用所具有的促植物生长的共性，所以该菌还能够作为一种广泛的促生菌应用于其他植物当中。

本发明提供的葡糖醋杆菌qzr14，对黄瓜苗的鲜重、干重和株高具有显著的促进作用。经葡糖醋杆菌qzr14处理的黄瓜苗，在20天时，与对照相比，鲜重增加57.01％，干重增加98.46％，株高增加27.56％。

附图说明

图1：葡糖醋杆菌qzr14在解无机磷平板、牛肉膏蛋白胨平板和孔雀绿平板上的生长形态。

图2：葡糖醋杆菌qzr14的解磷能力。

图3：葡糖醋杆菌qzr14的解磷机制。

图4：葡糖醋杆菌qzr14在固氮平板、解钾平板、CAS平板上的生长形态。

图5：葡糖醋杆菌qzr14分泌吲哚乙酸的能力。

图6：葡糖醋杆菌qzr14对尖孢镰刀菌的拮抗作用。

图7：葡糖醋杆菌qzr14对对黄瓜苗干重、鲜重和株高的影响。

图8：葡糖醋杆菌qzr14在土壤中的定殖能力。

图9：葡糖醋杆菌在土壤中的解磷能力。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，本领域的普通技术人员在本发明公开内容的基础上可以选择本领域其它常用的方法来替代说明书具体实施例中采用的方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、葡糖醋杆菌qzr14的分离和鉴定

1、葡糖醋杆菌qzr14的分离

葡糖醋杆菌qzr14的分离包括取样，筛选和纯化两个步骤，具体方法如下：

1.1、取样

从茄子的根际土中进行筛选，具体的供试茄子及土壤取于辽宁省鞍山市千山区唐家房镇(土壤理化性质如下：pH8.15，全盐含量1.83％，碱解氮36mg/kg，有效磷8mg/kg，速效132mg/kg，有机质2.69％)。将茄子根际土壤装入事先准备好的干净保鲜袋中，带回实验室种植待测。

1.2、筛选和纯化

称取1g根际土壤样品，置于9ml无菌水中高速震荡制成土壤菌悬液，将梯度稀释的土壤悬液涂布在无机磷固体培养基(氯化钠0.3g，七水硫酸镁0.3g，氯化钾0.3g，硫酸铵0.5g，七水硫酸亚铁0.003g，四水硫酸锰0.003g，磷酸三钙5.0g，葡萄糖10g，琼脂18g，蒸馏水1L，pH7.0-7.5)上，倒置于生化培养箱中30℃培养3天。挑取平板上透明圈较明显的菌落在无机磷固体培养基上进行重复划线分离纯化，得到单一菌落。

2、葡糖醋杆菌qzr14的鉴定

对上述分离纯化得到的纯培养菌株进行一系列生理生化鉴定，同时在0.01％孔雀绿琼脂培养基上进行了培养，并进行DNA提取，16SrDNA的扩增和测序。

0.01％孔雀绿琼脂培养基成分：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，琼脂2g，0.01％孔雀绿，水100ml，PH＝7.4。30℃摇床培养3～7d。

2.1该菌株在牛肉膏培养基上为微小菌落，表面光滑，颜色透明，菌落边缘整齐。革兰氏染色为阴性，细胞呈短杆状。在解无机磷培养基上形成圆形、乳白色、不透明、边缘整齐的菌落。该菌株可在0.01％孔雀绿琼脂培养基上生长，形成圆形、透明的微小菌落。结果如图1所示。

2.2利用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)对葡糖醋杆菌qzr14的16SrDNA进行扩增：

PCR反应体系为25μL，具体成分如下：

PCR扩增条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。

对PCR扩增产物进行测序，测序结果已提交至NCBI，AccessionnumberKP715459。

将上述获得的纯培养菌株中的一株命名为葡糖醋杆菌qzr14，并将其保藏。保藏时间：2015年6月16日，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏号为CGMCCNO.10983。

实施例2、葡糖醋杆菌qzr14的解磷活性测定

溶磷圈：用葡糖醋杆菌qzr14菌液浸湿滤纸片，并放置在无机磷固体培养基平板上，30℃培养4天，测量溶磷圈直径(D)和菌落直径(d)。

溶磷量：将葡糖醋杆菌qzr14在牛肉膏蛋白胨液体培养基中30℃，180rpm过夜培养。用牛肉膏蛋白胨液体培养基将菌浓度稀释至1×10⁸个/ml，以10％接种量接入无机磷液体培养基中。以接入10％牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，每个处理设三个重复。30℃，180rpm在摇床上培养4天后，将发酵液10000rpm离心10min，取上清，在波长690nm下，采用钼锑抗比色法测定可溶性磷含量，具体步骤如下：

(a)取上清5-10ml(视上清中磷含量而定)，置于50ml量瓶中，加入7.5N硫酸钼锑抗混合显色剂5ml，加去离子水定容至刻度，充分摇匀，静置30min。

(b)30min后在分光光度计比色(波长660nm)，比色时须同时做空白测定。

(c)与此同时绘制磷标准曲线，分别吸取5ppm磷酸标准溶液0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml于50ml容量瓶中，每一量瓶磷的浓度即为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ppm，再个加入7.5N硫酸钼锑抗混合显色剂5ml，然后与待测液一样进行比色，绘制标准曲线。

结果如图1B所示，葡糖醋杆菌qzr14在无机磷固体培养基平板上形成了较明显的溶磷圈。溶磷圈直径为2.6cm，菌落直径为0.7cm。葡糖醋杆菌qzr14在无机磷培养液中的溶磷量为270mg/L，溶磷能力较强(图2)。说明CGMCCNO.10983具有将土壤中的难溶磷，转换成易于吸收的有效磷的能力，这可使植物更易于吸收磷，从而促进植物生长。

实施例3、葡糖醋杆菌qzr14的解磷机制测定

将葡糖醋杆菌qzr14在牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养24小时，用生理盐水制成菌悬液(菌数约1×10⁸个/ml)，以10％的接种量接种到无机磷液体培养基中，30℃摇床培养(200r/min)96小时，每12小时取样一次；发酵液中菌数利用细菌计数板进行计数；发酵液pH用pH计进行测量；取10ml发酵液12000r/min离心10min，采用钼锑抗比色法测定上清液中可溶性磷含量；上清液经0.22μm滤膜进行过滤，利用津岛LC-20A高效液相色谱仪对有机酸进行分析(色谱柱为美国Bio-Rad的HPX-87H，进样器为SIL-20AC，紫外检测器为SPD-20A，进样器为SIL-20AC，柱温箱为CTO-20AC，泵为LC-20AD)。色谱分离条件：柱温为60℃；流动相为0.5mM的H₂SO₄；流速为0.6ml/min；进样量10μl；紫外检测波长为215nm。利用SPSS17.0中的皮尔逊相关分析对发酵液中菌数、pH、可溶性磷和有机酸进行相关性分析。

结果如图3所示，通过对葡糖醋杆菌qzr14发酵液中菌数的监测，发现0～24小时，qzr14处于对数生长期，菌数快速增加到1.40×10¹⁰个/ml；24～36小时菌数小幅度下降到1.09×10⁹个/ml；36小时之后，菌数维持在5.54×10⁸～1.09×10⁹个/ml。通过对发酵液中有机酸进行实时监测，发现该菌在发酵液中分泌的有机酸以葡糖酸为主，12～36小时葡糖酸的产量快速增加到1.72g/L；36～96小时，葡糖酸的产量在1.03～1.78g/L内波动，且从36小时开始有少量甲酸的分泌，96小时分泌微量的乙酸。发酵液pH在0～24小时从6.0快速下降到3.6，在24～60小时从3.6缓慢下降到3.2，60小时后一直维持在3.2。发酵液中的可溶性磷在0～24小时快速增加到247.07mg/L，36～96小时可溶性磷缓慢上升至265.08mg/L。通过相关性分析发现溶磷量与pH(r＝-0.977，P<0.01)、菌数(r＝0.806，P<0.01)和葡糖酸(r＝0.759，P<0.05)均有显著相关性。说明葡糖醋杆菌qzr14主要是通过分泌葡糖酸溶解无机磷。

实施例4、葡糖醋杆菌qzr14的固氮能力测定

从无机磷培养基平板上挑取解磷菌菌落，用无菌水制成菌悬液，取5μl菌悬液点在阿须贝固体培养基上，来检测其是否有固氮能力。如果可在阿须贝固体培养基上生长，则具有固氮能力，反之，则无固氮能力。

阿须贝固氮菌培养基：磷酸二氢钾0.2g，七水硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，碳酸钙5.0g，甘露醇10.0g，二水硫酸钙0.1g，琼脂粉20g，蒸馏水1L，pH7.0。

结果如图4A所示，葡糖醋杆菌qzr14在阿须贝固体培养基上生长，说明其具有固氮能力。说明CGMCCNO.10983具有将空气中的N₂转化为有效氮的能力，将有助于植物对土壤中氮的吸收，从而促进植物生长。

实施例5、葡糖醋杆菌qzr14的解钾能力测定

从无机磷培养基平板上挑取解磷菌菌落，用无菌水制成菌悬液，取5μl菌悬液点在解钾固体培养基上，来检测其是否有解钾能力。如果可在解钾固体培养基上生长，则具有解钾能力，反之，则无解钾能力。

解钾培养基：磷酸氢二钠2.0g，七水硫酸镁0.5g，氯化铁0.005g，碳酸钙0.1g，蔗糖5.0g，钾长石粉1.0g，琼脂粉20g，pH7.0-7.5，蒸馏水1L。

结果如图4B所示，葡糖醋杆菌qzr14在解钾固体培养基上生长，说明其具有解钾能力。说明CGMCCNO.10983具有将土壤中不溶性钾转化为有效钾的能力，将有助于植物对土壤中钾的吸收，从而促进植物生长。

实施例6、葡糖醋杆菌qzr14分泌嗜铁素能力测定

铬天青(chromeazurolS，CAS)培养基的配制：

A：蓝色染液

a.0.06gCAS溶于50ml去离子水；

b.0.0027gFeCl·6H₂O溶于10ml10mMHCl；

c.0.073gHDTMA(十六烷基三甲基溴化胺)溶于40ml去离子水；

d.将a与9mlb混合，再混合c，此时为蓝色，121℃高温灭菌20min。

B：混合液

a.MM9：15gKH2PO4，25gNaCl，50gNH4Cl溶于500ml去离子水；

b.20％葡萄糖溶液：20g葡萄糖溶于100ml去离子水，110℃单独灭菌，；

c.NaOH溶液：25gNaOH溶于150ml去离子水，pH约为12；

d.水解酪蛋白物溶液：3g酪蛋白水解物溶于27ml去离子水，滤膜过滤。

C：CAS琼脂板准备(1L量)：

a.100mlMM9加入750ml去离子水；

b.溶解32.24g哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)；

c.加入细菌培养用琼脂15g；

d.高温灭菌(121℃，20min)，冷却到50℃；

e.加入30ml过滤灭菌的水解酪蛋白溶液，10ml20％的葡萄糖溶液到MM9/PIPES混合液中(6ml+2ml)；

f.缓慢加入100ml蓝色染液，沿玻璃瓶壁加入，充分混匀；

g.倒平板。将已分离保存的细菌接于铬天青(CAS)培养基上，28℃培养48～72h，观察菌落周围的颜色变化，以及产生的橘黄色的透明晕圈的直径。

将葡糖醋杆菌qzr14接于CAS固体培养基上，28℃培养72h，观察菌落周围的颜色变化，有橘黄色圈产生即可产生嗜铁素。

结果如图4C所示，在CAS固体培养基上，葡糖醋杆菌qzr14菌落周围无橘黄色晕圈产生，即葡糖醋杆菌qzr14无产生嗜铁素的能力。

实施例7、葡糖醋杆菌qzr14分泌生长激素吲哚乙酸(IAA)的能力测定

供试菌株葡糖醋杆菌qzr14先在牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养2d后，再微量转入含有L-色氨酸(100mg/L)的LG无氮培养基中(葡萄糖10g，KH₂PO₄0.41g，K₂HPO₄0.52g，CaCl₂0.2g，Na₂SO₄0.05g，MgSO₄·7H₂O0.1g，FeSO₄·7H₂O0.005g，Na₂MoO₄·2H₂O0.0025g，蒸馏水1L)，30℃，200rpm摇床培养72h。取3ml的菌液12,000rpm离心15min，去沉淀。取1ml的上清夜加入2ml的Salkowski’s反应液(12mg/LFeCl₃，7.9MH₂SO₄，加蒸馏水至1L)在暗处混合反应30min，测定OD530nm的值。无菌培养基同上做相同的处理作为对照调零。以浓度为0、0.01、0.05、0.25、0.5mg·mL^-1的吲哚乙酸(IAA)标准液同方法做标准曲线。吲哚乙酸(IAA)含量单位为μg·(mL·OD600)^-1，IAA标准曲线平行2次，样品重复3次。

根据制作标准曲线和检测结果，即可获得葡糖醋杆菌qzr14分泌吲哚乙酸(IAA)的量为1.33μg/mL(图5)。葡糖醋杆菌qzr14以色氨酸(L-Trp)为前体合成植物生长激素吲哚乙酸(IAA)，由于其吸附在种子和根的表面，从而被植物所利用，同时也可以和植物内生的IAA共同作用刺激植物细胞生长和增殖，可促进植物根系的生长发育及有效吸收土壤中的水分和养分，同时对植物的其他生命活动进行调节。

实施例8、葡糖醋杆菌qzr14对病原菌的拮抗作用

采用平板对峙法研究葡糖醋杆菌qzr14对真菌病原菌的拮抗作用。在病原真菌(立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌)的菌落边缘利用1ml的无菌枪头插取直径为5mm的琼脂块，放置于PDA平板中心，在PDA平板边缘对称地点接上2μl待测细菌菌悬液(10⁸CFU/ml)，30℃同步培养3～5天。如果待测细菌具有拮抗能力，则会在PDA平板上产生抑菌圈。

结果如图6所示，葡糖醋杆菌qzr14在尖孢镰刀菌生长的平板上产生了明显的抑菌圈，说明葡糖醋杆菌qzr14具有拮抗尖孢镰刀菌的能力。尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。葡糖醋杆菌qzr14可作为生物农药用于防治各种作物的枯萎病。

实施例9、葡糖醋杆菌qzr14对黄瓜苗的促生效果

采用盆栽试验进行黄瓜苗的促生实验。为期20天，期间施加一次菌液，观察施加菌液和未施加菌液处理对黄瓜苗的株高，鲜重和干重的影响。

用于黄瓜苗促生实验的土壤取于辽宁省鞍山市千山区唐家房镇土壤作为供试土壤，土壤性质：pH6.8；有机质2.35％；总氮142mg/kg；总磷107mg/kg；总钾310mg/kg；速效氮147mg/kg；有效磷6mg/kg；有效钾376mg/kg。将供试土壤在阴凉避光处晾干，过1mm筛。每200g土壤与1.1g磷酸三钙混匀。称取200g混合土壤装入直径为8cm的花盆中。供试植株采用黄瓜中农8号。将黄瓜种子育种7天后，选取大小一致的植株作为实验植株，移植于花盆中，每盆一株黄瓜苗。

将CGMCCNO.10983接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28℃下振荡培养24h，4℃离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤、离心2次后重悬浮于无菌水中，使活菌数在无菌生理盐水中的终浓度达10⁸CFU/mL。取20ml菌悬液均匀添加到花盆中，同时添加20ml无菌生理盐水作为对照，每个处理三个重复。

将黄瓜放置于人工气候培养箱中进行培养(28℃，14小时光照，12℃，16小时无光照)，并进行统一管理(每48小时浇水30ml)，培养20天。实验结束后，对黄瓜苗株高、鲜重和干重进行测量。

检测结果表明，CGMCCNO.6297活菌对黄瓜苗的株高具有显著的促进作用。测定经CGMCCNO.10983处理的黄瓜苗，在20天时，与对照相比，鲜重增加57.01％，干重增加98.46％，株高增加27.56％，其统计结果如表1和图7所示。

表1葡糖醋杆菌qzr14对黄瓜苗鲜重、干重和株高的影响

实施例10、葡糖醋杆菌qzr14在土壤中的定殖能力测定

针对盆栽实验，分别在盆栽植株的第4天、8天、12天、16天和20天，利用土壤样品DNA提取试剂盒(MoBioLaboratories,Inc.,USA)对添加qzr14菌液和空白对照的盆栽植物的根际土壤和根周土壤进行DNA提取。

使用96Instrument型荧光定量PCR仪和SYBRGreen试剂盒(TaKaRa)分别对葡糖醋杆菌qzr14在土壤根际和根周的数量进行PCR扩增测定，前引物为5’-GGCTGCATTTGATACGTCCA-3’，后引物为5’-GCGTTAACTACGACACTGAATGA-3’。

本实验实时荧光定量PCR反应体系为20μL，具体成分如下：

扩增程序为：94℃预变性3min，30个循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃终延伸10min。

标准曲线的建立：

1.提前准备好含X-Gal，IPTG，Amp的LB平板培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，去离子水1000mL，pH值7.0。120摄氏度灭菌20min，冷却到60℃时，加入1mL氨苄青霉素(100mg/mL)，IPTG(24mg/mL)，X-Gal(20mg/mL)，混匀后倒平板(4℃避光保存，保存日期不超过7天)。

2.以单一条带的DNA为模板(纯菌DNA单一条带)，进行50μLPCR扩增。

3.使用胶纯化试剂盒(博大泰恒，北京)对产物进行切胶纯化。

4.在紫外可见分光光度计(NanoDropTechnologies)上测定纯化DNA模板的浓度。

5.一般DNA片段的克隆实验(冰上解冻)。

⑴在微量离心管(PCR管)中配制下列DNA溶液(表2-3)，全量为5μL。

⑵加入5μL(等量)的SolutionI.

⑶16℃反应30min。

⑷全量(10μL)加入至100μLJM109感受态细胞中，冰中放置30min(感受态细胞在冰上解冻)。

⑸42℃加热45s后，再在冰中放置1min

⑹加入890μLLB液体培养基，37℃振荡培养60min。

⑺在含有X-Gal，IPTG，Amp的LB平板培养基上培养12-24h。

⑻挑选白色单菌落，放入LB液体培养基，培养12h。

6.用质粒提取试剂盒提取质粒(AXYGEN)。

7.质粒DNA的浓度用紫外可见分光光度计(NanoDropTechnologies)进行测定，目的基因的拷贝数通过质粒DNA的浓度进行计算。

8.梯度稀释(10^-1-10^-9)已知拷贝数的质粒DNA，选取5个合适的梯度稀释的质粒DNA为模板，每个梯度3个重复，进行荧光定量PCR。

9.根据质粒DNA拷贝数与Ct值的线性关系建立标准曲线。

结果如图8所示，在整个生长过程中，接种菌株qzr14的处理中菌株qzr14的数量均高于空白对照。根际土壤中qzr14的数量(8.3×10⁶～1.0×10⁸个/g干土)显著低于于根周土壤中qzr14的数量(4.1×10⁸～7.2×10⁸个/g干土)(P<0.001)。接种4天后，根际土壤中qzr14的数量从1.0×10⁸急剧下降到8.3×10⁶，之后逐渐上升，接种20天后已达到1.03×10⁸；根周土壤中qzr14的数量从1.0×10⁸快速上升到5.3×10⁸，之后一直维持在4.1×10⁸～7.2×10⁸。这说明菌株qzr14可在土壤中长期存活、定殖，并在土壤中形成了一定的时空分布特征：菌株qzr14根际定殖数量＜根周定殖数量。

实施例11、葡糖醋杆菌qzr14在土壤中磷转换能力的测定

针对盆栽实验，每四天取盆中土样一次，每次三个重复，在阴凉处阴干，过筛(100目)后，用100ml碳酸氢钠浸提液(NaHCO3浓度为0.5mol/L-1，pH8.5)并加入一勺无磷活性炭(经1:1的HCl浸泡，清洗至无Cl^-1为止)在20℃对5g土壤样品进行震荡30min，用钼锑抗比色法对浸提液中有效磷进行测定。用土壤总磷试剂盒(苏州科铭生物有限公司)对土壤全磷进行测定。利用SPSS17.0中的配对T检验对盆栽土壤中有效磷、总磷和有效磷与总磷比值进行显著性分析。

结果如图9所示，接种qzr14四天后，接种qzr14的土壤中有效磷含量(172.56～196.84mg/kg)均高于对照(145.63～170.73mg/kg)；接种qzr14的土壤中总磷含量(764.67～1004.4mg/kg)均低于对照(958.93～1161.47mg/kg)；解磷菌qzr14处理的盆栽土壤中有效磷占总磷的百分比(19.62～22.57％)始终显著(P<0.05)高于空白对照(12.53～17.35％)。与对照相比，经qzr14处理的盆栽土壤中总磷减少，有效磷增多，比值增高，说明qzr14可溶解土壤中的不溶性磷，促进植株对有效磷的吸收。

综上检测表明，CGMCCNO.10983可溶解土壤中的不溶性磷为有效磷，可促进植物对磷元素的吸收，进而促进植物生长；尤其是还具有固氮作用、解钾作用、还能够合成吲哚乙酸、还对病原真菌尖孢镰刀菌具有拮抗作用，从而能够促进植物对氮、磷、钾元素的吸收，提供吲哚乙酸促进植物生长，拮抗病原真菌，防治植物病害。此外CGMCCNO.10983在土壤中可有效定殖，且在土壤中亦可发挥较高的磷转化活性。因此，由于上述作用所具有的促植物生长的共性，所以虽然该菌从茄子的根际土中分离，但是该菌能够作为一种广泛的促生菌应用于其他植物促生长当中。

Claims

1.一种产液葡糖酸醋杆菌，其特征在于，所述的产液葡糖酸醋杆菌的保藏编号为CGMCCNO.10983。

2.权利要求1所述的产液葡糖酸醋杆菌在制备肥料中的应用。

3.权利要求1所述的产液葡糖酸醋杆菌在合成吲哚乙酸中的应用。

4.权利要求1所述的产液葡糖酸醋杆菌在制备抑制尖孢镰刀菌的制剂中的应用。

5.权利要求1所述的产液葡糖酸醋杆菌在制备促植物生长的制剂的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的制剂为促进氮元素吸收的制剂、促进磷元素吸收的制剂或促进钾吸收的制剂。

7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述的制剂为微生物菌剂或微生物肥料。

8.一种微生物菌制剂，其特征在于，所述的微生物菌制剂是使用权利要求1所述的产液葡糖酸醋杆菌发酵制备的。

9.一种微生物肥料，其特征在于，所述的微生物肥料包含有具有活力的权利要求1所述的产液葡糖酸醋杆菌。

10.权利要求8所述的微生物菌制剂和权利要求9所述的微生物肥料在促进黄瓜生长中的应用。