KR101062309B1

KR101062309B1 - 셀룰라아제 및 자일라나아제를 분비하는 바실러스 리케니포르미스 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101062309B1
Application number: KR1020080108305A
Authority: KR
Inventors: 강대경; 김선기; 김민정; 김인호; 장종수
Original assignee: 선 바이오 (주); 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2008-11-03
Filing date: 2008-11-03
Publication date: 2011-09-06
Also published as: KR20100049223A

Abstract

본 발명은 셀룰라아제 및 자일라나아제를 분비하는 바실러스 리케니포르미스 균주, 상기 균주로부터 생산되고, 저온에서 활성을 나타내며, 최적온도가 40~50℃이며, 최적 pH가 5.5~6.5인 셀룰라아제, 상기 셀룰라아제를 함유하는 셀룰로스 분해 증진용 사료첨가제 및 상기 균주를 함유하는 셀룰로스 및 자일란 분해 증진용 사료첨가제에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 셀룰라아제와 자일라나아제를 함께 분비하는 B. licheniformis DK42는 사료의 난소화성 탄수화물의 이용 효율을 높이는데 유용할 것으로 판단되며, B. licheniformis DK42가 분비하는 셀룰라아제는 저온에서도 활성이 높기 때문에 축산분뇨 처리를 비롯하여 온도가 낮은 조건에서의 바이오매스 분해에도 적용할 수 있을 것으로 보인다.

셀룰라아제, 자일라나아제, 바실러스 리케니포르미스, 사료첨가제, 저온 활성

Description

셀룰라아제 및 자일라나아제를 분비하는 바실러스 리케니포르미스 및 이의 용도{Bacillus licheniformis producing cellulase and xylanase and uses thereof}

본 발명은 셀룰라아제 및 자일라나아제를 분비하는 바실러스 리케니포르미스 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 셀룰라아제 및 자일라나아제를 분비하는 바실러스 리케니포르미스 균주, 상기 균주로부터 생산되고, 저온에서 활성을 나타내며, 최적온도가 40~50℃이며, 최적 pH가 5.5~6.5인 셀룰라아제, 상기 셀룰라아제를 함유하는 셀룰로스 분해 증진용 사료첨가제 및 상기 균주를 함유하는 셀룰로스 및 자일란 분해 증진용 사료첨가제에 관한 것이다.

일반적으로 사료 곡물에는 난소화성 탄수화물, 즉 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스와 리그닌이 다수 함유되어 있다. 이들 중에서 β-1,4-glycosidic 결합으로 구성되어 있는 셀룰로오스를 가수분해할 수 있는 셀룰라아제는 곡물 사료의 가축의 장내에서의 이용성을 높힘으로써 사료효율을 향상시킬 뿐만 아니라 (Beguin and Aubert. 1994. FEMS Microbiol. Rev. 13:25-58), 축산분뇨의 퇴비화 촉진에도 기여하는 것으로 알려져 있다 (김태일 등. 1999. 한국미생물학회지. 35(4): 277-282). 한편, 헤미셀룰로오스의 주요 구성성분으로 알려진 자일란은 기본 골격이 β-1,4 결합을 하고 있는 D-자일로스로 구성되어 있다. 자일란의 기본골격을 분해하는 자일라나아제는 가축사료의 사료효율 개선, 제지의 표백공정, 과일음료의 청징, 농산 부산물 이용성 증대 등을 위해 이용되고 있는데 (Lee and Choi. 2006. J. Microbiol. Biotechnol. 16(12): 1856-1861), 닭, 돼지 등의 단위동물의 장내 점도를 증가시키는 헤미셀룰로오스를 분해함으로써 소화기 질병의 예방 및 사료효율 개선 효과가 있는 것으로 알려져 있다 (Campbell and Bedford. 1992. Can.. J. Anim. Sci. 72:449-453). 특히 자일라나아제는 수용성 자일란 뿐만 아니라 셀룰로오스에 결합된 불용성 자일란도 분해할 수 있으므로, 곡물에 잔존하는 자일란과 이와 결합된 리그닌을 제거하는데 이용될 수 있다 (김대준 등. 1995. 산업미생물학회지. 23(3):304-310). Chiang 등 (Chiang et al., 2005. Asian-Aust. J. Anim. Sci. 18(88):1141-1146)은 산란계용 사료에 자일라나아제를 첨가할 경우에는 옥수수를 밀로 대체하여 급여하여도 산란계의 성장률이나 영양적 가치에 영향을 미치지 않았다고 하였으며, 김 등 (김창현 등. 2003. 한국동물자원과학회지. 45(6):1007-1018)은 셀룰라아제 및 아밀라아제를 사료에 첨가하였을 경우에 비육돈의 생산성에 긍정적인 영향을 미쳤다고 보고된 바 있다. 한편, 셀룰라아제와 자일라나아제를 함께 사료에 첨가하여 가축에 급여할 경우에 셀룰로오스와 자일란을 동시에 분해할 수 있으므로 가축의 생산성 증대, 사료효율의 증대 뿐만 아니라 환경오염의 감소효과가 크다고 알려져 있으며 (Omogbenigun et al., 2004. J Anim Sci. 82(4):1053-61), 장내 lactobacilli속 유산균수도 증가하였다고 보고된 바 있다 (Kiarie et al., 2007. J Anim Sci. 2007 Nov; 85(11):2982-93).

최근 들어 국제 사료곡물 가격이 급등함으로써 국내 동물자원산업의 생산기반이 위협받고 있는 상황이기 때문에, 수입에 주로 의존하고 있는 사료곡물의 효율적인 이용이 더욱 중요한 상황이다. 그동안 사료효율 향상을 목적으로 셀룰라아제 또는 자일라나아제를 분비하는 곰팡이에 대한 연구는 보고되고 있지만, 이 두가지 효소를 함께 분비하는 세균에 대한 보고는 많지 않은 실정이다. 정 등 (정원형 등. 2003. 한국미생물생명공학회지. 31(4):383-388)은 자일라나아제 및 셀룰라아제 활성을 나타내는 균주를 분리하고 효소 생산을 위한 대량배양 조건을 확립한 바 있으나, 효소의 특성에 대해서는 조사된 바가 없다.

한국특허등록 제10-0318554호에는 중성 셀룰라아제를 생산하는 신규한 바실러스속 79-23 균주가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-0426930호에는 아밀라제, 프로테아제, 셀룰라제, 리파제 효소활성이 있고 대장균, 살모넬라, 스타필로코커스, 캔디다에 길항능이 있으며 경구독성이 없는 바실러스 아밀로리키페이시엔스 비4(Bacillus amyloliquefaciens B4) 균주 KCTC 18083P가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-0503678호에는 아밀라아제, 셀룰라아제, 프로테아제 및 리파아제 효소활성을 가지며 음식물쓰레기 분해 활성이 우수한 바실러스 서브틸리스 N0701-5 (Bacillus subtilis N0701-5) 균주가 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 사료곡물의 효율적인 이용을 목적으로 난소화성 탄수화물인 셀룰로오스 및 자일란을 동시에 분해할 수 있는 세균을 분리하였으며, 형태학적 및 생화학적 특성과 분리한 미생물이 분비하는 효소의 특성에 대해 조사하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 셀룰라아제 및 자일라나아제를 분비하는 바실러스 리케니포르미스 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주로부터 생산되고, 저온에서 활성을 나타내며, 최적온도가 40~50℃이며, 최적 pH가 5.5~6.5인 셀룰라아제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 셀룰라아제를 함유하는 셀룰로스 분해 증진용 사료첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 함유하는 셀룰로스 및 자일란 분해 증진용 사료첨가제를 제공한다.

본 발명에서는 셀룰라아제 및 자일라나아제 효소를 생산하는 Bacillus 속 균주를 분리하고 효소적 특성을 조사하였다. B. licheniformis는 B. subtilis와는 달리 혐기적 생장이 가능한 생리적 특성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 탄수화물계 분해효소의 경우에는 단일 효소보다는 복합효소가 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로오스를 분해하는데 상승효과를 준다고 알려져 있으므로, 셀룰라아제와 자일라나아제를 함께 분비하는 B. licheniformis DK42는 사료의 난소화성 탄수화물의 이용 효율을 높이는데 유용할 것으로 판단된다. 또한, B. licheniformis DK42가 분비하는 셀룰라아제는 저온에서도 활성이 높기 때문에 축산분뇨 처리를 비롯하여 온도가 낮은 조건에서의 바이오매스 분해에도 적용할 수 있을 것으로 보인다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 셀룰라아제(cellulase) 및 자일라나아제(xylanase)를 분비하는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)를 제공한다. 본 발명의 바실러스 리케니포르미스에서, 바람직하게는 상기 셀룰라아제는 저온에서 활성을 나타내며, 더욱 바람직하게는 상기 셀룰라아제는 10℃의 저온에서 최대 활성의 50%의 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 셀룰라아제는 최적온도가 40~50℃이며, 최적 pH가 5.5~6.5이며, 바람직하게는 최적온도가 45℃이며, 최적 pH가 6.0 이다.

또한, 상기 자일라나아제는 최적온도가 50~60℃이며, 최적 pH가 5.5~6.5이며, 바람직하게는 최적온도가 55℃이며, 최적 pH가 6.0 이다.

본 발명의 바실러스 리케니포르미스는 가장 바람직하게는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) DK42 (기탁번호: KACC 91410P)이다.

사료곡물의 효율적 이용을 목적으로 셀룰라아제 및 자일라나아제를 분비하는 미생물을 분리한 후 가장 생산성이 높은 균주를 선발하였다. 선발된 DK42 균주의 형태, 당 이용성 및 16S rRNA 유전자 서열분석 등을 통해 동정한 결과, Bacillus licheniformis에 속하는 것으로 나타났으므로 선발한 균주를 B. licheniformis DK42로 명명하였으며, 이를 한국농업미생물자원센터(KACC)에 2008년 10월 16일자로 기탁하였다 (기탁번호: KACC 91410P).

B. licheniformis DK42가 분비하는 셀룰라아제 효소 활성은 대수생장기 중반부터 급격히 증가하였고, 균의 생장이 정체기에 이르면 효소의 활성도 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났다. 한편, 자일라나아제 효소 활성은 세포 생장과 더불어 대수생장기 초기부터 지속적으로 증가하였으며, 대수생장기 후반에 최대 활성을 나타내고 효소 활성이 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났다. 셀룰라아제 활성의 경우에는 최적 온도가 45℃이었고 10℃의 저온에서도 최대 활성의 50% 정도의 활성을 나타내었으며, 자일라나아제는 셀룰라아제보다 약간 높은 55℃에서 최고 활성을 나타내었다. 한편 두 효소의 열안정성을 조사한 결과, 셀룰라아제는 45℃에서는 2시간 후에도 효소의 활성이 안정하게 유지되었으나, 자일라나아제는 45℃에서도 약간 이상의 온도에 방치한 경우에는 시간의 경과에 따라 효소의 활성이 점진적으로 감소하였다. 두 효소의 최적 pH를 조사한 결과, 두 효소 모두 pH 6.0에서 최대의 효소 활성을 나타내었으며, 셀룰라아제 활성은 pH 5부터 pH 8까지 상대적으로 넓은 범위에서 활성을 유지한 반면, 자일라나아제 활성의 경우에는 pH 5 이하 또는 pH 8 이상에서는 활성이 급격히 저하되었다.

본 발명은 또한, 본 발명의 B. licheniformis DK42 균주로부터 생산되고, 저온에서 활성을 나타내며, 최적온도가 40~50℃이며, 최적 pH가 5.5~6.5인 셀룰라아제를 제공한다. 바람직하게는, 상기 셀룰라아제는 10℃의 저온에서 최대 활성의 50%의 활성을 나타내며, 최적온도가 45℃이며, 최적 pH가 6.0 이다. B. licheniformis DK42가 분비하는 셀룰라아제는 저온에서도 활성이 높기 때문에 축산분뇨 처리를 비롯하여 온도가 낮은 조건에서의 바이오매스 분해에도 적용할 수 있을 것으로 보인다.

본 발명은 또한, 본 발명의 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)를 함유하는 셀룰로스 및 자일란 분해 증진용 사료첨가제를 제공한다. 상기 바실러스 리케니포르미스가 분비하는 셀룰라아제는 저온에서 활성을 나타내며, 바람직하게는 10℃의 저온에서 최대 활성의 50%의 활성을 나타내며, 최적온도가 40~50℃이며, 최적 pH가 5.5~6.5이며, 더욱 바람직하게는 최적온도가 45℃이며, 최적 pH가 6.0 이다. 또한, 상기 바실러스 리케니포르미스가 분비하는 자일라나아제는 최적온도가 50~60℃이며, 최적 pH가 5.5~6.5이며, 바람직하게는 최적온도가 55℃이며, 최적 pH가 6.0 이다. 본 발명의 바실러스 리케니포르미스는 가장 바람직하게는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) DK42 (기탁번호: KACC 91410P)이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 셀룰라아제를 함유하는 셀룰로스 분해 증진용 사료첨가제를 제공한다. 상기 셀룰라아제는 B. licheniformis DK42 균주로부터 생산되고, 저온에서 활성을 나타내며, 최적온도가 40~50℃이며, 최적 pH가 5.5~6.5이며, 바람직하게는, 10℃의 저온에서 최대 활성의 50%의 활성을 나타내며, 최적온도가 45℃이며, 최적 pH가 6.0 이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

재료 및 방법

1. 균주 분리 및 배지

일반 토양, 돈분, 퇴비 등의 각종 시료를 채취한 후에, 멸균된 생리식염수(0.85% NaCl)에 현탁시켰으며, 희석액 0.1ml를 1.0% 카르복시메틸 셀룰로오스(Sigma)를 함유한 Nutrient agar에 도말하고 37℃에서 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후에, 0.2%(w/v) Congo red 용액으로 염색하였으며 1M NaCl로 세척한 후에 나타나는 노란색 투명환(halo)의 큰 균주들을 선발하였다. 선발된 균주들을 다시 1.0% oat spelt 자일란 (Sigma)를 함유한 Nutrient agar에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 후에 0.2%(w/v) Congo red 용액으로 염색하였으며 clear zone이 큰 균주를 최종 선발하였다. 균의 생장 및 효소 생산량 조사를 위해서는, CNY 배지 (1% CMC 나트륨 염, 0.5% NaCl, 0.5% 효모 추출액, 0.3% 펩톤, 0.2% (NH₄)₂SO₄, 0.05% MgSO₄·7H₂O, 0.2% K₂HPO_4, pH 6.8)를 접종하고, 37℃, 130rpm에서 진탕배양하면서 샘플링하였다.

2. 분리균주의 동정

선별한 균주의 동정을 위해 형태적, 생리적, 생화학적 특성을 조사하였으며, 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석함으로써 균주를 최종적으로 동정하였다. 형태학적인 특성은 전자현미경(Scanning Electron Microscopy)으로 관찰하였으며, Sohn 등(Sohn et al., 2004. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 675-680)의 방법에 준하였다. 생화학적 특성 조사는 API 50 CHB 키트 (biomerieux Vitek, Inc.)를 이용하여 37℃에서 48시간 배양 후 실시하였다. DK42 균주의 16S rRNA 유전자 서열분석을 위해, 게놈 DNA 추출 키트 (Qiagen)을 이용하여 분리 균주로부터 게놈 DNA를 추출한 다음, 정방향 프라이머 (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'; 서열번호 1)와 역방향 프라이머 (5'-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3'; 서열번호 2) 세트를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 50 pmole 프라이머, 50ng 주형 DNA, 10× Taq DNA 중합효소 완충용액 5㎕, 2.5mM dNTP 혼합물 4㎕, Taq DNA 중합효소 (TaKara, Japan) 1 U가 포함된 PCR 혼합물을 95℃에서 5분간 변성시킨 후에 95℃에서 1분, 55~60℃에서 1분, 72℃에서 1분간 30 사이클을 반복함으로서 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 pSTBlue-1(Novagen, USA)에 클로닝한 다음, BigDye^TM-terminator 시퀀싱 키트와 ABI PRISM377 시퀀서 (Perkin-Elmer, USA)로 염기서열을 분석하였다.

3. 배양시간에 따른 균주의 생장과 효소 생산

선발된 균주의 생장정도는 분광광도계를 사용하여 600nm에서 배양액의 흡광도를 측정함으로써 결정하였으며, 균주를 액체 배양하면서 샘플링한 상등액을 사용하여 효소 활성을 측정하였다.

4. 조효소액의 조제 및 효소활성 측정

DK42 균주를 CNY 액체배지에 접종하고 37℃에서 12시간동안 진탕 배양한 후에, 배양액을 10,000×g에서 10분간 원심분리하였다. 상등액을 황산암모늄으로 80%까지 포화시킨 후에, 4℃에서 하룻밤동안 방치하여 효소 단백질을 침전시켰다. 침전된 단백질을 10,000×g에서 20분동안 원심분리하여 회수한 후에, 50mM 인산칼륨 완충용액 (pH 7.0)으로 4℃에서 24시간동안 연속 투석하였으며, 투석이 완료된 용액을 효소활성 측정을 위한 조효소액으로 사용하였다.

카르복시메틸 셀룰라아제(CMCase)의 활성도는 DNS 환원당 정량법으로 측정하였다 (Miller et al., 1960. Anal. Biochem. 2:127-132). 즉, 증류수에 녹인 1.0% CMC 500㎕, 200mM 인산염 완충용액 (pH 6.0) 250㎕와 조효소액 250㎕을 혼합하고 45℃에서 3시간 반응시킨 후, 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC)로부터 유리된 글루코스 함량을 측정함으로써 분석하였다. 자일라나아제의 활성도의 측정방법은 CMCase 역가 측정방법과 동일하나, 기질로서 CMC 대신에 자일란을 사용하는 것과 표준시료로 D-자일로스를 사용하는 이외에는 동일한 방법을 사용하여 측정하였다. 효소의 활성도 1.0 유닛은 위의 조건하에서 1분 동안 CMC 또는 자일란으로부터 1 μmol의 글루코스 또는 D-자일로스에 상응하는 환원당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.

5. 효소의 활성에 미치는 반응조건 분석

셀룰라아제 및 자일라나아제의 효소 활성 및 반응에 미치는 온도 및 pH의 영향을 조사하기 위해, DK42 균주가 생산하는 조효소액을 반응에 사용하였다. 효소 반응의 최적 온도를 조사하기 위해, 50 mM 인산칼륨 완충용액(pH 7.0)에서 1.0% CMC 또는 자일란 용액을 기질로 사용하여 20℃에서 80℃까지 10℃ 구간별로 반응시킨 후, 상기 서술한 효소활성 측정법으로 효소 활성을 비교하였다. 효소의 최적 pH를 조사하기 위해서는, 조효소액을 아래의 각 pH 별 완충용액에 넣고 반응시킨 후, 활성을 비교하였다. 사용한 완충용액으로서, pH 2.0∼4.0 사이는 50 mM 글리신-HCl 완충용액, pH 5.0∼6.0 사이는 50 mM 아세트산나트륨 완충용액, pH 7.0∼8.0 사이는 50 mM 인산칼륨 완충용액, pH 9.0는 50 mM Tris-HCl 완충용액를 각각 사용하였다.

6. 셀룰라아제 및 자일라나아제의 온도 안정성

두 효소의 온도 안정성을 검토하기 위해 50 mM 인산칼륨 완충용액(pH 6.5)에 조효소액을 첨가하였으며, 20℃에서 80℃까지의 각 온도에서 30분간 처리한 후에 효소의 잔존 활성을 측정하였다.

실시예 1. 균주의 분리 및 동정

일반 토양, 돈분, 퇴비 등의 각종 시료를 채취한 후에, 1% 자일란 (Sigma) 또는 1% CMC (Sigma)를 포함한 Nutrient agar (Difco)에 도말하고, 55℃에서 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 고체배지를 0.2% Congo red로 염색하였으며, 노란색 투명환(halo)을 나타내는 균주를 선발하였다 (도 1). 선발된 DK42 균주를 동정하기 위해 특성을 조사한 결과, 본 균주는 Gram 양성의 간균으로서 (도 2), 호기성의 포자 형성균이었다. DK42 균주의 당류 이용성에 대한 특징을 조사한 결과는 표 1에서 보는 바와 같으며, 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)에 속하는 것으로 나타났다(신뢰도 99.9%).

분리된 균주 DK42의 특성

Characteristics	Result	Characteristics	Result
Shape	rod
Gram stain	+	Arbutin	+
Catalase	-	Esculin	+
Control	-	Salicin	+
Glycerol	+	Celiobiose	+
Erythritol	-	Maltose	+
D-arabinose	-	Lactose	+
L-arabinose	+	Melibiose	-
Ribose D-ribose	+	Sucrose	+
D-xylose	+	Trehalose	+
L-xylose	-	Inulin	-
D-adonitol	-	Melezitose	-
Methyl-B-D-xylopyranoside	-	Raffinose	+
D-galactose	+	Starch	+
D-glucose	+	Glycogen	+
D-fructose	+	Xylitol	-
D-mannose	+	Gentiobiose	+
L-sorbose	-	D-turanose	+
Rhamnose	-	D-lyxose	+
Dulcitol	-	D-tagatose	+
Inositol	+	D-fucose	-
Mannitol	+	L-fucose	-
Sorbitol	+	D-arabitol	-
α-Methyl, D-Mannopyranside	-	L-arabitol	-
α-Methyl, D-glucoside	+	Gluconate	-
N-Acethyl-glucosamine	+	2-keto-gluconate	-
Amygdalin	+	5-keto-gluconate	-

1) +: positive result, -: negative result

2) API 50CHB 키트를 이용하였다.

또한 DK42 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석한 후에 NCBI의 BLAST 서치 프로그램을 이용하여 상동성을 비교한 결과, 99%의 신뢰도로 B. licheniformis에 속하는 것으로 나타났으므로, 선발한 균주를 Bacillus licheniformis DK42로 명명하였다. 한편, B. licheniformis DK42가 생산하는 셀룰라아제계 효소를 조사한 결과, avicellase 및 β-glucosidase 활성은 유도되지 않았기 때문에, B. licheniformis DK42가 생산하는 효소는 엔도셀룰라아제인 CMCase인 것으로 추정되었다 (데이타 미제시).

실시예 2. 배양시간에 따른 B. licheniformis DK42의 생장과 효소 생산

B. licheniformis DK42 균주의 배양시간에 따른 세포외 효소의 생산량을 분석하였다 (도 3). 셀룰라아제 효소 활성은 대수생장기 중반부터 급격히 증가하였고, 균의 생장이 정체기에 이르면 효소의 활성도 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났다. 한편, 자일라나아제 효소 활성은 세포 생장과 더불어 대수생장기 초기부터 지속적으로 증가하였으며, 대수생장기 후반에 최대 활성을 나타내고 효소 활성이 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났다. 일반적으로, Bacillus 속 유래의 탄수화물 분해효소는 세포의 생장과 더불어 지속적으로 증가하고 정체기에 이르러 최대 활성을 나타내는 것으로 보고되고 있는데 (김대준 등. 1995. 산업미생물학회지. 23(3):304-310; 김지연 등. 2004. 한국미생물생명공학회지. 40(2):139-146), B. licheniformis DK42가 분비하는 셀룰라아제는 이러한 경향과 일치한 반면 자일라나아제는 더 빠른 시점에서 생산되는 것으로 나타났다.

실시예 3. 셀룰라아제와 자일라나아제 활성에 미치는 온도의 영향

B. licheniformis DK42 이 세포외로 분비하는 셀룰라아제와 자일라나아제가 기질을 가수분해하는데 있어서 반응온도가 미치는 영향을 조사하였다. 배양 상등액을 황산암모늄으로 침전시킨 단백질을 조효소액으로 사용하였으며, 반응온도를 달리하여 셀룰라아제와 자일라나아제 활성을 측정하였다. 셀룰라아제 활성의 경우에는 최적 온도가 45℃이었으며, 20℃~50℃의 비교적 넓은 범위에서 높은 효소활성을 나타내었다 (도 4). 또한 55℃ 이상의 온도에서는 셀룰라아제 활성이 급격히 감소한 반면, 10℃의 낮은 온도에서도 최고 활성의 50% 정도에 해당하는 활성을 나타내었다. 한편, 자일라나아제는 셀룰라아제보다 약간 높은 55℃에서 최고 활성을 나타내었으며, 온도가 낮아지면 효소의 활성도 점진적으로 감소하였다 (도 4).

B. licheniformis DK42 균주가 분비하는 셀룰라아제 및 자일라나아제의 열안정성을 조사하기 위해, 조효소액을 각 온도에서 시간별로 방치한 후 남아있는 효소의 잔존 활성을 측정하였다. 셀룰라아제의 경우, 45℃에서는 2시간 후에도 효소의 활성이 안정하게 유지되었으나, 55℃에서는 시간의 경과에 따라 효소의 활성이 점진적으로 감소하여 1시간 후에는 최대 활성의 50%가 소실되었다 (도 5). 한편 자일라나아제의 경우, 45℃ 이상의 온도에 방치한 경우에는 시간의 경과에 따라 효소의 활성이 점진적으로 감소하였으며, 65℃에서는 셀룰라아제와 마찬가지로 30분 이후부터 효소의 활성이 나타나지 않았다 (도 5).

실시예 4. 셀룰라아제 및 자일라나아제 활성에 미치는 pH의 영향

B. licheniformis DK42가 생산하는 셀룰라아제 및 자일라나아제 활성에 미치는 pH의 영향을 조사하였다. 배양 상등액으로부터 제조한 조효소액을 pH 2.0~9.0 범위로 조정한 후에 효소 활성을 측정한 결과, 두 효소 모두 pH 6.0에서 최대의 효소 활성을 나타내었다 (도 6). 한편, 셀룰라아제 활성의 경우에는 pH 5부터 pH 8까지 상대적으로 넓은 범위에서 최대 활성이 70% 이상을 유지한 반면, 자일라나아제 활성의 경우에는 pH 5 이하 또는 pH 8 이상에서는 활성이 급격히 저하되었다.

도 1은 각각 1.0% CMC 및 1.0% 자일란을 함유하는 Nutrient plate의 congo-red 염색에 의한 셀룰라아제 (A) 및 자일라나아제 활성 (B)의 검출을 보여준다.

도 2는 분리된 균주 DK42의 주사전자현미경 (SEM) 사진 (×20,000)을 보여준다.

도 3은 B. licheniformis DK42의 성장 및 효소 생산을 보여준다. B. licheniformis DK42를 격렬하게 진탕하면서 37℃에서 1% CMC가 첨가된 Nutrient broth에서 각각 키웠다. 세포 성장을 세포 배양물의 OD600 을 측정함으로써 측정하였다. 셀룰라아제 활성을 배양물 상층액으로 측정하였다.

도 4는 B. licheniformis DK42 유래의 셀룰라아제 및 자일라나아제의 활성에 대한 온도의 효과를 보여준다. 조효소의 최대 비활성을 100%로 정하였다. 분석을 50mM 인산염 완충용액 (pH 6.0)에서 수행하였다.

도 5는 B. licheniformis DK42 유래의 셀룰라아제(A) 및 자일라나아제(B)의 안정성에 대한 온도의 효과를 보여준다. 분석을 2시간 동안 상이한 온도에 노출 후에 수행하였다. 개개의 플롯 옆의 숫자는 인큐베이션 온도를 나타낸다.

도 6은 B. licheniformis DK42 유래의 셀룰라아제 및 자일라나아제의 활성에 대한 pH의 효과를 보여준다. 조효소의 최대 비활성을 100%로 정하였다. 이용한 완충용액은 50mM glycine-HCl 완충용액 (pH 2), 50mM 시트레이트-NaOH (pH 3-5), 50mM 인산염-NaOH 완충용액 (pH 6-8), 및 50mM 글리신-NaOH 완충용액 (pH 9)이었다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Bacillus licheniformis producing cellulase and xylanase and uses thereof <130> PN08189 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 aaggaggtga tccagcc 17

Claims

자일라나아제 및 10℃의 저온에서 온도의 변화에 따른 최대 활성의 50%의 활성을 나타내는 셀룰라아제를 분비하는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) DK42 (기탁번호: KACC 91410P).
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제1항에 있어서, 상기 셀룰라아제는 최적온도가 40~50℃이며, 최적 pH가 5.5~6.5이며, 자일라나아제는 최적온도가 50~60℃이며, 최적 pH가 5.5~6.5 인 것을 특징으로 하는 바실러스 리케니포르미스 DK42 (기탁번호: KACC 91410P).
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제1항에 따른 균주로부터 생산되고, 10℃의 저온에서 온도의 변화에 따른 최대 활성의 50%의 활성을 나타내며, 최적온도가 40~50℃이며, 최적 pH가 5.5~6.5인 셀룰라아제.
제6항에 있어서, 최적온도가 45℃이며, 최적 pH가 6.0인 것을 특징으로 하는 셀룰라아제.
제1항 또는 제4항에 따른 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) DK42 (기탁번호: KACC 91410P)를 함유하는 셀룰로스 및 자일란 분해 증진용 사료첨가제.
제6항 또는 제7항에 따른 셀룰라아제를 함유하는 셀룰로스 분해 증진용 사료첨가제.