KR101137401B1 - 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 cs47 및 그의 배양액 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) CS47[수탁번호 : KCCM 11049P]에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 섬유소 분해 활성을 검정한 신균주 바실러스 아밀로리쿼파시엔스CS47[수탁번호 : KCCM 11049P]과 그의 배양액에 관한 것이다.
섬유소, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스
Description
본 발명은 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) CS47[수탁번호 : KCCM 11049P]에 관한 것이다.
최근 우리나라에서는 웰빙문화에 대한 관심이 높아지면서 건강에 관련된 식품문화가 발전하고 있으며 이에 힘입어 버섯 소비량이 증가하여 버섯 생산량도 증가하게 되었다. 버섯 생산량이 증가함에 따라 버섯 재배 후 발생하는 폐배지 발생량도 증가되었으며 이로 인해 버섯농가에서는 폐배지 처리에 어려움을 겪고 있다. 버섯을 재배하는 데 사용되는 버섯 배지의 원료는 버섯 종류 및 재배방식에 따라 다양하지만 옥수수 대(corn cob, 옥공이), 볏짚, 톱밥 등의 주원료에 미강, 밀기울, 비트펄프, 건비지 등을 첨가한 것으로 버섯 배지 원료 대부분이 사료 원료로 이용되고 있는 것들이다.
배지원료의 20% 정도는 버섯 재배 과정에서 버섯에 의해 이용되고 80% 정도는 폐배지에 잔존해 있기 때문에 버섯폐배지는 버섯농가에서는 폐기물에 불과하지라도 축산농가에서는 훌륭한 사료 자원이 될 수 있지만 다량의 섬유질을 포함하고 있어서 가축이 소화하기 어려운 점이 있다.
이에, 버섯 배지 또는 버섯 폐배지를 활용하기 위해서는 상기한 섬유소 등을 분해하여 소화가 용이하게 이루어지도록 할 필요가 있다.
본 발명은 말똥에서 분리한 신균주로서 섬유소 분해 활성을 가짐을 검정한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) CS47[수탁번호 : KCCM 11049P]를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 신균주 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) CS47[수탁번호 : KCCM 11049P]의 배양액과 이를 제조하는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명은, 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) CS47[수탁번호 : KCCM 11049P]를 제공한다.
상기한 목적을 달성하기 위한 다른 일례로서 본 발명은, 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 CS47[수탁번호 : KCCM 11049P]의 배양액을 포함한다.
상기한 목적을 달성하기 위한 다른 일례로서 본 발명은, 배양배지를 준비하는 단계; 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) CS47[수탁번호 : KCCM 11049P]를 배양하는 단계; 및, 상기 배양액을 수거하는 단계를 포함하여 이루어지는 배양액의 제조방법을 포함한다.
본 발명에 의하면, 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) CS47[수탁번호 : KCCM 11049P]를 제공할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.
또한, 상기 신균주 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 CS47의 섬유소 분해 활성을 이용한 다양한 용도를 제공할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 도면에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예 및 도면에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 신균주의 분리 및 동정
진주산업대학교 내 농장의 마구간에서 말똥을 채취하고, 여기에 살균수를 가 하여 희석한 다음 1% 트립토판 블루(tryptopan blue)와 0.5% CMC가 포함된 LB(Luria-Bertani) 배지에 도말하고 38 ℃에서 18 내지 24 시간동안 배양하여 단일 콜로니를 얻는 과정을 수차례 반복하여 순수 분리된 균주 CS47을 얻었다.
균주의 동정은 버지스 메뉴얼(Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology)에 준하여 이루어졌으며, 균주의 생리 및 생화학적 특성을 파악하기 위하여 바이오로그 자동 식별 시스템(BIOLOG automatic identification system, BIOlog Inc. 미국)과 바실러스 식별 키트(Bacillus ID kit, Microgen Bioproduct Ltd., 영국)를 이용하여 당 발효/이용성을 조사하였으며, 균체의 지방산 분석 (MIDI microbial identification system, MIDI Inc. 미국), 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하였다.
상기 CS47은 내생포자를 형성하는 그램양성의 간균으로 도 1 에 나타낸 바와 같이 크기는 1.4 X 0.7 ㎛, 배지상 콜로니의 형태는 가장자리 모양이 일정하지 않은 둥근 모양을 가지는 우윳빛 색의 세균이었다.
또한 섬유소 분해효소인 셀룰라아제(CMCase)외에 상기 CS47이 분비하는 만나아제(mannanase), 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase) 및 자일라나아제(xylanase)의 활성은 클리어존 형성 여부(클리어존의 크기에 따라 +++, ++, + 및 -로 기록)를 확인하여 그 결과는 다음 표 1 에 나타내었으며, 배지 사진은 도 2 에 나타내었다.
상기 CS47의 pH 및 온도에 따른 만나아제 활성은 도 3에 나타내었다. 도 3에 의하면 pH 6의 경우 만나아제 활성이 가장 우수함을 알 수 있고, 50 ℃에서의 만나 아제 활성이 가장 우수함을 알 수 있다. 이로 볼때 상기 CS47은 pH 5 내지 7, 30 내지 60 ℃에서의 활성이 가장 우수할 것으로 예측할 수 있다.
상기 CS47의 산소 요구성은 도 4에 나타내었다. 도 4에 의하면 상기 CS47은 혐기성 조건 보다 호기성 조건에서 성장이 우수할 것으로 예측할 수 있다.
또한 분리균주의 균체의 지방산 분석을 위해 MIDI(microbial identification system, MIDI Inc. 미국)을 사용한 결과, anteiso-15:0 (39.6%), 17:0 (7.6%), iso-15:0 (37.8%)로 나타났으며 이는 바실러스(Bacillus spp.)의 특성에 속하는 것이다.
바실러스 식별 키트(Bacillus ID kit, Microgen Bioproduct Ltd., 영국)를 이용한 당 발효/이용성 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5에 의하면, 상기 CS47은 아라비노스, 셀레비오스, 이노시톨, 만니톨, 만노스, 라피노스, 살리신, 소르비톨, 수크로스, 트레할로스, 자일로스, 메틸-D-만노사이드, 메틸-D-글루코사이드, 이눌린, 멜리지토스(melizitose), ONPG, 아르기닌, VP 및 니트레이트를 발효 또는 이용하여 산을 생성하는 것으로 나타났다. 반면, 람노스, 아도니톨, 갈락톳, 인돌, 시트레이트는 발효시키지 않는 것으로 나타났다.
상기 CS47의 BIOLOG 자동 식별 시스템(BIOLOG automatic identification system, BIOlog Inc. 미국)을 이용한 당 이용성 분석결과는 도 6에 나타내었다.
16S rDNA의 유전자 분석을 행한 결과는 도 7 및 서열번호 1 에 나타내었다. 이를 근거로 대조 균주와 비교하여 % 유사성(similarity)을 구한 결과, 상기 CS47은 바실러스(Bacillus) 속에 속하는 세균으로 판명되었으며 또한, 바실러스 아밀로 리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 표준균주와 99%의 유사도를 나타내었고, 네이버 조이닝 방법(Neighbor joining method)에 의하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성하고 그 결과를 도 8에 나타내었다. 이때 계통수의 스케일 바(scale bar)는 사이트당 0.01 치환(0.01 substitution per site)을 의미한다.
도 9에는 상기 CS47과 기존에 밝혀진 균주와의 상동성을 비교분석한 자료를 나타내었다. 도 9에 의하면 CS47의 16S rDNA 염기서열은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)의 16S rDNA 염기서열과 99%의 유사도를 나타내고 있다.
상기 CS47을 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 2009년 11월 05일자로 기탁하였으며, 수탁번호 KCCM 11049P를 부여받았다[도 10].
[표 1] 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) CS47[수탁번호 : KCCM 11049P]의 섬유소 분해활성
CMCase | mannanase | protease | amylase | xylanase | |
대장균 | - | - | - | - | - |
CS47 | ++ | ++ | +++ | +++ | ++ |
배양온도(℃) | 38 | ||||
배양시간(hrs) | 19 |
실시예 2. 신균주가 포함된 배양액의 제조
(1) 종균의 액상 배양
PCB(Plate count broth)를 이용하여 38℃에서 14시간 배양한 액상 종균을 배양한다.
(2) 농산가공부산물을 이용한 종균의 대량 배양
바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) CS47[수탁번호 : KCCM 11049P]의 대량생산을 위해 대두박 및 미강을 이용한 대량 배양을 통하여 균주를 생산하였다.
대두박과 미강의 혼합비율은 8 : 2로 하며 이때 균주의 성장을 촉진하기 위하여 당밀을 건물의 2%수준에서 첨가하였다. 액상배양된 종균을 5% 수준에서 농산가공부산물을 이용한 고상배지에 접종하고, 38℃ 배양기에서 48시간 진탕배양하여 배양액을 얻었다.
도 1은 본 발명의 신균주 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 CS47[수탁번호 : KCCM 11049P]의 투과전자현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 신균주의 섬유소 분해활성을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 신균주의 pH 및 온도에 따른 만나아제 상대 활성을 확인한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 신균주의 산소 요구성을 확인한 결과이다.
도 5는 바실러스 식별 키트를 이용한 본 발명의 신균주의 당 발효/이용성을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 신균주의 바이오로그 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 신균주의 16S rDNA 염기서열을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 신균주의 네이버 조이닝 법에 의하여 작성한 계통수를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 신균주의 16S rDNA 염기서열과 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)의 16S rDNA 염기서열의 유사도 비교를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 신균주의 수탁증이다.
<110> Jinju National University Industry-Academia Cooperation Foundation
<120> Cellulase-producing Bacillus amyloliquefaciens CS47 and its
culture fluid
<160> 1
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1616
<212> DNA
<213> Bacillus amyloquefaciens CS47
<400> 1
agangcaggn atgtaatacg actcactata gggcgagctc ggtacccggg cgaattccaa 60
gctttacggc taccttgtta cgacttcacc ccaatcatct gtcccacctt cggcggctgg 120
ctcctaaaag gttacctcac cgacttcggg tgttacaaac tctcgtggtg tgacgggcgg 180
tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt actagcgatt 240
ccagcttcac gcagtcgagt tgcagactgc gatccgaact gagaacagat ttgtgggatt 300
ggcttaacct cgcggttttg ctgccctttg ttctgtccat tgtagcacgt gtgtagccca 360
ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt gtcaccggca 420
gtcaccttag agtgcccaac tgaatgctgg caactaagat caagggttgc gctcgttgcg 480
ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac ctgtcactct 540
gcccccgaag gggacgtcct atctctagga ttgtcagagg atgtcaagac ctggtaaggt 600
tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcn cccgtcaatt 660
cctttgagtt tcagtcttgc gaccgtactc cccaggcgga gtgcttaatg cgttagctgc 720
agcactaagg ggsggggaaa ccccctaaca ctcagcactc atcgtttacg gcgtggacta 780
ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc ctcagcgtca gttacagacc 840
agagagtcgc cttcgccact ggtgtttcct ccacatctct acgcatttca ccgctacacg 900
tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt ttccaatgac cctccccggn 960
tgngccgggg gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg cgagcccttt acgcccaata 1020
attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg 1080
gctttctggt taggtaccgt caaggtgccg ccctatttga acggcacttg ttcttcccta 1140
acaacagagc tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct ccgtcagact 1200
ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca 1260
gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca tcgtcgcctt ggtgagccgt 1320
tacctcacca actagctaat gcgccgcggg tccatctgta agtggtagcc gaagccacct 1380
tttatgtctg aaccatgcgg ttcaaacaag catccggtat tagccccggt ttcccggagt 1440
tatcccagtc ttacaggcag gttacccacg tgttactcac ccgtccgccg ctaacatcag 1500
ggagcaagct cccatctgtc cgctcgactt gcatgtatta ggcacgccgc cagcgttcgt 1560
cctgagccag gatcaaactc tccgagatct ggatcccctc agagtcgacn gnggng 1616
Claims (3)
- 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) CS47[수탁번호 : KCCM 11049P].
- 청구항 1의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 CS47[수탁번호 : KCCM 11049P]의 배양액.
- 배양배지를 준비하는 단계;상기 배양배지에 청구항 1의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) CS47[수탁번호 : KCCM 11049P]를 배양하여 배양액을 제조하는 단계; 및상기 배양된 배양액을 수거하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 배양액의 제조방법.
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