KR20190043989A - 음식물쓰레기 분해 혼합균주 및 이를 이용한 음식물쓰레기 분해 방법 - Google Patents

음식물쓰레기 분해 혼합균주 및 이를 이용한 음식물쓰레기 분해 방법 Download PDF

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    • B09B—DISPOSAL OF SOLID WASTE
    • B09B3/00—Destroying solid waste or transforming solid waste into something useful or harmless

Abstract

본 발명은 따른 음식물쓰레기 분해 혼합균주 및 이를 이용하여 음식물쓰레기 분해 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JIF17623(기탁번호 KCTC18643P), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) JIF117714(기탁번호 KCTC18636P), 바실러스 샴(Bacillus siamensis) JIF17807(기탁번호 KCTC18641P), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) JIF17775(기탁번호 KCTC18638P), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) JIF17801(기탁번호 KCTC18639P), 바실러스 스트라토스피러스튜스(Bacillus stratoshericus) JIF17796(기탁번호 KCTC18642P), 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai) JIF17682(기탁번호 KCTC18637P) 및 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) JIF17718(기탁번호 KCTC18640P) 균주를 포함하고, 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제 및 프로테아제 효소활성 및 내염성을 가지고 고온에서 서식 가능한 음식물쓰레기 분해 활성이 우수한 음식물쓰레기 분해 혼합균주를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 음식물쓰레기 분해 방법은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JIF17623(기탁번호 KCTC18643P), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) JIF117714(기탁번호 KCTC18636P), 바실러스 샴(Bacillus siamensis) JIF17807(기탁번호 KCTC18641P), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) JIF17775(기탁번호 KCTC18638P), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) JIF17801(기탁번호 KCTC18639P), 바실러스 스트라토스피러스튜스(Bacillus stratoshericus) JIF17796(기탁번호 KCTC18642P), 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai) JIF17682(기탁번호 KCTC18637P) 및 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) JIF17718(기탁번호 KCTC18640P) 균주를 포함하는 혼합균주를 사용하여 음식물쓰레기 분해할 수 있다.

Description

음식물쓰레기 분해 혼합균주 및 이를 이용한 음식물쓰레기 분해 방법{Mixed strain for decomposing food waste and Decomposition method for food waste using same}
본 발명은 음식물쓰레기 분해 혼합균주 및 이를 이용한 음식물쓰레기 분해 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 전통발효식품 및 토양을 이용하여 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제 및 프로테아제 효소활성을 가지고 내염성이 우수하고 고온에서 서식할 수 있으며, 음식물쓰레기 분해력이 우수한 음식물쓰레기 분해 혼합균주 및 이를 이용한 음식물쓰레기 분해 방법에 관한 것이다.
국내 음식물쓰레기는 수분 함량과 유기물 함량이 80%이상으로 매우 높고, 염도가 높아서 저장, 수거 및 운송 과정에서 쉽게 부패하여 악취와 침출수 등의 심미적 악영향으로 주거단지 내에서 쾌적성 저해 요인으로 작용하고 있다.
따라서, 발생원에서부터 원천적으로 음식물쓰레기의 적정 처리에 대한 효과적 기술 개발 필요성이 증대되고 있으며, 공동주택에서 발생하는 음식물쓰레기는 발생량, 성상이 거의 일정하여 생물학적 처리 후 활용이 용이하여 유용한 에너지 자원으로 기대되고 있다.
또한, 국내외 폐기물 처리 및 자원화 시설들은 감량화/자원화 방식으로 주로 대형·집중형 형태로 운영되고 있으나 다양한 기술적·사회적·경제적 한계를 내포하고 있다. 음식물 종량제 추진 등 다양한 정책이 추진되고 있으나 자원순환 인식 및 실천부족으로 효과는 미미한 수준이다.
음식물쓰레기는 발열량이 낮고 수분 함량이 높아 소각 처리에 부적합해 과거 상당량을 매립에 의존하였으나 악취 및 침출수 등에 의한 2차 오염과 쓰레기 매립지의 사용 단축 등의 문제로 2005년부터 음식물 매립이 전면 금지되었다.
또한, 런던 협약으로 인해 2013년부터 폐기물의 해양 투기가 전면 금지됨에 따라 음식물쓰레기 처리를 위한 새로운 방법의 개발이 크게 요구된다.
음식물쓰레기를 효율적으로 처리하면서 2차 오염의 발생을 최소화할 수 있는 방법으로 미생물을 이용한 소멸화 방식이 있다.
이러한 미생물을 이용한 소멸화 처리 방법은 투입된 음식물을 호기적 조건 및 적합한 공정 하에 짧은 시간 내에 발효시킴으로써 음식물 폐기물의 양을 크게 감소시키고 기존 처리 방법의 문제로 지적된 2차 환경 오염도 최소화하여 현재 음식물쓰레기 처리를 위한 가장 합리적인 대안이라 할 수 있다.
이러한 미생물을 이용한 소멸화 처리 방법은 생물학적 환경이 적절하게 조절된 장치 내에서 미생물의 대사 활동에 의해 음식물쓰레기의 유기물을 물과 탄산가스로 분해하여 대기 중으로 휘발시키는 처리공정을 갖는다.
호기적 조건을 확보한 상태의 적절한 공정 조건 하에서, 발효조 내에 음식물을 연속적으로 투입하여 음식물 내의 수분(70~85%)을 증발시키고 유기물 성분(약 12~13%)이 장치 밖으로 배출되어 지속적으로 질량의 증가가 거의 없게 유지된다.
현재 국내에서 음식물쓰레기 처리 방식에 이용되는 미생물로는 세균인 바실러스류(Bacillus), 방선균류(Actinomycetes), 슈도모나스류(Pseudomonas), 곰팡이인 페니실리움(Penicillium), 리조푸스(Rhizopus), 효모인 피치아(Pichia) 등이 있다. 이들 미생물은 음식물 소멸 능력 및 탈취력이 우수하다고 판단되어 이용된 미생물이다.
그러나 이들 미생물의 물질분해능력이 충분하지 않으며, 단독으로 사용할 경우 음식물쓰레기 소멸장치내의 환경변화에 따른 접종균주의 사멸, 투입하지 않은 미생물의 우점 등에 의하여 처리효율이 감소하고 악취가 발생하는 등의 문제점이 있는 것으로 밝혀졌다.
예를 들어, 방선균류는 탄수화물, 섬유소 등 탄소성 물질의 분해 능력이 높고, 땅 냄새를 주는 지오스민(geosmin)과 같은 화합물을 생성하여(Parker, 2001) 음식물쓰레기 처리시 악취를 저감할 수 있지만 반면에 번식 속도가 느려 접종한 미생물이 쉽게 유실되고 단백질 성분의 분해 능력이 비교적 낮아 암모니아성 및 황화수소성 악취를 유발할 가능성이 높다는 단점이 있다.
따라서, 다양한 미생물을 포함하는 혼합균주를 사용할 경우, 이러한 한 가지 미생물의 단점을 상호 보완하고 음식물쓰레기 처리의 효율을 향상시킬 수 있을 것이다.
음식물쓰레기 처리를 위한 단일 미생물 사용의 문제점을 해결하기 위해 대한민국 특허 제10-1161670호에서 음식물쓰레기 처리용 혼합균주 및 이를 이용한 음식물쓰레기 처리 방법을 제안하였다. 그러나 이러한 혼합균주 역시 바실러스류(Bacillus)에 포함되는 세균으로 3종만 포함되어 있으며 음식물쓰레기 처리시 환경인 높은 온도와 염분도, 낮은 pH에서 미생물의 성장과 활성이 부족한 문제점이 있다.
상기와 같은 문제를 해결하고자, 본 발명은 전통발효식품 및 토양을 이용하여 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제 및 프로테아제 효소활성을 가지고 내염성이 우수하고 고온에서 서식할 수 있으며, 음식물쓰레기 분해력이 우수한 음식물쓰레기 분해 혼합균주 및 이를 이용한 음식물쓰레기 분해 방법을 제공하는데 있다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해서, 본 발명의 실시예에 따른 음식물쓰레기 분해 혼합균주는, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JIF17623(기탁번호 KCTC18643P), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) JIF117714(기탁번호 KCTC18636P), 바실러스 샴(Bacillus siamensis) JIF17807(기탁번호 KCTC18641P), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) JIF17775(기탁번호 KCTC18638P), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) JIF17801(기탁번호 KCTC18639P), 바실러스 스트라토스피러스튜스(Bacillus stratoshericus) JIF17796(기탁번호 KCTC18642P), 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai) JIF17682(기탁번호 KCTC18637P) 및 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) JIF17718(기탁번호 KCTC18640P) 균주를 포함하고, 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제 및 프로테아제 효소활성 및 내염성을 가지고 고온에서 서식 가능한 음식물쓰레기 분해 활성이 우수한 음식물쓰레기 분해 혼합균주를 제공할 수 있다.
또한, 상기 혼합균주는 온도범위 30 내지 60℃, pH 3 내지 11, 염농도 5%까지 생육 가능한 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 혼합균주는 생육 최적 조건이 온도 30℃, pH 범위 5 내지 7인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 음식물쓰레기 분해 방법은, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JIF17623(기탁번호 KCTC18643P), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) JIF117714(기탁번호 KCTC18636P), 바실러스 샴(Bacillus siamensis) JIF17807(기탁번호 KCTC18641P), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) JIF17775(기탁번호 KCTC18638P), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) JIF17801(기탁번호 KCTC18639P), 바실러스 스트라토스피러스튜스(Bacillus stratoshericus) JIF17796(기탁번호 KCTC18642P), 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai) JIF17682(기탁번호 KCTC18637P) 및 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) JIF17718(기탁번호 KCTC18640P) 균주를 포함하는 혼합균주를 사용하여 음식물쓰레기 분해할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 음식물쓰레기 분해 혼합균주는 탄수화물, 단백질, 섬유소, 지방질 모두를 분해하는 효소의 생산력 및 활성도가 높아서 음식물쓰레기의 소멸화 정도가 매우 높은 효과가 있다.
또한, 음식물의 용해성 부분 및 비용해성 부분 모두에 대하여 분해력이 우수하고, 고염분 농도하에서도 생육이 가능하며, 음식물로부터 발생하는 취기의 억제력이 우수하며, 내열성, 내산성, 내염기성이어서 우리나라 음식물을 발효 소멸시키는데 매우 유용한 효과가 있다.
도 1a 내지 도 1h는 선별된 균주를 동정 분석 결과데이터.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 혼합균주의 생육활성도를 나타낸 그래프.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 혼합균주의 시간별 생장곡선에 따른 효소활성도를 나타낸 그래프.
도 4a 내지 도 4c는 본 발명의 실시예에 따른 혼합균주의 온도에 따른 효소활성도를 나타낸 그래프로, 도 4a는 Protease, 도 4b는 Amlyase, 도 4c는 Cellulase에 대한 활성도.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 혼합균주의 pH에 따른 효소활성도를 나타낸 그래프
도 6은 혼합균주의 음식물쓰레기 분해 정도 평가 결과 그래프.
본 발명에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 또한, 이하에서 기재되는 "포함하다", "구비하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것으로 해석되어야 하며, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
여기서, 반복되는 설명, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능, 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다. 본 발명의 실시형태는 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
본 발명은 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제 및 프로테아제 효소활성을 가지고 내염성이 우수하고 고온에서 서식할 수 있으며, 음식물쓰레기 분해력이 우수한 음식물쓰레기 분해 혼합균주 및 이를 이용한 음식물쓰레기 분해 방법을 제공하는데 있다.
이러한 본 발명의 신균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JIF17623(기탁번호 KCTC18643P), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) JIF117714(기탁번호 KCTC18636P), 바실러스 샴(Bacillus siamensis) JIF17807(기탁번호 KCTC18641P), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) JIF17775(기탁번호 KCTC18638P), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) JIF17801(기탁번호 KCTC18639P), 바실러스 스트라토스피러스튜스(Bacillus stratoshericus) JIF17796(기탁번호 KCTC18642P), 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai) JIF17682(기탁번호 KCTC18637P) 및 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) JIF17718(기탁번호 KCTC18640P) 균주는 본 발명에서 최초로 분리 동정된 것으로, 전통발효식품 및 토양에 내생하고 있는 미생물을 배양법에 기초하여 처음으로 분리 동정하였다.
이하 전통발효식품 및 토양에서 신균주를 동정하기 위한 방법 및 혼합균주의 음식물쓰레기의 분해능에 대하여 실시예를 중심으로 설명한다.
1. 유용 균주 분리 및 선별
내염성이 우수하고 고온에서 서식할 수 있는 음식물쓰레기의 분해가 가능한 균주를 분리하기 위하여 전통발효식품(고추장, 된장, 젓갈), 토양(갯벌, 모래)으로부터 시료 채취하였다.
채취한 시료 10g을 각각 멸균된 증류수에서 24 시간동안 침지시킨 후 nutrient agar 배지에 도말하여 30℃에서 24 시간동안 배양. 24 시간 후 배지에 나타난 colony의 크기와 형태에 따라 서로 다른 colony를 선별하여 각각 nutrient agar 배지에 옮겨 배양하였다.
이때, nutrient agar 배지는 내염성 및 내열성을 갖는 유용 균주를 확보하기 위하여 nutrient agar 배지 제조시 Nacl을 0%, 3%, 5% 농도로 첨가하여 염분의 농도를 달리한 배지이며, 각각 30℃, 40℃, 50℃에서 24 시간 동안 배양하였다.
이에 따라 염분의 농도를 달리한 배지에서의 균주의 성장을 확인하였고, 스크리닝 된 균주의 수 및 정보는 다음 표 1 내지 표 10과 같다.
Figure pat00001
<전통발효식품 및 토양으로부터 분리된 균주의 스크리닝 수>
Figure pat00002
<전통발효식품 및 토양으로부터 분리된 균주 정보(Nacl 0%, 30℃ 배양)>
Figure pat00003
<전통발효식품 및 토양으로부터 분리된 균주 정보(Nacl 0%, 40℃ 배양)>
Figure pat00004
<전통발효식품 및 토양으로부터 분리된 균주 정보(Nacl 0%, 50℃ 배양)>
Figure pat00005
<전통발효식품 및 토양으로부터 분리된 균주 정보(Nacl 3%, 30℃ 배양)>
Figure pat00006
<전통발효식품 및 토양으로부터 분리된 균주 정보(Nacl 3%, 40℃ 배양)>
Figure pat00007
<전통발효식품 및 토양으로부터 분리된 균주 정보(Nacl 3%, 50℃ 배양)>
Figure pat00008
<전통발효식품 및 토양으로부터 분리된 균주 정보(Nacl 5%, 30℃ 배양)>
Figure pat00009
<전통발효식품 및 토양으로부터 분리된 균주 정보(Nacl 5%, 40℃ 배양)>
Figure pat00010
<전통발효식품 및 토양으로부터 분리된 균주 정보(Nacl 5%, 50℃ 배양)>
2. 유용 균주의 효소활성 평가
분리된 균주의 효소활성 유무를 확인하기 위하여 우리나라 음식물쓰레기의 염분농도는 평균 3%로써 그 이상의 농도에서 성장 가능한 균주는 음식물쓰레기 분해 균주로 활용이 가능하다고 판단하여 스크리닝 된 미생물 중 Nacl 5% 첨가된 NA 배지에서 성장한 균주만을 효소활성 평가에 이용하였다.
분리된 균주의 효소활성 유무를 확인하기 위하여 Amylase, Cellulase, Lipase, Protease 활성을 조사하였다.
효소활성이 높은 균주를 선별하기 위해 paper disc(Advantec, Japan) 방법을 이용하며, 각 효소와 특이적으로 반응하는 기질성분이 포함된 고체 선별배지 사용하였다.
Amylase 활성은 starch agar(0.3% Beef Extract, 1% soluble starch, 1.2% agar) 배지(Difco, USA)에 6mm paper disc를 올리고 각 균주 배양액을 5 uL씩 분주하여 30℃에서 48시간 배양한 뒤 lugo solution(Sigma, Swizerland)으로 염색하고 분해능을 억제환(clear zone)의 직경으로 조사하였다.
Cellulase 활성은 1% CMC가 포함된 agar 배지에 6mm paper disc를 올리고 각 균주 배양액을 5 uL씩 분주하여 30℃에서 48시간 배양한 뒤 0.1% congo red로 30분간 염색하고 1N Nacl로 세척한 뒤 나타난 억제환의 직경으로 조사하였다.
Lipase 활성은 1% tween 80이 포함된 spirit blue agar 배지에 6mm paper disc를 올리고 각 균주 배양액을 5 uL씩 분주하여 30℃에서 48시간 배양한 뒤 분해능을 억제환의 직경으로 조사하였다.
Protease 활성은 1% skim milk(Difco, USA)가 첨가된 agar 배지에 6mm paper disc를 올리고 각 균주 배양액을 5 uL씩 분주하여 30℃에서 48시간 배양한 뒤 분해능을 억제환의 직경으로 조사하였다.
유용균주 중 효소활성이 있는 균주를 선별하기 위해 이용한 paper disc 방법의 결과로서 배양 후 나타나는 disc 주위의 억제환 크기를 측정하여 0-10mm는 +, 10-15mm는 ++, 15-20mm는 +++, 20-25mm는 ++++, 25-30mm는 +++++로 표시하였다.
표 11 내지 표 13에 도시된 바와 같이, Nacl 5% 첨가된 배지로부터 전통발효식품(된장, 고추장, 젓갈)에서 분리한 159균주 중 Amylase 활성을 보이는 균주는 105균주, Protease 활성을 보이는 균주는 141균주, Lipase 활성을 보이는 균주는 153균주, Cellulase 활성을 보이는 균주는 127균주로서 4가지 효소 모두 활성을 띄며 억제환이 15mm 이상의 크기를 지닌 균주를 선별한 결과 총 55종으로 나타났다.
또한, 토양으로부터(갯벌, 모래) 분리된 균주는 53종으로서 Amylase 활성을 보이는 균주는 17균주, Protease 활성을 보이는 균주의 23균주, Lipase 활성을 보이는 균주는 22균주, Cellulase 활성을 보이는 균주는 11균주로 나타났고, 이 중 2가지 이상 활성을 띄며 억제환이 15mm이상의 크기를 지닌 균주를 선별한 결과 총 24종으로 나타났다.
Figure pat00011
<전통발효식품 및 토양으로부터 분리된 균주의 효소활성 평가(30℃)>
Figure pat00012
<전통발효식품 및 토양으로부터 분리된 균주의 효소활성 평가(40℃)>
Figure pat00013
<전통발효식품 및 토양으로부터 분리된 균주의 효소활성 평가(50℃)>
이에 따라, 전통발효식품으로부터 분리된 균주 중 (+) 4개 이상 및 4가지 효소활성을 갖는 균주, 토양으로부터 분리된 균주 중 (+) 4개 이상 및 2가지 이상의 효소활성을 갖는 균주를 선별하였다.
3. 균주 동정 결과
선별된 전통발효식품으로부터 분리된 균주 중 (+) 4개 이상 및 4가지 효소활성을 갖는 균주, 토양으로부터 분리된 균주 중 (+) 4개 이상 및 2가지 이상의 효소활성을 갖는 균주의 16S rRNA 염기서열 분석을 한 다음 이 결과를 NCBI의 BLAST와 비교하여 균주 동정을 실시하였다.
그 결과 하기 표 14 및 표 15에 나타난 바와 같다.
Figure pat00014
Figure pat00015
표 15 에 도시된 바와 같이, JIF17623(Bacillus subtilis, 99% 일치), JIF17714(Bacillus amyloliquefaciens, 99% 일치), JIF17807(Bacillus siamensis, 99% 일치), JIF17775(Bacillus licheniformis, 98% 일치), JIF17801(Bacillus megaterium, 99% 일치), JIF17796(Bacillus stratoshericus, 97% 일치), JIF17682(Bacillus aryabhattai, 99% 일치) 및 JIF17718(Bacillus safensis, 97% 일치)를 최종적으로 선발하였다.
여기서, 선발된 균주는 30 내지 60℃에서 염농도와 상관없이 배양이 가능하였으나, JIF17668(Bacillus aquimaris, 98% 일치), JIF17748(Bacillus koreensis, 99% 일치), JIF17799(Marinobacter hydrocarbonoclasticus, 98% 일치)는 추후 Nacl 5%, 50℃에서만 성장하고, 배양시 콜로니 형성은 되었으나 육안으로 균주가 거의 자라나지 않는 것을 확인하여 선발에서 제외하였다.
도 1a 내지 도 1h는 JIF17623, JIF17714, JIF17807, JIF17775, JIF17801, JIF17796, JIF17682 및 JIF17718의 동정 분석 결과 데이터이다.
선발된 균주의 동정 균주명은 JIF17623은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), JIF17714는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens), JIF17807은 바실러스 샴(Bacillus siamensis), JIF17775는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), JIF17801은 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), JIF17796은 바실러스 스트라토스피러스튜스(Bacillus stratoshericus), JIF17682는 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai) 및 JIF17718은 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) 이다.
본 발명의 JIF17623은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JIF17623 균주로 명명되었고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 KCTC(Korean Collection for Type Cultures) 생물자원센터에 2017년 11월 28일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC18643P이다.
본 발명의 JIF117714는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) JIF117714 균주로 명명되었고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 KCTC(Korean Collection for Type Cultures) 생물자원센터에 2017년 11월 28일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC18636P이다.
본 발명의 JIF17807는 바실러스 샴(Bacillus siamensis) JIF17807 균주로 명명되었고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 KCTC(Korean Collection for Type Cultures) 생물자원센터에 2017년 11월 28일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC18641P이다.
본 발명의 JIF17775는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) JIF17775로 명명되었고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 KCTC(Korean Collection for Type Cultures) 생물자원센터에 2017년 11월 28일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC18638P이다.
본 발명의 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) JIF17801로 명명되었고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 KCTC(Korean Collection for Type Cultures) 생물자원센터에 2017년 11월 28일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC18639P이다.
본 발명의 JIF17796는 바실러스 스트라토스피러스튜스(Bacillus stratoshericus) JIF17796로 명명되었고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 KCTC(Korean Collection for Type Cultures) 생물자원센터에 2017년 11월 28일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC18642P이다.
본 발명의 JIF17682는 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai) JIF17682로 명명되었고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 KCTC(Korean Collection for Type Cultures) 생물자원센터에 2017년 11월 28일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC18637P이다.
본 발명의 JIF17718는 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) JIF17718로 명명되었고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 KCTC(Korean Collection for Type Cultures) 생물자원센터에 2017년 11월 28일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC18640P이다.
따라서, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JIF17623(기탁번호 KCTC18643P), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) JIF117714(기탁번호 KCTC18636P), 바실러스 샴(Bacillus siamensis) JIF17807(기탁번호 KCTC18641P), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) JIF17775(기탁번호 KCTC18638P), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) JIF17801(기탁번호 KCTC18639P), 바실러스 스트라토스피러스튜스(Bacillus stratoshericus) JIF17796(기탁번호 KCTC18642P), 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai) JIF17682(기탁번호 KCTC18637P) 및 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) JIF17718(기탁번호 KCTC18640P) 균주를 포함하는 혼합균주이다.
상기에서 설명한 바와 같이, 8종의 균주를 포함하는 음식물쓰레기 분해 혼합균주는 탄수화물, 단백질, 섬유소, 지방질 모두를 분해하는 효소의 생산력 및 활성도가 높아서 음식물쓰레기의 소멸화 정도가 매우 높다.
또한, 음식물의 용해성 부분 및 비용해성 부분 모두에 대하여 분해력이 우수하고, 고염분 농도하에서도 생육이 가능하며, 음식물로부터 발생하는 취기의 억제력이 우수하며, 내열성, 내산성, 내염기성이어서 우리나라 음식물을 발효 소멸시키는데 매우 유용한 효과가 있다.
4. 선발균주의 최적 생육조건 확립
전통발효식품(된장, 고추장, 젓갈), 토양(갯벌, 모래)으로부터 분리된 균주의 미생물 동정 결과에 따라, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JIF17623, 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) JIF117714, 바실러스 샴(Bacillus siamensis) JIF17807, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) JIF17775, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) JIF17801, 바실러스 스트라토스피러스튜스(Bacillus stratoshericus) JIF17796, 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai) JIF17682 및 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) JIF17718 균주의 8종 균주를 최종적으로 선발하였다.
NA Plate에 stock 중인 균주 8종에 대하여 1 백금이를 취하여 5mL Nutrient Broth 배지에 접종 후 24시간동안 배양하여 혼합하였다. 8종이 혼합된 혼합균주를 1% 접종 후 30℃에서 48hr 동안 배양하면서 600nm에서 흡광도를 측정하여 균주의 성장을 측정하였다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 혼합균주의 생육활성도를 나타낸 그래프로, 도 2에 도시된 바와 같이, NB 배지상에서 배양한 결과, 접종 후 36시간이 지난 시점에서 총 균주가 최대로 검출되었으며, 12시간에서 36시간까지는 log phase 단계를 보였으며, 36시간에서 48시간 까지는 stationary phase를 유지하다가 48시간 이후 decline phase로 되는 경향을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 혼합균주의 생장곡선을 확인한 결과 30℃, 200rpm으로 접종 후 36시간에서 48시간의 시점을 stationary phase(OD값 약0.8)로서 최적의 배양조건임을 확인하여 본 배양 접종시기로 설정하였다.
1) 생장곡선에 따른 효소활성 평가
균주의 생장에 따른 혼합균주의 효소활성도를 확인해보기 위하여, 균주의 생육 흡광도 측정시(12hr 마다) Amlyase, Cellulase, Protease의 활성을 각각 평가하였다.
효소활성이 높은 균주를 선별하기 위해 paper disc(Advantec, Japan) 방법을 이용하였고, 각 효소와 특이적으로 반응하는 기질성분이 포함된 고체 선별배지 사용하였다. 여기서, Amlyase, Cellulase, Protease 활성 조사는 유용 균주의 효소활성 평가와 동일하게 하였다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 혼합균주의 시간별 생장곡선에 따른 효소활성도를 나타낸 그래프로, 도 3에 도시된 바와 같이, NB 배지상에서 시간별 생장에 따른 효소활성 평가 결과 24hr에 Protease, Amylase, Cellulase의 활성도가 가장 높았으며, 이후 점점 감소하였음을 확인할 수 있었다.
2) 온도에 다른 효소활성 평가
온도에 따른 혼합균주의 효소활성도를 확인해보기 위하여, 48hr 동안 12시간 마다 Amlyase, Cellulase, Protease의 활성을 각각 평가하였다.
NA Plate에 stock 중인 균주 8종에 대하여 1 백금이를 취하여 5mL Nutrient Broth 배지에 접종 후 24시간동안 배양하여 혼합하였다. 8종이 혼합된 혼합균주를 1% 접종 후 30℃, 40℃, 50℃, 60℃에서 36hr 동안 배양하였다.
평가 방법은 생장곡선에 따른 효소활성 평가와 동일하게 하였다.
도 4a 내지 도 4c는 본 발명의 실시예에 따른 혼합균주의 온도에 따른 효소활성도를 나타낸 그래프로, 도 4a는 Protease, 도 4b는 Amlyase, 도 4c는 Cellulase에 대한 활성도이다.
도 4a 내지 도 4c에 도시된 바와 같이, NB 배지상에서 온도에 따른 효소활성 평가 결과 50℃, 60℃에서 배양된 혼합균주보다 30℃, 40℃에서 배양된 혼합균주에서 더 높은 활성을 띄었음을 확인하였으며, 이 중 30℃에서 가장 높은 활성을 띄는 것으로 보아 30℃가 생육최적온도임을 확인할 수 있었다.
3) pH에 따른 효소활성 평가
배지의 pH 조성에 따른 혼합균주의 효소활성도를 확인해보기 위하여, Amlyase, Cellulase, Protease의 활성을 각각 평가하였다.
NA Plate에 stock 중인 균주 8종에 대하여 1 백금이를 취하여 5mL Nutrient Broth 배지에 접종 후 24시간동안 배양하여 혼합하였다. NB 배지의 pH를 3, 5, 7, 9, 11로 맞춘 후 8종이 혼합된 혼합균주를 1% 접종하여 30℃에서 36hr 동안 배양하였다.
평가 방법은 생장곡선에 따른 효소활성 평가와 동일하게 하였다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 혼합균주의 pH에 따른 효소활성도를 나타낸 그래프로, 도 5에 도시된 바와 같이, NB 배지상에서 pH에 따른 효소활성 평가 결과 pH5, pH7에서 배양된 혼합균주가 다른 pH상에서 배양된 혼합균주보다 더 높은 활성을 띄었으며, 이에 따라 pH5 내지 pH7의 배지가 혼합균주의 생육최적 pH 조건임을 확인할 수 있었다.
5. 혼합균주의 제조
상기의 생육 최적조건을 고려하여 혼합균주를 제조하였다.
NA Plate에 stock 중인 균주 8종에 대하여 1 백금이를 취하여 5mL Nutrient Broth 배지에 접종 후 30℃에서 24시간동안 200rpm으로 배양하여 혼합하는 것으로 혼합균주를 제조하였다. 이때, Nutrient Broth 배지의 pH는 7이다.
상기 균주 8종은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JIF17623, 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) JIF117714, 바실러스 샴(Bacillus siamensis) JIF17807, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) JIF17775, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) JIF17801, 바실러스 스트라토스피러스튜스(Bacillus stratoshericus) JIF17796, 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai) JIF17682 및 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) JIF17718이다.
이때, Nutrient Broth 배지는 일반적으로 사용되는 영양배지일 수 있고, 다른 예로 당밀배지일 수 있다.
대두분리단백질(isolated soy protein)의 단백질의 함량은 약 90%며, 글로불린을 가장 많이 함유하고 있다. 농축대두단백, 조직상대두단백과 함께 대표적인 대두단백식품 중의 하나이다. 이러한 당밀배지는 당밀배지 100중량부를 기준으로, 당밀 40 내지 50중량부, 대두박단백질 40 내지 50중량부 및 물 600 내지 800중량부가 함유될 수 있다. 이때, pH는 7로 조절한다.
이와 같은 Nutrient Broth 배지를 이용하여 혼합균주의 성장을 더 촉진할 수 있다.
여기서, 당밀, 대두분리단백질이 상기 범위보다 미만이거나 초과할 경우 활성 촉진 효과가 미미할 수 있다.
즉, 본 발명의 혼합균주는 생육가능한 생존 온도 범위가 30 내지 60℃이고, pH 3 내지 11에서 생존 가능하여 생존 가능한 온도 및 pH가 넓고, 염분 5%까지 생존 가능하고, 생육최적조건은 온도 30℃, pH 5 내지 7에서 높은 활성을 보이며, 아밀라아제, 셀룰라아제, 프로테아제 및 리파아제의 효소 활성이 높아 음식물의 용해서 부분 및 비용해성 부분 모두에 대하여 분해력이 우수하고, 고염분 농도하에서 생육이 가능하며, 음식물로 발생하는 취기를 저하시키고, 우리나라 음식물을 발효 소멸 시키는데 유용한 내열성, 내산성, 내염기성 균주이다.
이하, 상기에서 설명한 실시예를 실험예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 반드시 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실험예 1] 음식물쓰레기 분해 정도 평가 1
상기에서 선별된 8종 균주를 포함하고 30℃, 200rpm으로 배양된 혼합균주 400mL를 음식물쓰레기 잔반에 투입 후 음식물쓰레기 분해 정도를 평가하였다.
음식물쓰레기 1Kg을 분쇄한 후 11종의 혼합균주 400mL를 72시간동안 교반 분해시키고, 분해의 정도를 알아보기 위해 24시간마다 무게를 측정하였다.
하기 표 16을 보면 알 수 있듯이, A Type 및 B Type은 동일한 조건으로 하였고, A Type은 대조군으로 균주 첨가 없이 건조 시켰으며, B는 혼합균주를 투입 후 장치내에서 분해 정도를 평가하였다.
Figure pat00016
<식물쓰레기 분해 현장 실증 실험 조건>
상기 실험예에 따른 음식물쓰레기 분해 정도를 평가한 결과는 도 6과 같다.
도 6에 도시된 바와 같이, A는 24시간동안 862g, 48시간동안 740g, 72시간동안 641g으로 감소되었음을 확인할 수 있었다.
또한, B는 24시간동안 639g으로, 48시간동안 309g으로 72시간동안 212g으로 감소되었음을 확인할 수 있었다.
따라서, 8종의 혼합균주의 음식물쓰레기의 우수한 분해능을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 2] 음식물쓰레기 분해 정도 평가 2
본 발명의 8종을 포함하는 혼합균주의 음식물쓰레기 분해 정도를 검증하기 위하여 다음과 같은 시험을 실시하였다.
교반기, 온도조절장치 및 팬이 부착된 총 용량 30리터의 소멸장치에 본 발명의 혼합균주와, 종래의 3종을 포함하는 혼합균주(KCTC 11585BP)에 매일 1kg의 음식물을 투입하면서 발효를 진행하였다.
12일간의 발효기간 동안 온도는 30℃, 교반주기는 시간당 5분, 교반속도는 분당 5회전으로 하였으며, 3일 간격으로 취기와 소멸율을 측정하였고 그 결과는 하기 표 17과 같다.
균주 3일 6일 9일 12일 취기
혼합균주 68% 70% 73% 75% 양호
KCTC 11585BP 60% 60.8% 61% 62% 다소 있음
상기 표 17에서 알 수 있듯이, 8종을 포함하는 혼합균주가 3종을 포함하는 혼합균주(KCTC 11585BP)보다 음식물 쓰레기 분해능 및 취기 저하 효과가 우수한 것을 확인 할 수 있었다.
[ 실험예 3] 배지에 따른 성장 평가
배지에 따른 성장 정도를 평가하기 위해 하기 실시예 1 및 2의 성장률을 측정하였다.
실시예 1: 상기에서 선별된 NA Plate에 stock 중인 균주 8종에 대하여 1 백금이를 취하여 5mL Nutrient Broth 배지에 접종 후 30℃에서 24시간동안 200rpm으로 배양하여 혼합하는 것으로 혼합균주를 제조하였다. 이때, Nutrient Broth 배지의 pH는 7이고, 일반적으로 사용되는 Nutrient Broth 배지.
실시예 2: 일반적으로 사용되는 Nutrient Broth 배지가 아닌 당밀배지 100중량부를 기준으로, 당밀 40 내지 50중량부, 대두박단백질 40 내지 50중량부 및 물 600 내지 800중량부를 함유하는 당밀배지인 Nutrient Broth 배지를 사용하는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 제조하였다.
측정한 결과, 실시예 1 및 2는 모두 성장률이 높았으나, 실시예 2가 실시예 1보다 다소 높은 것을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명은 기재된 특정한 실시형태 및 실시예에 대해서만 상세히 기술되었지만, 본 발명의 기술사상범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC18643P 20171128 한국생명공학연구원 KCTC18636P 20171128 한국생명공학연구원 KCTC18641P 20171128 한국생명공학연구원 KCTC18638P 20171128 한국생명공학연구원 KCTC18639P 20171128 한국생명공학연구원 KCTC18642P 20171128 한국생명공학연구원 KCTC18637P 20171128 한국생명공학연구원 KCTC18640P 20171128

Claims (4)

  1. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JIF17623(기탁번호 KCTC18643P), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) JIF117714(기탁번호 KCTC18636P), 바실러스 샴(Bacillus siamensis) JIF17807(기탁번호 KCTC18641P), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) JIF17775(기탁번호 KCTC18638P), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) JIF17801(기탁번호 KCTC18639P), 바실러스 스트라토스피러스튜스(Bacillus stratoshericus) JIF17796(기탁번호 KCTC18642P), 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai) JIF17682(기탁번호 KCTC18637P) 및 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) JIF17718(기탁번호 KCTC18640P) 균주를 포함하고, 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제 및 프로테아제 효소활성 및 내염성을 가지고 고온에서 서식 가능한 음식물쓰레기 분해 활성이 우수한 음식물쓰레기 분해 혼합균주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혼합균주는,
    온도범위 30 내지 60℃, pH 3 내지 11, 염농도 5%까지 생육 가능한 것을 특징으로 하는 음식물쓰레기 분해 혼합균주.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 혼합균주는,
    생육 최적 조건이 온도 30℃, pH 범위 5 내지 7인 것을 특징으로 하는 음식물쓰레기 분해 혼합균주.
  4. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JIF17623(기탁번호 KCTC18643P), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) JIF117714(기탁번호 KCTC18636P), 바실러스 샴(Bacillus siamensis) JIF17807(기탁번호 KCTC18641P), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) JIF17775(기탁번호 KCTC18638P), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) JIF17801(기탁번호 KCTC18639P), 바실러스 스트라토스피러스튜스(Bacillus stratoshericus) JIF17796(기탁번호 KCTC18642P), 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai) JIF17682(기탁번호 KCTC18637P) 및 바실러스 사펜시스(Bacillus safensis) JIF17718(기탁번호 KCTC18640P) 균주를 포함하는 음식물쓰레기 분해 혼합균주를 사용하여 음식물쓰레기 분해하는 분해 방법.
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