CN104312950B - 一株解鸟氨酸拉乌尔菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株解鸟氨酸拉乌尔菌及其应用。本发明公开一株解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)，其保藏号为CGMCC No.9407。本发明公开的保藏编号为CGMCC No.9407的解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)WN‑3耐受寡营养的生存环境，并具有良好的解磷能力，可促进土壤磷利用率的提高，提高作物产量和/或改善其性状，改善农田土壤，具有重大的经济、环境和社会效益。

Description

一株解鸟氨酸拉乌尔菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株解鸟氨酸拉乌尔菌及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
我国有70％以上的耕地土壤处于缺磷状态，虽然经过磷肥的长期施用之后大多数农田土壤中潜在的磷含量很大，但能够被作物生长发育利用的磷量却非常少，土壤中95％以上的磷都以难溶态的无效形式逐渐积累起来。化学磷肥的长期低效率使用会造成土壤理化性质的改变，产生长期的不利影响。研究发现，有一类微生物能够将植物难以吸收利用的不溶性磷转化为易利用的可溶性磷形态，促进植物对磷的吸收，使植物能够适应酸性、缺磷等不良环境，这类微生物就是解磷菌(Phosphate solubilizingmicroorganism，PSM)。解磷菌在农业中的应用一方面能够提高土壤磷的利用率，另一方面也能够改善土壤的质地，对保持农业生态环境的平衡具有十分重要的意义。
目前，已报道的解磷菌主要为细菌，包括假单胞菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)、根瘤菌(Rhizobium)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、微球菌(Microccocus)、气杆菌(Aereobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、欧文氏菌(Erwinia)、肠杆菌(Enterobacter)、柠檬酸菌(Citrobacter)、变形菌(Proteus)和克雷伯氏菌(Klebsiella)等。科学工作者也一直致力于开发更好地解磷菌剂以改善目前的不良状况，但是，由于实验室中对解磷菌的培养条件与实际应用中土壤的环境条件差别太大，因此大多数解磷菌剂的促生长与改善土壤的效果还不尽人意。导致解磷菌剂效果变差的一个重要原因就是培养基中营养成分过多，解磷菌在寡营养条件下不能很好地发挥作用。因此，筛选解磷能力较好且环境能力适应性强的优良菌种，对于高效解磷菌剂的开发以及土壤肥力的提高等具有重要的理论及现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种解鸟氨酸拉乌尔菌及其应用。
本发明提供一株解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)，其保藏号为CGMCC No.9407。
一种菌剂也属于本发明的保护范围，该菌剂含有上述解鸟氨酸拉乌尔菌和/或其发酵产物。
上述解鸟氨酸拉乌尔菌或上述菌剂在解磷中的应用也属于本发明的保护范围；
所述解磷为将植物难以吸收利用的不溶性磷转化为可利用的可溶性的磷。
上述应用中，所述磷为土壤中的磷；
所述植物为小麦。
上述解鸟氨酸拉乌尔菌或上述菌剂在改善土壤中的应用也属于本发明的保护范围。
上述解鸟氨酸拉乌尔菌或上述菌剂在提高土壤中植物可利用的可溶性的磷的量中的应用也属于本发明的保护范围。
上述解鸟氨酸拉乌尔菌或上述菌剂在促进植物对磷的吸收和/或利用中的应用也属于本发明的保护范围。
上述解鸟氨酸拉乌尔菌或上述菌剂在提高植物产量和/或改善其性状中的应用也属于本发明的保护范围；
所述性状具体为植株株高或干重。
上述任一所述的应用中，所述植物为小麦。
本发明提供的解鸟氨酸拉乌尔菌可在寡营养条件及较广的温度与pH范围内生长，有利于实际应用，并具有良好的解磷能力，可促进土壤磷利用率的提高，提高植物产量和/或改善其性状，改善农田土壤，具有重大的经济、环境和社会效益。
附图说明
图1为菌株WN-3解磷能力随培养时间的变化。
图2为菌株WN-3对盆栽小麦促生长实验的结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复，结果取平均值。
1/4蒙金娜固体培养基(筛选培养基)：葡萄糖2.5g，(NH4)2SO40.125g，NaCl 0.075g，KCl 0.075g，MgSO4·7H2O 0.075g，Ca3(PO4)2 2.5g，FeSO4·7H2O 0.0075g，MnSO4·4H2O0.0075g，Ca3(PO4)25g，琼脂16g，加蒸馏水溶解并定容至1000mL，pH 7.0～7.5，此条件为寡营养条件。
1/4蒙金娜液体培养基：葡萄糖2.5g，(NH4)2SO40.125g，NaCl 0.075g，KCl 0.075g，MgSO4·7H2O 0.075g，Ca3(PO4)2 2.5g，FeSO4·7H2O 0.0075g，MnSO4·4H2O 0.0075g，Ca3(PO4)2 5g，加蒸馏水溶解并定容至1000mL，pH 7.0～7.5，此条件为寡营养条件。
LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加蒸馏水溶解并定容至1000mL，pH 7.2。
小麦(冀麦38号)(Triticum aestivum)在文献“蔡静平，张帅兵，翟焕趁，等。临界安全水分下小麦储藏过程中抗霉变特性的比较。现代食品科技，2013，29:1528-1532”中公开过，公众可从河南工业大学获得。
下述实施例中总磷浓度的测定方法为过硫酸钾消解钼酸铵分光光度法(GB11893-89)。
下述实施例中可溶性磷的测定方法为钼酸铵分光光度法。
实施例1、解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)WN-3的分离及鉴定
一、菌株的分离
2012年4月采集河南省郑州市五龙口污水处理厂活性污泥，途中将样品置于4℃以下的冰盒中，带回实验室后称取5g样品放入装有45mL无菌水的三角瓶中，于28℃，150rpm摇床振荡1h，待样品均匀分散到无菌水中之后，吸取1mL悬液于装有9mL无菌水的试管中，混匀，制成浓度分别为10-1-10-6g/mL的菌悬液，从各浓度的菌悬液中分别吸取100μL涂布于1/4蒙金娜固体培养基平板上，28℃恒温培养箱培养5-6d。将菌落边缘出现透明圈的不同菌落划线纯化，并依次标记为WN-1，WN-2等，记作初步筛选的解磷细菌。
再将初步筛选的解磷细菌接入1/4蒙金娜液体培养基中，28℃，150rpm摇床振荡培养3d，得到的菌悬液以8000rpm的转速离心10min，取上清液测定可溶性磷浓度，筛选得到其中磷含量最高的菌株WN-3。
二、菌株的鉴定
将菌株WN-3在1/4蒙金娜固体培养基上28℃培养48h后，菌株WN-3的菌落为圆形、白色、湿润、较粘稠、凸起、边缘不规则、不透明。
菌株WN-3的主要生物学特性如下：革兰氏阴性(G-)，菌体为直杆状，兼性厌氧；接触酶阳性、吲哚反应、甲基红实验均为阳性。
WN-3的16S rRNA基因部分序列如SEQ ID No.1所示。
菌株WN-3的分类命名为解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)，该菌已于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.9407。
菌株WN-3在温度为4-40℃，pH为4.5-10.0的条件下均可生长。
实施例2、解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)WN-3的解磷能力
一、取斜面上保存的WN-3菌落一环接种于5ml LB液体培养基中，28℃下150rpm摇床培养过夜，得到菌液1，然后将5ml菌液1接入100ml LB液体培养基中，28℃下150rpm摇床培养24h，得到菌液2，取5ml菌液2，离心(8000rpm，10min)，无菌水洗两次，用无菌水重悬，得到菌液3。
二、将菌液3接入50ml 1/4蒙金娜液体培养基中，28℃，150rpm摇床振荡培养3d，期间于0、0.5、1、1.5、2和3d时均取样5ml，8000rpm离心10min，分别取上清液测定可溶性磷浓度，考察菌株WN-3的解磷能力随培养时间的变化。
结果如图1所示。
图1表明，在0.5d以及1d内液体培养基的溶磷量迅速上升，1d时已经达到286.33mg/L，在第2d时溶磷量达到最大值，为322.96mg/L。
实施例3、解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)WN-3对盆栽小麦的促生长实验
一、菌株活化同实施例2的步骤一，直至获得菌液2，将其离心(6000rpm，10min)，得到湿重为0.1g的WN-3的菌体，加入3ml蒸馏水重悬菌体制备成菌剂。
二、设立如下对照组和实验组：
实验组：将花盆中先浇透水，再将步骤一制备的菌剂倒入花盆中央，在倒入菌剂的位置均匀撒小麦(冀麦38号)种1克(约24粒)，用湿土覆盖。
对照组：不加菌剂，其它步骤与实验组相同。
将实验组和对照组在温室25℃条件下培养20d，之后小心拔出各组小麦，自然晾干，测量株高、称干重，测定植株的总磷量，并计算单位重量的总磷含量(以小麦植株的总磷量比小麦植株的干重)。同时取各组的根际土土壤1g，自然晾干，测定其中的可溶性磷含量。
每组实验设5个平行，最终结果取平均值。
结果如图2所示，图2中，A为对照组，B为实验组。
结果表明，与对照组相比，实验组将WN-3制成的菌剂接种于土壤后，小麦植株株高高出41％，干重增加19％，植株的总磷量提高35％，植株单位重量的总磷含量增加5％，小麦根际(根际土土壤)可溶性磷含量提高24％。

Claims (9)

1.一株解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)，其保藏号为CGMCCNo.9407。
2.一种菌剂，该菌剂含有权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌。
3.权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌或权利要求2所述的菌剂在解磷中的应用，所述解磷为将植物难以吸收利用的不溶性磷转化为可利用的可溶性磷。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述磷为土壤中的磷；
所述植物为小麦。
5.权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌或权利要求2所述的菌剂在改善土壤中的应用。
6.权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌或权利要求2所述的菌剂在提高土壤中植物可利用的可溶性磷的量中的应用。
7.权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌或权利要求2所述的菌剂在促进植物对磷的吸收和/或利用中的应用。
8.权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌或权利要求2所述的菌剂在提高植物产量和/或改善其性状中的应用。
9.根据权利要求6-8任一所述的应用，其特征在于：所述植物为小麦。
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