CN104531576B - 一株邻苯二甲酸二丁酯降解菌 - Google Patents

一株邻苯二甲酸二丁酯降解菌 Download PDF

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Abstract

一株邻苯二甲酸二丁酯降解菌，涉及一株降解邻苯二甲酸二丁酯的菌株。本发明提供一株降解邻苯二甲酸二丁酯的菌株，具有高效降解邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的能力，为有效解决DBP的污染问题提供微生物基础。该菌株为假单胞菌DNB‑S1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年11月6日，保藏编号为CGMCC No.9526。该菌株可高效降解邻苯二甲酸二丁酯，48h内DBP的降解率能达到90％。

Description

一株邻苯二甲酸二丁酯降解菌
技术领域
本发明涉及一株降解邻苯二甲酸二丁酯的菌株。
背景技术
DBP是有毒污染物酞酸酯的一种，在环境中普遍存在，是全球性的有机污染物，同时被美国国家环保局列为优控污染物。DBP毒性较高具“三致危害”可以通过食物链在生物体内富集，引起神经、免疫、肝脏、生殖等毒性作用。
DBP是一种重要的增塑剂，是塑料农膜的重要成分，在中国塑料农膜的使用量位居世界前列，所以在设施土壤中已大量检测出DBP的存在。而且DBP不易溶于水，其固体吸附系数较大，迁移性较差，在自然环境中的性质非常稳定，不易降解，可以吸附在植物根系，并通过积累直接影响作物品质，对农作物造成毒害，导致减产，严重威胁农业生产环境的生态健康。
经过国内外学者的研究，发现生物降解是使DBP完全矿化的主要手法，本发明为减少农业土壤中的DBP含量，采用特殊培养的方法分离提取了一株DBP降解菌，并对其高效性和降解速率进行了探讨和研究，不但为消除环境中的DBP的污染问题提供了可行性，而且为其应用提供了理论依据。
发明内容
本发明提供一株降解邻苯二甲酸二丁酯的菌株，具有高效降解邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的能力，为有效解决DBP的污染问题提供微生物基础。
本发明邻苯二甲酸二丁酯降解菌为假单胞菌(Pseudomonas sp.)DNB-S1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年11月6日，保藏编号为CGMCC No.9526。
本发明假单胞菌DNB-S1为革兰氏阴性菌，菌落为白色，呈圆形，边缘为锯齿状，光滑湿润，中心凸起；该菌的淀粉水解试验、油脂水解试验、明胶水解试验、甲基红试验、伏-普实验均为阳性，硫化氢试验、尿素测定试验、吲哚试验、柠檬酸盐试验为阴性，能利用DBP为唯一碳源和能源进行生长繁殖。
本发明假单胞菌DNB-S1的培养方法简单，可在无机盐培养基中生长，生长迅速，很难发生变异，其菌液可以直接作用于被DBP污染的土壤。该菌的最适生长条件为：温度35℃，pH值7，摇床转速为125r/m，接菌量为3％，DBP浓度为500mg/L。
本发明假单胞菌DNB-S1通过16S rDNA序列比对分析，与假单胞菌属(Pseudomonassp.)有极高的同源性，同源性为99％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定假单胞菌DNB-S1属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。
将假单胞菌DNB-S1放在最适生长条件下培养(温度35℃，pH值7，摇床转速为125r/m，接菌量为3％，DBP浓度为500mg/L)，48h内DBP的降解率能达到90％，效果显著，为有效解决DBP的污染问题提供工具。同时，在排除DBP浓度对其生长过程抑制作用的基础上，对其生长过程中12-33h进行动力学研究，发现假单胞菌DNB-S1对DBP的降解过程符合一级反应模型，其动力学方程为c＝6.444-0.032t(R2＝0.9942)(为DBP浓度，t为反应时间)。
本发明假单胞菌DNB-S1属于假单胞菌属，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年11月6日，保藏编号为CGMCC No.9526。
附图说明
图1为本发明假单胞菌DNB-S1菌体的透射电镜照片；图2为假单胞菌DNB-S1的生长曲线；图3为本发明假单胞菌DNB-S1降解DBP的影响图；图4为本发明假单胞菌DNB-S1降解DBP的降解曲线的线性拟合图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式邻苯二甲酸二丁酯降解菌为假单胞菌(Pseudomonassp.)DNB-S1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年11月6日，保藏编号为CGMCC No.9526。
本实施方式假单胞菌DNB-S1为革兰氏阴性菌，菌落为白色，呈圆形，边缘为锯齿状，光滑湿润，中心凸起；该菌的淀粉水解试验、油脂水解试验、明胶水解试验、甲基红试验、伏-普实验均为阳性，硫化氢试验、尿素测定试验、吲哚试验、柠檬酸盐试验为阴性，能利用DBP为唯一碳源和能源进行生长繁殖。菌体的透射电镜照片如图1所示。
本发明假单胞菌DNB-S1的培养方法简单，生长迅速，很难发生变异，其菌液可以直接作用于被DBP污染的土壤。该菌的最适生长条件为：温度35℃，pH值7，摇床转速为125r/m，接菌量为3％，DBP浓度为500mg/L。本发明假单胞菌DNB-S1可在无机盐培养基上生长。
本实施方式假单胞菌DNB-S1是在荒废的受污染的设施土壤中分离筛选得到的。分离方法按以下步骤进行：
取5～20cm处的表层土壤样品10g，置于灭菌的150mL三角瓶中，加入100mL无菌水制成土壤稀释液，于150r/m震荡20分钟，将菌打散，制成菌悬液。每个土样都用梯度稀释法稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的浓度。分别取10-3、10-4、10-5浓度的菌悬液在操净台中涂平板，每个平板加200μL。涂板后正置20分钟后倒置，放在30℃的恒温箱中恒温培养，挑取有降解圈的单菌落进行富集培养，在30℃、150r/m恒温振荡培养，每5天按10-3比例接种到新配制的固体无机盐培养基中继续培养，新配制的液体无机盐培养基按50个浓度梯度递增至DBP浓度为1000mg/L。将培养物稀释涂布，培养7天后，再次挑取有降解圈的单菌落进行平板划线，多次分离纯化后，筛选出能以DBP为唯一碳源生长的菌株，将菌株接入斜面培养后，移入冰箱4℃保存，该菌株即为本实施方式的假单胞菌DNB-S1。
上述平板为以DBP为唯一碳源的固体无机盐培养基(1L)：琼脂15～20g、K2HPO4·3H2O0.5g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaCl 0.5g、NH4NO30.25g、FeCl3·6H2O 0.005g、CaCl2·2H2O0.05g，DBP 500mg，灭菌后制成平板。
液体无机盐培养基成分是：K2HPO4·3H2O 0.5g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaCl 0.5g、NH4NO30.25g、FeCl3·6H2O 0.005g、CaCl2·2H2O 0.05g。
对分离筛选得到的假单胞菌DNB-S1进行分子鉴定，按以下步骤进行：
提取菌株的基因组DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物进行测序，所得序列如SEQ ID NO：1所示，通过NCBI数据库进行BLAST比对，结果显示该菌株与假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的序列同源性最高，同源性为99％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定假单胞菌DNB-S1属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。
(一)假单胞菌DNB-S1的最适生长曲线测定：
用无机盐液体培养基培养菌体过夜，离心收集菌体，清除培养基，以无菌水重悬菌体，调节OD600值至0.9，以最适生长条件培养，最适生长条件培养为：温度35℃，pH值7，摇床转速为125r/m，接菌量为3％，DBP浓度为500mg/L。每个时段设置五个平行实验组，每隔3h取样，测定OD600值，计算其平均值，培养48h，获得生长曲线，结果如图2所示，假单胞菌DNB-S1在生长12h之后进入对数期并直到30h结束，然后在一段时期内处于稳定期，这两个时期是生产和科研用菌的主要时期。
(二)在最适生长条件下培养菌生长48h，每个时段设置五个平行实验组，每隔6h(0h为对照)，将5个待测溶液分别全部倒入具塞刻度管中，加入30mL正己烷，涡旋混合5～8min，静止一段时间，抽取5mL上层正己烷混合溶液，经过石油醚熏过的棉花和无水硫酸钠过滤后，再抽取1mL放入样品瓶中，进行GC-MS分析，测定DBP含量。结果如图3所示，图3中，—■—表示DBP，—●—表示OD。在DNB-S1菌生长初期，DNB-S1生长速度较慢且浓度较低时，DBP的降解率不高且速率缓慢，等菌生长到对数期后，DBP的浓度开始大幅下降，其降解速率随着生长速率的提高显著增加，直到降解菌稳定期时，达到其降解速率的最高点，每隔3h，就可以消耗超过50mg/LDBP,此时该菌的活性最强，是实际生产应用的最好时期。最终菌株生长到达衰亡期，虽然受到DBP浓度的限制其降解速率开始减慢，但DBP浓度仍然被不断被消耗，最终48h内菌株DNB-S1对500mg/LDBP去除率高达90％，说明该菌DNB-S1对DBP具有高效降解性，有很高的实用价值。
(三)假单胞菌DNB-S1的生物降解动力学分析
选取菌株生长的12h到33h之间的5时间点，排除DBP浓度过高的抑制作用和DBP浓度较低导致的DNB-S1菌过早进入衰亡期的情况下,用下列公式进行了DNB-S1菌对DBP的生物降解动力学分析:
c＝b+k0t (1)
ln C＝a+k1t (2)
式中c为DBP浓度，t为降解时间，k0、k1分别为零级和一级反应速率常数。a为t＝0时反应物浓度，以x表示t时刻已去除的反应物浓度，则尚未反应的反应物浓度为a-x。计算结果表明，与零级反应模型相比，一级反应模型更加符合DNB-S1对DBP生物降解的实际情况，动力学分析结果如图4所示，表明DNB-S1菌对DBP的降解过程符合一级反应动力学，其动力学方程为c＝6.444-0.032t(R2＝0.9942)，体现了该菌的高效降解特性，同时为实际应用提供了理论基础。

Claims (1)

1.一株邻苯二甲酸二丁酯降解菌，其特征在于该菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)DNB-S1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年11月6日，保藏编号为CGMCC No.9526。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105063006B (zh) * 2015-07-16 2019-01-01 东北农业大学 一种邻苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球及其制备方法和应用
CN106754582B (zh) * 2017-03-21 2019-10-18 青岛农业大学 恶臭假单胞菌rxx-01及其在降解土壤邻苯二甲酸酯中的应用
CN106834269B (zh) * 2017-03-21 2019-11-05 青岛农业大学 一种PAEs降解菌的固定化微球及其制备方法和应用
CN108048371A (zh) * 2018-01-29 2018-05-18 东北农业大学 一种多功能农业土壤修复菌剂及其制备方法和应用
CN108753662B (zh) * 2018-06-25 2021-04-27 齐齐哈尔大学 一株低温邻苯二甲酸二甲酯高效降解菌及其发酵方法
CN109207400B (zh) * 2018-09-26 2021-09-28 东北农业大学 一种高效降解黑土中邻苯二甲酸酯的复合菌剂及降解方法
CN113173643A (zh) * 2021-04-22 2021-07-27 浙江工业大学 基于a/a/o系统高效稳定降解垃圾渗滤液中dbp的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101008001A (zh) * 2007-01-17 2007-08-01 华南理工大学 邻苯二甲酸二丁酯降解菌及其应用
CN102154173A (zh) * 2011-01-14 2011-08-17 中国科学院研究生院 一株邻苯二甲酸酯类高效降解菌分离及其应用
CN102703347A (zh) * 2012-05-25 2012-10-03 武汉科技大学 一株邻苯二甲酸二丁酯降解菌及其应用
CN103613203A (zh) * 2013-11-11 2014-03-05 武汉科技大学 利用邻苯二甲酸二丁酯降解菌降低炼油废水中cod的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101008001A (zh) * 2007-01-17 2007-08-01 华南理工大学 邻苯二甲酸二丁酯降解菌及其应用
CN102154173A (zh) * 2011-01-14 2011-08-17 中国科学院研究生院 一株邻苯二甲酸酯类高效降解菌分离及其应用
CN102703347A (zh) * 2012-05-25 2012-10-03 武汉科技大学 一株邻苯二甲酸二丁酯降解菌及其应用
CN103613203A (zh) * 2013-11-11 2014-03-05 武汉科技大学 利用邻苯二甲酸二丁酯降解菌降低炼油废水中cod的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
两株邻苯二甲酸二丁酯降解菌的分离鉴定及降解特性的研究;段星春等;《农业环境科学学报》;20071231;第26卷(第5期);1937- 1941 *
邻苯二甲酸二丁酯降解优势菌的筛选和特性研究;王琳等;《卫生研究》;20040331;第33卷(第2期);137-139 *

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