CN105018394B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治水稻稻曲病方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治水稻稻曲病方面的应用。该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)QZ‑003H，保藏编号为CGMCC No.11051。本发明还公开了一种含有上述解淀粉芽孢杆菌菌株QZ‑003H的生物防治制剂及其制备方法。实验表明，本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产芽孢量大、抗逆性强，在水稻根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该解淀粉芽孢杆菌制备的生物防治制剂，可以作为生物农药或生物肥料，防治水稻稻曲病。
Description
技术领域
本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一株能够高效防治植物病害的芽孢杆菌及其用途，以及采用该芽孢杆菌制备的生物防治制剂。
背景技术
植物病害严重影响农林作物生长，甚至引起作物死亡，造成重大的经济损失。对于植物病害的防治，常规采用的方法包括传统的化学防治、培育抗病品种以及生物防治。抗病品种周期长，抗性单一。化学防治使用药剂时间长、使用量大，造成农药残留，环境污染；同时，化学农药的长期使用，使得病原菌对其产生抗药性，导致防效下降甚至失败。利用有益微生物防治植物病害具有广阔的前景。
芽孢杆菌是一种广泛分布于各种不同生活环境中的腐生细菌，是一群好氧兼厌氧的产芽孢革兰氏阳性杆菌的总称，可以产生内生耐热抗逆的芽孢。芽孢不仅对热有抗逆性，还对紫外线、电磁辐射及一些化学药品有很强的抗逆性，它可以忍受各种不良环境。由于具有如此强的抗逆性，使得它有利于生防菌剂的生产和剂型加工，也利于其在环境中的存活、定殖与繁殖。由于它们生长快、营养简单、能够形成具有较强抗逆性能力的芽孢，在产品开发中较非芽孢杆菌有效活菌数量高、性能稳定等优势而备受瞩目。芽孢杆菌是植物病害生防微生物的重要组成部分，可用于防治多种植物病害。芽孢杆菌作为生防菌防治植物病害的机制主要有：抗生作用、营养竞争、空间竞争、重寄生作用以及诱导植物产生抗性等机制，芽孢杆菌的生防机制主要是以产生拮抗物质抑制有害病菌的生长或杀死病原菌。这些物质绝大多数为肽类抗生素，具有高效、低残留、与环境友好等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高效防治水稻稻曲病的芽孢杆菌——解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H。本发明的芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在水稻根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
本发明所提供的菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)QZ-003H，是从土壤中分离获得的，已于2015年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.11051。其具有以下生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株QZ-003H的培养方法或繁殖方法包括：
(1)普通培养保存采用牛肉膏蛋白胨琼脂(NA)培养基，配方为：胰蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2；
(2)实验室液体培养采用牛肉膏蛋白胨液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2；
(3)固体培养基配方：固料和无机盐溶液，按质量比1：1.8的比例配制。其中所述固料由质量比为60：40的玉米芯和麸皮组成；所述无机盐溶液的组分及质量百分比为：3.5％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，4％硫酸铵，剩余为水。
(4)大量发酵培养基配方：同(3)中固体培养基配方。
本发明还公开了一种含有上述解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H的生物防治制剂。
本发明所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)制备解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H的种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28-30℃下恒温培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。
其中，步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，二者质量比为1：1.8；其中所述固料由质量比为60：40的玉米芯和麸皮组成；所述无机盐溶液的组分及质量百分比为：3.5％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，4％硫酸铵，剩余为水。
并且，步骤(3)中的大量发酵培养基同固体培养基
在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H的孢子移植到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28-30℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28-30℃下振荡培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至发酵培养基，室温28-30℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。
本发明也提供了上述解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H或者上述生物防治制剂在防治水稻稻曲病中的用途。
本发明还提供了一种用于防治水稻稻曲病的方法，包括向具有水稻稻曲病的水稻施用上述解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H或者上述生物防治制剂。优选方法为：水稻破口前3-5天及破口后5-7天各施药1次，使用时应植株叶面喷雾，使用量为有效成分9000-15000亿孢子/公顷，兑水750公斤/公顷。
实验表明，本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产芽孢量大、抗逆性强，在水稻根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该解淀粉芽孢杆菌制备的生物防治制剂，可以作为生物农药或生物肥料，防治水稻稻曲病。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1、解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H的分离与纯化
本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H是从土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：
⑴芽孢杆菌的分离：土样的采集，在全国不同地区选取种植不同作物类型的地块，采用5点取样法，分别采集地块四周和中央深度在10-20cm范围内的土壤适量，等量混匀。标明采集地点、时间和采集人。称取1g土样于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μL 10-2、10-3、10-4稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取牛肉膏蛋白胨培养基上的不同形态的微生物菌落于牛肉膏蛋白胨培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别编号保存。
⑵水稻稻曲病高效拮抗芽孢杆菌的筛选
①初筛：采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器在芽孢杆菌、水稻稻曲病边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25℃恒温培养，逐日观察芽孢杆菌对病原菌的抑制作用。
②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。
本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治多种植物病害的解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H。实验证明，该解淀粉芽孢杆菌原粉在防水稻稻曲病显示出非常高效的防治效果，使得农作物显著增产。因而，本发明的解淀粉芽孢杆菌是具有广泛应用前景的解淀粉芽孢杆菌新菌株，可以用于制备防治多种植物病害的生物防治制剂。
2、菌株鉴定
(1)微生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
(2)分子生物学特性
该菌株的16s rDNA基因序列测定结果如下(SEQ-1)：
CGCCTGCCTATACTGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGAGCCAGCCGCCGAAGGTG
实施例2
1、芽孢杆菌菌株QZ-003H发酵过程
牛肉膏蛋白胨液体培养基，配方为胰蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2。
大量固体发酵培养基配方(质量百分含量)：固料：玉米芯60％，麸皮40％；所述无机盐溶液的组分及质量百分比为：磷酸二氢钾3.5％，硫酸镁0.04％，硫酸铵4％，剩余为水。固液比为1:1.8(质量比)。
解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H大量固体发酵过程：
①菌种种子液培养：将解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H从试管斜面中挑取少量细菌，移至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液；
②固体生产菌种的培养：将种子液按10％的比例接种到固体培养基(500mL三角瓶)中，30℃恒温培养3～5d，中间多次振荡；
③大量固体发酵：将②中固体培养的培养物用无菌水按1:15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，除去粗渣，即为生产菌液，接种比例按体积比1:6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(30℃和相对湿度85％以上)中发酵培养8～9d，干燥后即可得到解淀粉芽孢杆菌原粉，菌活为150-300亿/克；
④可湿性粉剂：解淀粉芽孢杆菌原粉(菌活250亿/克)4％、葡萄糖35％，淀粉20％，湿润剂10045％，分散剂NNO 2％，CMC 2％，其余为白炭黑，菌活为10亿/克。
实施例3田间防治试验
1试验目的
本发明进行10亿孢子/克解淀粉芽孢杆菌(QZ-003H)可湿粉剂防治水稻稻曲病田间药效试验，为确定药剂防治水稻稻曲病的最佳田间使用量，药剂药效，作用特点，持效期，药剂对作物及非靶标有益生物的影响和安全合理的实用技术提供数据。
2试验条件
2.1试验对象、作物和品种的选择
试验对象：稻曲病ustilaginoldea virens；
试验作物：单季晚稻，品种为宁81。
2.2作物栽培及环境条件
试验田位于浙江省鄞州区邱隘镇上万龄村，该试验区水稻面积的180亩，土壤质地为水稻土壤，pH值为6.6，有机含量为3.27％。水稻有单季和双季两种种植模式。
3试验设计和安排
3.1药剂
3.1.1试验药剂
10亿孢子/克解淀粉芽孢杆菌可湿粉剂，实施例2制备。
3.1.2对照药剂
2.5％井冈霉素，市售，江苏苏滨生物农化有限公司。
3.1.3药剂用量与处理编号
表1供试药剂试验设计
3.2.2小区面积和重复
小区面积：25平方米。
重复次数：4次。
3.3施药方法
3.3.1使用方法
植株页面喷雾，先处理试验药剂，从低浓度到高浓度一次喷雾，然后处理好力克药剂，换药时清洗喷雾器。
3.2.2施药器械
使用“合美”HM-16A型背负式电动喷雾器，工作压力位0.2-0.4MPa，中山合美电器有限公司生产”。
3.3.3施药时间和次数
本试验共计施药2次，分别在2012年9月8日和9月20日，水稻分别处于破口前3-5天和破口后5-7天。
3.3.4使用容量
施药量为750公斤/公顷。
3.3.5防治其他病虫害的药剂资料
试验前10天及试验期间没有进行其它病虫草害的药剂防治。
4调查、记录和测量方法
4.1气象及土壤资料
4.1.1气象资料
9月8日多云到阴午后雷阵雨，气温23.6℃-32.5℃，相对湿度46-88％；9月20日，多云，气温17.5℃-29.5℃，相对湿度39-72％，试验期间具体天气情况见气象资料表。
4.1.2土壤资料
土壤质地为水稻土壤，PH值6.6，有机质含量3.27％。
4.2调查方法、时间和次数
于2012年10月19日调查防治效果。
4.2.2调查方法
参照农业部药检所“GB-T 17980-2000农药田间药效试验准则(一)——杀菌剂防治水稻叶部病害”的规定进行。每小区5点取样，每点取200穗。根据稻穗为害症状成都分级，记录。调查分级标准如下：
0级：无病；
1级：每穗1个稻曲球；
3级：每穗3个稻曲球:；
5级：每穗3-5个稻曲球:；
7级：每穗6-9个稻曲球:；
9级：每穗10个或10个以上个稻曲球。
4.2.3药效计算方法
根据调查结果，按照下面(1)、(2)公式计算病情指数和防数，试验主数据采用邓肯式新复极差法(DMRT)进行统计分析。
式中：CK0--空白对照区施药前病情指数；
CK1--空白对照区施药后病情指数；
Pt0--药剂处理区施药前病情指数；
Pt1--药剂处理区施药后病情指数。
4.3对作物的直接影响
试验期间未被发现试验剂在所试剂量下对作物的影响。
4.4对其他生物的影响
4.4.1对其他病虫害的影响
未观察。
4.4.2对其他非靶标生物的影响
未观察。
5结果与分析
表2 10亿孢子/克解淀粉芽孢杆菌可湿粉剂防治水稻稻曲病田间药效试验结果
注：1、处理防效为各重复平均值；大写字母表示1％差异显著性，小写字母表示5％差异显著性。2、田间试验指数数据采用邓肯式新复极差法(DMRT)进行统计分析。
应用效果：本发明10亿孢子/克解淀粉芽孢杆菌可湿粉剂在剂量900-1500克/公顷(有效成分9000-15000亿孢子/公顷)剂量下对稻曲病具有较好的防效，与水稻破口前3-5天及破口后5-7天各施药一次，末次药后29天的防效为77.7％-88.1％，其1125克/公顷(有效成分75克/公顷)处理的防效相当。试验结果还显示，该药剂对水稻稻曲病的防治持效期在末次药后29天左右，试验结果见表2。
结论：本发明10亿孢子/克解淀粉芽孢杆菌(QZ-003H)用来防治水稻稻曲病。应在水稻破口前3-5天及破口后5-7天各施药1次，使用时应植株叶面喷雾，建议田间制剂使用量为900-1500克/公顷(有效成分9000-15000亿孢子/公顷)，兑水750公斤/公顷。
Claims (7)
1.解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株QZ-003H，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.11051。
2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H在防治水稻稻曲病中的用途。
3.一种含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H的生物防治制剂。
4.权利要求3所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)制备解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H的种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28-30℃下恒温培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养；
其中，步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，二者质量比为1：1.8；其中所述固料由质量比为60：40的玉米芯和麸皮组成；所述无机盐溶液的组分及质量百分比为：3.5％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，4％硫酸铵，剩余为水；
步骤(3)中的大量发酵培养基同固体培养基。
5.如权利要求4所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)将解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H的孢子移植到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28-30℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28-30℃下振荡培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至发酵培养基，室温28-30℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。
6.权利要求3所述的生物防治制剂在防治水稻稻曲病中的用途。
7.一种用于防治水稻稻曲病的方法，其特征是，向具有水稻稻曲病的水稻施用权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H或者权利要求4所述的生物防治制剂。
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