CN105925503B - 一株耐盐根际促生阴沟肠杆菌及其应用 - Google Patents

一株耐盐根际促生阴沟肠杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株耐盐根际促生阴沟肠杆菌及其应用，该菌株的分类命名为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）TIA062，已于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11974。本发明的一株耐盐根际促生阴沟肠杆菌，可提高白蜡的耐盐碱能力。将本发明的耐盐根际促生阴沟肠杆菌接种到白蜡根系周围，经一定时间的盐分胁迫后，同不接种菌剂相比，可提高白蜡的根系含水量，促进白蜡生长，因此，本发明可作为接种剂在盐分环境中应用，为提高白蜡的抗盐碱能力提供了优良的菌株资源。

Description

一株耐盐根际促生阴沟肠杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株耐盐根际促生阴沟肠杆菌及其应用。
背景技术
土壤盐渍化是一个世界性的资源和生态问题，我国各种类型的盐渍土总量为14.87亿亩，其中，现代盐渍化土壤约5.54亿亩；残余盐渍化土壤约6.73亿亩；潜在盐渍化土壤约为2.6亿亩。这些盐土盐碱地区土壤条件苛刻，土地生产力低，难以开发利用，生态环境极度脆弱。
目前我国对于盐碱地的改良措施主要以物理、水利、生物和化学四大体系为核心。其中生物改良主要应用高效耐盐微生物与植物的协同作用，在恢复盐碱地的同时还可以保护生态平衡，在改善盐渍土质方面发挥着重要的作用。
陈昢圳等人公开了一种异养硝化耐盐菌及其应用，可有效提高对含盐量高的农村生活污水中氮及CODcr的去除效率；杜传英等人采用温度筛选与表面定向培养相结合的方法对东北地区土壤中可培养耐盐芽孢杆菌进行分离和筛选，认为弯曲芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的耐盐能力较好。大量研究也表明，接种含ACC脱氨酶的根际促生细菌可提高植物的耐盐能力。比如王慧捷等人研究认为，番茄接种桔黄假单胞菌后，可耐酸碱，对病菌表现出较高的抗菌活性。这些研究证明，微生物在提高植物耐盐碱能力方面发挥着重要作用。
由于多数植物和微生物不具有抵抗高盐的能力，而细菌与植物在耐盐方面又有较大的相似性，有些植物可以与耐盐菌共生，而有些植物并不能和共生。因此，构建高效耐盐细菌资源库以及继续发掘耐盐功能基因尤其重要。
发明内容
本发明的目的是提供一株耐盐根际促生阴沟肠杆菌及其应用，该菌株可作为接种剂在盐分环境中应用。
本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一株阴沟肠杆菌，该菌株的分类命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)TIA062，已于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.11974。
菌落特征及菌体形态：
菌落圆形规则，菌落较小(1～2mm)，表面凸起较湿润干燥，呈微黄色，不透明，菌体0.6～0.8微米，短杆状，无芽孢。
生理生化特征：
接触酶试验阳性，柠檬酸盐利用试验阳性，水解淀粉试验阴性，V-P测定试验阳性，D-葡萄糖产酸试验阳性，D-甘露醇试验阳性，D-山梨醇试验阳性，蔗糖试验阳性，葡萄糖产气试验阳性，甲基红试验阴性。
功能定性及定量测定：
将TIA062接种于含有L-色氨酸的R2A液体培养基中，28℃，180rpm，摇床培养4d。用分光光度法测定菌悬液的OD600值，然后将菌悬液10000rpm离心10min，取上清液加入等体积Salkowski(50mL 35％HClO4+1mL 0.5M FeCl3)比色液，避光静置30min，测定其OD530值。计算菌浓度OD600值为1时，单位体积发酵液中IAA的含量，通过IAA梯度稀释的标准曲线计算IAA的含量。通过测定，TIA062产IAA含量为106.19μg/(mL·OD600)-1。
本发明筛选的菌株特别适应白蜡这种特定的根际环境，提高白蜡的耐盐碱能力，从而促进白蜡的生长。
本发明的第二个目的是提供一种微生物混合物，其特点是至少包含本发明的菌株，所述微生物混合物可以包含其他具有耐盐碱性能并可以与本发明菌株共生的微生物。
本发明的第三个目的是提供一种包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品，该产品可以是菌剂或组合物等形式。
优选的，所述产品包括载体；所述载体可以为固体载体或液体载体。所述固体载体或液体载体均为常规的载体材料，其中，固体载体可以选自粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石、玉米粉、豆粉、聚乙烯醇和/或聚二醇；液体载体可以为植物油、矿物油或水。
优选的，所述产品为粉末形式、溶液形式、悬浮剂形式、片剂形式、颗粒形式或其他形式。
进一步优选的，所述粉末形式可以为冻干粉末形式；所述片剂形式为含有所述冻干粉末和任选营养素(例如维生素、矿物盐等)的片剂形式。
所述产品的活性成分为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)TIA062，该活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。
本发明的第四个目的是保护本发明的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)TIA062发酵液。
本发明的第五个目的是提供一种本发明的菌株、本发明的微生物混合物或者本发明的包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品在提高植物的耐盐碱能力中的应用，所述植物具体为白蜡。
本发明的菌株在盐分胁迫的环境中，可提高白蜡的根系含水量，促进白蜡生长。
本发明的第六个目的是提供一种促进盐碱环境中白蜡生长的方法，该方法包括使需要生长的白蜡的根际周围环境与本发明的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)TIA062接触的步骤。
优选的，所述白蜡的根际周围环境为白蜡根际培养基质。
优选的，使需要生长的白蜡的根际周围环境与本发明的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)TIA062接触的步骤在于：用本发明的阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)TIA062接种需要生长的白蜡根际培养基质中，该培养基质中含有一定的盐碱成分。
本发明的有益效果是：本发明的一株耐盐根际促生阴沟肠杆菌，可提高白蜡的耐盐碱能力。将本发明的耐盐根际促生阴沟肠杆菌接种到白蜡根系周围，经一定时间的盐分胁迫后，同不接种菌剂相比，可提高白蜡的根系含水量，促进白蜡生长，因此，本发明可作为接种剂在盐分环境中应用，为提高白蜡的抗盐碱能力提供了优良的菌株资源。
附图说明
图1是本发明菌株的菌落形态图。
图2是本发明菌株的光学显微镜镜检图。
具体实施方式
实施例1 本发明阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)TIA062的筛选
(1)筛选过程
采集黄河三角洲白蜡根际土样样品2个。通过梯度稀释法，从根际土样中分离出细菌分离物。通过三区划线法对分离到的细菌进行纯化，并通过镜检判断菌株是否纯化，对纯化后的细菌进行编号，挑取单菌落，转接到LB斜面上保存备用。
向含有L-色氨酸的R2A液体培养基中接菌，28℃，180rpm，摇床培养4d。取50微升菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加入50微升Salkowski比色液(50ml 35％HCLO4+1ml 0.5mol/L FeCl3)。将加入50mg/L IAA的比色液作为阳性对照。白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察，颜色变红者表示能够分泌IAA，初筛出分泌IAA的细菌。
对初筛获得的分泌IAA的细菌进行定量测定，继续筛选具有应用潜力的根际促生细菌。最后通过白蜡育苗及盆栽实验，确定一株促进白蜡生长效果最好的细菌，编号为TIA062。
(2)菌落特征及菌体形态
如图1和2所示，菌落圆形规则，菌落较小(1～2mm)，表面凸起较湿润干燥，呈微黄色，不透明，菌体较小，短杆状，无芽孢。
(3)生理生化特征
接触酶试验阳性，柠檬酸盐利用试验阳性，水解淀粉试验阴性，V-P测定试验阳性，D-葡萄糖产酸试验阳性，D-甘露醇试验阳性，D-山梨醇试验阳性，蔗糖试验阳性，葡萄糖产气试验阳性，甲基红试验阴性。
(4)功能定性及定量测定：
将TIA062接种于含有L-色氨酸的R2A液体培养基中，28℃，180rpm，摇床培养4d。用分光光度法测定菌悬液的OD600值，然后将菌悬液10000rpm离心10min，取上清液加入等体积Salkowski(50mL 35％HClO4+1mL 0.5M FeCl3)比色液，避光静置30min，测定其OD530值。计算菌浓度OD600值为1时，单位体积发酵液中IAA的含量，通过IAA梯度稀释的标准曲线计算IAA的含量。通过测定，TIA062产IAA含量为106.19μg/(mL·OD600)-1。
(5)16S rDNA序列分析
本发明菌株的16S rDNA基因序列，见核苷酸序列表所示。将所测16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对。
TIA062系统发育树中同阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)处于同一分枝，其16S rDNA序列与阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的相似性达98.97％。结合菌落形态，生理生化特征和16SrDNA序列分析，将本发明的菌株TIA062鉴定为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。
实施例2 在盐胁迫作用下对白蜡的促生作用
将保存在斜面上的TIA062用三区划线的方法活化在LB(蛋白胨10g；NaCl 10g；酵母浸膏5g；琼脂15-20g；水1000ml；pH7.0-7.2，分装，121℃灭菌20min)平板上。挑取单菌落至相应的10ml液体培养基中，37℃，180rpm培养24h。按1％接种量将种子液接种至相应的50ml液体培养基中进行发酵，37℃，180rpm培养2d。
植物材料选用当年培育的白蜡容器苗。育苗采用基质材料为草炭和蛭石，草炭来自吉林省梅河口市山城镇，蛭石为常用材料。按照体积比草炭：蛭石＝3:1的比例混合作为育苗基质。
按照重量计算加入NaCl，调节土壤盐分约1‰～5‰，土壤平衡3d后利用重量法测定土壤盐分，根据NaCl的添加量和测定的土壤盐分值得两者回归方程：y＝0.0821x+0.072(R2＝0.9923，n＝6)，其中y为NaCl添加的质量分数，x为土壤盐分含量。根据所得回归方程计算NaCl添加的质量分数，调节土壤盐分含量为3‰，选取生长基本一致的白蜡容器苗(平均株高26.4±1.37cm)定植在调节好盐分的土壤中。取5ml菌液稀释10倍接种到白蜡根部周围。以不接种菌液(浇灌相同量的培养基)作为对照，每个处理10株，正常管理，调查株高和地径，并测定叶片中MDA和CAT的含量。结果如表1显示，一定盐分环境下接种TIA062，可显著促进白蜡的高生长，增加地上部和根系的重量，减轻盐分胁迫对白蜡造成的生理伤害。
表1
实施例3
一种微生物混合物，其特点是包含本发明的菌株阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)TIA062，还包含其他微生物，所述其他微生物为具有耐盐碱性能并可以与本发明菌株共生的微生物。经过实验验证，该微生物混合物可显著促进白蜡的高生长，增加地上部和根系的重量，能减轻盐分胁迫对白蜡造成的生理伤害。
实施例4
一种包含本发明菌株或本发明微生物混合物的菌剂，菌剂中包括载体和该本发明所述的菌株-阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)TIA062，所述载体可以为固体载体或液体载体。所述固体载体或液体载体均为常规的载体材料，其中，固体载体可以选自粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石、玉米粉、豆粉、聚乙烯醇和/或聚二醇；液体载体可以为植物油、矿物油或水。菌剂的形式为冻干粉末形式。经过实验验证，该菌剂以阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)TIA062为活性成分，可显著促进白蜡的高生长，增加地上部和根系的重量，能减轻盐分胁迫对白蜡造成的生理伤害。

Claims (9)

1.一株阴沟肠杆菌，其特征是：该菌株的分类命名为阴沟肠杆菌Enterobactercloacae TIA062，已于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11974，该菌株的16SrDNA基因序列如序列表1所示。
2.一种微生物混合物，其特征是：该微生物混合物至少包含权利要求1所述的阴沟肠杆菌。
3.包含权利要求1所述的阴沟肠杆菌或权利要求2所述的微生物混合物的菌剂。
4.如权利要求3所述的菌剂，其特征是：所述菌剂为粉末形式、溶液形式、悬浮剂形式、片剂形式或颗粒形式。
5.如权利要求3所述的菌剂，其特征是：所述菌剂包括载体；所述载体为固体载体或液体载体。
6.至少包含权利要求1所述的阴沟肠杆菌的发酵液。
7.权利要求1所述的阴沟肠杆菌或权利要求2所述的微生物混合物或权利要求3所述的菌剂或权利要求6所述的发酵液在提高白蜡的耐盐能力中的应用。
8.一种促进盐环境中白蜡生长的方法，其特征是：该方法包括使需要生长的白蜡的根际周围环境与权利要求1所述的阴沟肠杆菌接触的步骤。
9.如权利要求8所述的方法，其特征是，使需要生长的白蜡的根际周围环境与权利要求1所述的阴沟肠杆菌接触的步骤在于：用权利要求1所述的阴沟肠杆菌接种需要生长的白蜡根际培养基质中。
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