KR100526662B1 - 자일라나제를 코딩하는 유전자와 그 형질전환체를 이용하여 생산된 재조합 자일라나제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바실러스 속 AMX-4 (Bacillus sp. AMX-4) 균주의 자일라나제(xylanase)를 코드하는 신규한 자일라나제 유전자, 그 유전자를 포함한 재조합 플라스미드, 그 재조합 플라스미드를 포함하는 대장균 형질전환체에 관한 것으로, 토양으로부터 자일란 분해능이 우수한 것으로 분리된 바실러스 속 AMX-4 균주로부터 자일라나제를 코드하는 유전자를 크로닝하고 그 염기서열을 밝힌 다음, 이러한 자일라나제 유전자를 함유한 대장균 형질전환체가 생산하는 자일라나제의 반응특성을 밝힘으로써, 동물의 장내와 가까운 환경인 중성 pH와 중온에서 반응성이 높을뿐만 아니라 자일란을 분해하여 자일로바이오즈와 자일로트리오즈를 포함하는 기능성 자일로올리고당을 생산하는 자일라나제를 생산하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

자일라나제를 코딩하는 유전자와 그 형질전환체를 이용하여 생산된 재조합 자일라나제 {Gene coding xylanase and recombinant xylanase through transformant thereof}

본 발명은 자일라나제 생합성 유전자와 그 효소 생산에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 토양으로부터 자일란 분해능이 우수한 것으로 분리된 바실러스 AMX-4 균주 유래의 자일라나제(xylanase)를 코드하는 유전자의 염기서열과 아미노산 서열을 밝히고 상기 자일라나제 유전자를 함유한 대장균 형질전환체를 발현시킴으로써 자일라나제를 생산한 후 생산된 자일라나제 활성을 확인하는 것에 관한 것이다.

자일라나제는 미생물이 생산하는 다양한 효소 중의 하나로써, 현재 그 이용성이 매우 높으며 앞으로도 다양한 용도로 개발될 것으로 기대되는 효소이다. 이 효소의 이용 가능성으로써 가장 중요한 것은 지구상에서 가장 풍부하고 태양에너지에 의해 재생 가능한 생물자원인 식물성 섬유물질을 분해·당화하여 에너지 자원화하는 것인데 이는 향후 더 많은 연구가 있어야만 실용화가 가능한 분야이고, 현재 실용화되고 있는 것은 고급용지의 생산 및 폐지재생, 과일음료 및 맥주의 혼탁물 제거, 커피와 식물성 기름 및 전분의 추출 그리고 본 발명에서 주로 언급하게 될 단위동물의 사료이용 증대와 자일로올리고당 생산 등과 같은 산업적 응용을 들 수 있다.

최근 들어 사료첨가용 효소와 자일로올리고당의 생산효소로서 자일라나제의 유용성이 증대되고 있다. 주로 동물의 에너지 대사에 필요한 탄수화물과 소량의 단백질을 공급하는 사료용 곡물들은 대부분의 단위동물이 이용하지 못하는 섬유질을 함유하고 있다. 곡물중의 섬유질는 비전분성 다당류와 리그닌으로 구성되며 식물의 세포벽은 세포의 제일 바깥쪽의 셀룰로즈 층과 그 내부의 알곡 전체를 감싸는 헤미셀룰로즈 및 베타-글루칸으로 구성된 비전분성 다당류와 리그닌이 합쳐져서 이루어진다. 이 비전분성 다당류는 가축의 소화효소에 의해 분해되지도 않을 뿐만 아니라 곡물중의 전분이나 단백질을 감싸고 있기 때문에 가축이 영양소를 이용하는 효율을 떨어뜨리는 문제점이 있다. 또한 소장에서는 비전분성 다당류가 걸쭉한 겔 상태로 끈적끈적하게 녹아 있어 그나마 소화효소가 영양소로 접근하는 것을 방해하고 소화관내 소화물의 흐름을 저해한다. 따라서 미생물이 소화물에 부착하여 이상발효를 일으켜 영양분의 손실을 가져오는 문제점이 있다.

자일라나제 (xylanase)를 곡물 사료에 첨가하면 알곡을 감싸고 있는 헤미셀룰로즈 층을 가수분해하여 알곡내에 있는 영양분의 이용성을 높일 뿐만 아니라 가축의 장내 소화물의 상태가 개선될 수 있다. 특히 헤미셀룰로즈 함량이 높은 소맥제품을 사료로 사용할 경우 가축에 연변이나 적리 현상이 일어나기 쉬운데 자일라나제는 이러한 현상을 예방할 수 있고 사료적 가치를 올려줄 뿐만 아니라 소맥제품의 품질의 편차를 개선하여 소맥제품을 안정적인 사료원료로 사용할 수 있게 하여 사료첨가용 효소로 그 가치가 높다. 따라서 자일라나제는 돼지와 닭과 같은 단위동물의 사료 첨가용 효소로 매우 중요하게 취급되고 있다. 또한, 최근 선진국뿐 아니라 생활환경과 소득이 개선된 많은 국가의 국민들의 육류소비가 늘고 있어 가축사육을 위한 사료자원의 다양화와 사료효율의 개선은 매우 중요하게 다루어지게 되었다.

또한, 자일로올리고당은 동물의 장관에 존재하는 유용미생물의 성장인자로 잘 알려져 있으며 특히 자일로바이오즈와 자일로트리오즈가 그 효과가 우수하다. 따라서 효소적 방법으로 자일란 물질로부터 자일로올리고당을 생산하기 위해서는 자일라나제가 핵심효소로 작용한다.

헤미셀룰로즈의 주성분인 자일란을 완전하게 분해하여 당화하기 위해서는 일반적으로 세가지 종류의 효소 즉 엔도자일라나제 (endo-β-xylanase), 엑소자일라나제 (exo-β-xylanase) 및 자일로시다제 (β-xylosidase)가 함께 작용해야 하는 것으로 알려져 있으며 이들을 자일라나제계 효소로 통칭한다. 한편, 본 발명에서는 이들 효소중 첫 번째 엔도자일라나제에 중점을 두었으며 이후 이 효소를 편의상 자일라나제로 칭함을 전제해 둔다.

사료첨가용 자일라나제의 생산에 사용되고 있는 미생물은 곰팡이를 들 수 있으며 곰팡이 중에서도 트리코더마(Trichoderma) 속 균주들이 주로 이용되는데 이들의 효소 생산성은 자일라나제를 생산하는 세균의 효소 생산성에 비해 대체로 우수하며 주로 산성조건에서 최대 활성을 나타낸다. 그러나 돼지나 닭의 소화기관의 생리적 조건은 부위별로 다르지만 자일라나제가 작용하여야 할 소장 이후의 pH 조건은 6.5 부근이므로 트리코더마 (Trichoderma) 속 균주들에 의해 생산되는 자일라나제는 부적당하다. 따라서 pH 5.0 부근에서 활성이 높은 곰팡이 유래의 자일라나제보다는 산도가 중성 부근의 조건에서 활성이 높고 유용장내 미생물의 성장인자인 자일로올리고당을 반응산물로 생산하는 자일라나제가 사료첨가용 효소로서 가치가 높다.

따라서, 본 발명의 목적은 산도가 중성에서 활성이 높은 자일라나제를 생산하는 바실러스 속 AMX-4 분리균주로부터 자일라나제를 코드하는 유전자를 크로닝하여 그 염기서열을 결정하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 자일라나제 유전자를 함유한 재조합 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체를 발현시켜 자일라나제를 생산하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 생산된 자일라나제의 활성과 그 최종 산물을 확인하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 토양에서 분리된 자일란 분해능이 우수한 바실러스 속 AMX-4 균주로부터 추출한 염색체 DNA를 이용하여 제조한 유전자 라이브러리를 도입한 대장균을 귀리 자일란이 포함된 고체 한천배지에 도말하고 자일란 분해환을 관찰함으로써 자일라나제 유전자를 함유한 대장균 형질전환주를 얻고, 이러한 형질전환주가 지니고 있는 재조합 플라스미드를 분리하여 자일라나제를 코드하는 유전자의 염기서열을 밝히고 제한효소 지도를 작성 한 후, 대장균 형질전환주가 생산하는 자일라나제를 정제하여 반응온도와 반응 pH가 자일라나제의 활성에 미치는 영향을 분석한 다음, 정제된 자일라나제에 의한 귀리 자일란을 비롯한 자일로바이오즈, 자일로트리오즈, 자일로테트라오즈, 자일로펜토즈 각각의 분해산물을 비교 분석하여 식·사료첨가용으로서 유용성을 확인함으로써 달성하였다.

본 발명은 자연계에서 자일란 분해능이 우수한 바실러스 속 AMX-4 균주를 분리·동정하는 단계; 분리된 바실러스 속 AMX-4 균주의 총 염색체 DNA를 추출하고 제한효소로 처리하여 플라스미드와 연결한 후 이를 대장균에 도입하여 유전자 라이브러리를 제조하는 단계; 상기 제조된 유전자 라이브러리의 대장균 형질전환체를 귀리 자일란이 첨가된 고체 한천배지에 도말하여 자일란 분해환을 관찰함으로써 자일라나제 유전자를 함유한 형질전환체를 선별하는 단계; 자일라나제 유전자를 함유한 대장균 형질전환체로부터 재조합 플라스미드를 추출하여 자일라나제 염기서열을 밝히는 단계; 본 발명 자일라나제 유전자를 함유한 대장균 형질전환체를 발현시켜 자일라나제 생산·정제한 다음, 본 발명 자일라나제의 반응 온도와 반응 pH에 따른 활성을 분석하고 자일란 종류에 따른 가수분해 활성을 비교하는 단계; 본 발명 자일라나제에 의한 귀리 자일란 분해산물과 자일로바이오즈, 자일로트리오즈, 자일로테트라오즈, 자일로펜토즈의 분해산물을 박층 크로마토그래피로 조사하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 단계에서 대장균 형질전환체 중에서 자일란 분해능을 보이는 형질전환체를 선별하는 배지로 귀리 자일란 5 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 트립톤 10 g/L, NaCl 5 g/L, 앰피실린 50 mg/L, 한천 15 g/L로 구성되어 있고 pH를 7.0으로 조절한 LB-자일란 한천 배지를 사용한다. 대장균 형질전환체 배양용 배지로는 효모 추출물 5 g/L, 트립톤 10 g/L, NaCl 5 g/L로 구성되어 있는 LB 복합 액체배지에 앰피실린 (50 mg/L)을 첨가하여 사용한다.

자일라나제를 생산하는 미생물 분리를 위해 토양 시료 현탁액을 영양평판배지에서 배양하고, 평판배지 상에 형성된 콜로니 주위의 자일란 분해환을 관찰하여 자일라나제 생산균을 분리한다. 분리 균주의 동정은 형태적, 생화학적 특성, 지방산 조성 및 16S rRNA 유전자의 염기서열을 조사함으로써 실시한다. 분리균을 동정하기 위해 특성을 조사한 결과 호기성이고 그람 양성균이며, 포자를 형성하고 카탈라아제 활성을 지닌 단간균으로 확인되어 바실러스 속에 속하는 것으로 판단된다. 바실러스 속 분리균의 세포막 지방산 조성을 분석한 결과, 바실러스 서브틸리스와 바실러스 아밀로리쿼파시엔스의 지방산 조성과 각각 0.753과 0.683의 유사도 값을 보이며, 16S rRNA 유전자의 염기서열을 조사한 결과 바실러스 서브틸리스 유전자의 염기서열과의 상동성이 가장 높은 것으로 나타난다.

상기 분리·동정된 바실러스 속 AMX-4 균주의 자일라나제 유전자의 클로닝을 위하여 바실러스 AMX-4의 유전자 라이브러리을 제조하고, 자일라나제 유전자를 함유하는 대장균 형질전환체를 선별한다. 바실러스 속 AMX-4 균주를 대수증식기 까지 증식시키고 원심분리하여 회수한 균체에서 염색체 DNA를 추출한 후, 이를 제한효소 Sau3AI로 절단하고 전기영동하여 0.5~10Kb 크기의 DNA단편을 회수한다. 이 단편들을 BamHI로 절단한 플라스미드 pUC19에 삽입시켜 유전자 라이브러리를 제조한다. 상기 제조된 재조합 플라스미드를 대장균 XL-1에 형질전환시키고, 자일라아제 유전자를 함유한 형질전환체의 획득을 위해 LB-자일란 한천배지에 도말하여 자일란 분해환을 보이는 형질전환체를 선발한다.

자일라나제를 코드하는 유전자의 염기배열을 결정하기 위해 상기 대장균 형질전환체를 앰피실린을 첨가한 LB 액체 배지에서 배양하여 얻은 균체를 알칼리 분해방법으로 플라스미드를 분리한다. 여러 가지 제한효소를 처리하여 조사한 결과 재조합 플라스미드는 약 0.8kb 크기의 클론된 DNA 단편을 함유하고 있으며, 이 재조합 플라스미드를 pXT4로 명명하였다. 플라스미드 pXT4에 있는 클론된 0.8kb DNA 단편의 염기서열을 결정하기 위해 여러 가지 제한 효소를 이용하여 단편을 작은 조각으로 나누어 pUC19에 삽입시켜 디데옥시뉴클레이티드 시퀀싱 (dideoxynucleotide sequencing) 방법으로 총 748 bp의 염기서열을 결정한다. 이 염기서열에는 자일라나제의 구조유전자에 해당하는 총 642 bp의 오픈리딩프레임 (open reading frame)이 존재하며(서열번호 1), 이 구조유전자의 염기배열로부터 추론된 자일라나제 효소의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸 것으로 총 213개 아미노산으로 이루어진 단백질이다. 이렇게 밝혀진 바실러스 속 AMX-4의 자일라나제 유전자의 염기배열로부터 유추된 자일라나제의 아미노산 배열을 기존에 밝혀진 바실러스 속 균주의 자일라나제의 아미노산 배열의 유사성이 높은 것을 조사한 결과 213개 아미노산으로 구성된 자일라나제 (Jeong, K. J., P. C. Lee, I. Y. Park, M. S. Kim, and S. C. Kim, Enzyme Microb. Technol. 22, 599-605 (1996))와 약 95.3%의 상동성을 보이며 213개 아미노산 중 10개 아미노산 배열의 차이가 있다.

본 발명 재조합 플라스미드 pXT4를 함유한 대장균 형질전환체를 발현시켜 생산된 재조합 자일라아제의 온도와 pH에 따른 활성을 조사하기 위해, 앰피실린을 첨가한 LB 액체배지에서 pXT4로 형질전환된 대장균 형질전환체를 배양하고 배양된 균체를 파쇄·농축하여 효소를 정제한다. 이 효소에 대해 반응온도와 pH를 달리하여 자일라나제 활성을 측정한다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 50∼55℃와 pH 7.0에서 최고의 효소 활성을 보이며 pH 5.0∼7.0 범위에서는 90% 이상의 활성을 보인다. 특히 동물 장내의 생리적 조건인 pH 6.5에서 최고활성의 98% 이상에 해당하는 활성을 보인다. 한편 사료첨가제로 사용시 위를 통과하는 과정에서 불활성화 되지 않는 것이 중요하므로 pH에 따른 자일라나제의 안정성을 분석하기 위해 정제된 효소를 pH를 3.0∼9.0 범위의 서로 다른 완충액에 1시간 동안 방치한 후 효소의 잔존 활성을 측정한다. 그 결과 표 2에 나타낸 바와 같이 pH 4.0∼8.0 범위에서는 잔존활성이 90% 이상이며, pH 3.0에서는 약 88%의 잔존활성을 나타낸다. 따라서 위와 유사한 조건인 pH 3.0에서 방치시간을 달리하면서 잔존활성을 조사한 결과 4시간 방치시까지 약 85% 이상의 잔존활성을 보이는 것으로 나타난다. 또한, 정제된 자일라나제를 이용하여 자일란의 종류에 따른 효소 활성을 측정하기 위해 아라비노 자일란, 귀리 자일란, 자작나무 자일란의 가수분해 상대 활성도을 비교한다. 그 결과 표 1에 나타난 바와 같이 사료원료로 많이 사용되는 소맥 유래의 자일란인 아라비노 자일란에 대한 가수분해력이 귀리 자일란에 대한 가수분해력 보다 높은 것을 알 수 있다. 이와 같은 결과를 살펴볼 때 본 발명 바실러스 속 AMX-4 균주의 자일라나제 유전자에 의해 생산되는 자일라나제는 사료첨가 목적에 적합함을 알 수 있다.

본 발명 자일라아제 유전자를 함유하는 대장균 형질전환체의 발현에 의해 생산되는 자일라아제의 자일란 가수분해 물질을 분석하기 위해, 귀리 자일란을 기질로 하여 최적 반응조건하에서 가수분해 반응을 실시하고 그 최종 산물을 박층 크로마토그래피(TLC)를 이용한다. 그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이 최종산물로 자일로즈는 생성되지 않고 자일로바이오즈와 자일로트리오즈, 자일로테트라오즈 등이 생성된다. 이는 본 발명 자일라나제에 의한 자일란 가수분해 산물과 실시예 3에서 볼 수 있는 바와 같이 본 발명 자일라나제와 아미노산 배열의 유사도가 높은 것으로 분석된 바실러스 속 균주 유래의 자일라나제에 의한 자일란 가수분해 산물 (Jeong, K. J., I. Y. Park, M. S. Kim, and S. C. Kim, Appl. Microbiol. Biotechnol. 50, 113-118 (1998))을 비교한 결과 본 발명 자일라나제에 의한 가수분해 산물로서 자일로즈가 생성되지 않는다는 것이 가장 큰 차이점이다. 또한 자일로바이오즈, 자일로트리오즈, 자일로테트라오즈, 자일로펜토즈를 기질로 하여 본 발명 자일라나제를 각각 반응시킨 후 가수분해 산물을 박층 크로마토그래피를 수행하여 조사한 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 자일로바이오즈와 자일로트리오즈를 분해하지 않으며, 자일로테트라오즈와 자일로펜토즈를 자일로바이오즈와 자일로트리오즈로 분해하는 것이 확인되고, 이때도 반응산물에는 자일로즈가 생성되지 않음이 확인된다. 따라서 본 발명의 자일라나제는 자일란 물질을 분해하여 기능성이 우수한 자일로올리고당을 생성하는 것을 알 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 신규한 균주 바실러스 속 AMX-4의 분리와 동정

자일라나제를 생산하는 미생물 분리를 위해 토양 시료 1 g을 0.85% NaCl 용액 10 mL에 현탁하고 현탁액의 적당량을 취하여 0.5%의 오트 스펠트 자일란(oat spelt xylan)을 첨가한 영양(nutrient)평판배지 (beef extract, 3 g; bacto-peptone, 5 g; water, 1 liter)에 도말한 후 37℃에서 배양하였다. 평판배지 상에서 형성된 콜로니 주위의 자일란 분해환을 관찰하여 자일라나제 생산균들을 선별하고 자일라나제 생산성이 높은 균을 최종적으로 1주 분리하였다. 분리균을 AMX-4로 명명하고 자일란 이외의 다른 고분자 물질을 분해할 수 있는지 분석하기 위해 스킴 밀크(1%), 스타치(0.2%), 트리부틸린(tributylin)(1%)와 카복시메틸 셀룰로오즈(carboxymethyl cellulose)(0.5%)를 각각 첨가한 평판배지에서 배양하여 분해 환을 조사한 결과 스킴 밀크, 스타치와 트리부틸린은 분해되었으나 카복시메틸 셀룰로오즈는 거의 분해하지 못했다. 따라서 분리균 AMX-4는 본 배지조건에서는 셀룰라아제를 생산하지 않을 뿐만 아니라 분리균이 생산하는 자일라나제는 셀룰라아제 활성을 지니고 있지 않는 것으로 추정된다.

분리 균주의 동정은 형태적, 생화학적 특성, 지방산 조성 및 16S rRNA 유전자의 염기서열을 조사함으로써 실시하였다. 분리균의 형태적 관찰을 위해서는 그람염색과 포자염색을 실시하였고, 생화학적 특성을 조사하기 위해서는 API 50 CHB kit를 사용하였으며, 지방산 조성을 조사하기 위해서는 Microbial Identification System (MIDI Inc., USA)을 사용하였다. 분리균 AMX-4를 동정하기 위해 특성을 조사한 결과 호기성이며 그람 양성균으로 나타났으며, 포자를 형성하고 카탈라아제 활성을 지닌 단간균으로 확인되어 바실러스 속에 속하는 것으로 판단되었다. 또한 AMX-4의 탄수화물 이용능을 API 50 CHB kit를 사용하여 조사한 결과 리보스(ribose), 디-자일로즈(D-xylose), 갈락토즈(galactose), 글루코스(glucose), 프럭토즈(fructose), 만노즈(mannose), 만니톨(mannitol), 알파-메틸-디-글루코사이드(α-methyl-D-glucoside), 엔-아세틸-글루코자민(N-acethyl-glucosamine), 알부틴(arbutin), 에스큘린(esculin), 말토즈(maltose), 수크로즈(sucrose), 트레할로즈(trehalose)는 이용하였으나, 다른 탄수화물은 이용하지 못하는 것으로 확인되었다. 이러한 AMX-4의 형태적 특성과 생화학적 특성으로 볼 때 바실러스 속 균주 중 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(B. amyloliquefaciens) 및 바시러스 푸밀러스(B. pumilus)와 유사성을 보이는 것으로 나타났으나, 일치도가 높지는 않았다.

따라서 분리균의 정확한 동정을 위해서 추가적으로 AMX-4 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 다른 균주와 비교하기 위해 세균의 16S rRNA 유전자 염기서열 중 보존 염기서열을 프라이머로 사용하고 분리균의 총염색체 DNA를 템플레이트로 하여 PCR을 수행함으로써 증폭된 DNA 단편의 염기서열을 다른 균주의 것과 비교한 결과 바실러스 서브틸리스 유전자의 염기서열과의 상동성이 가장 높은 것으로 나타났다. 상기 여러 특성으로 보아 분리균은 바실러스 서브틸리스에 가까운 것으로 판단되었다.

실시예 2 : 바실러스 속 AMX-4 균주의 자일라나제 유전자의 크로닝

단계1 : 바실러스 AMX-4의 유전자 라이브러리 제조

실시예 1에서 분리·동정된 바실러스 속 AMX-4 균주를 LB 액체배지 200 mL에 접종하여 37℃에서 대수 증식기까지 진탕 배양하고, 균체 배양액을 원심분리하여 회수한 균체를 TEN 완충용액 (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM EDTA, 10 mM NaCl)으로 세척한 후 라이소자임을 첨가한 SET 완충액 (20% 수크로즈, 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 50 mM EDTA) 20 mL에 현탁하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 여기에 10% 소디움 도데실설페이트(SDS)를 2 mL 첨가하여 균체를 용해시키고, 프로테아제 K를 적당량 처리하여 37℃에서 1 시간 동안 방치하였다. 페놀을 첨가하고 원심분리한 후 상등액을 모아 두배 부피의 차가운 에탄올을 첨가하여 엉기는 염색체 DNA를 유리봉으로 감아올려 70%, 80%, 90% 에탄올에서 순차적으로 세척한 후, 적정부피의 TE 완충용액 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 녹였다.

분리된 염색체 DNA 50㎍을 제한효소 Sau3AI으로 부분 절단한 후 아가로즈 겔 전기영동하여 크기가 0.5∼10kb 크기의 DNA 단편을 회수하였다. 제한효소 BamHI으로 완전히 절단한 플라스미드 pUC19와 염색체 절단체를 동량 섞고 T4 DNA 리가제를 첨가하여 14℃에서 15시간 반응시켜 연결반응을 실시하여 바실러스 AMX-4의 유전자 라이브러리 제조하였다.

단계2 : 자일라나제 유전자를 갖는 대장균 형질전환체의 선별

단계1 에서 얻은 바실러스 AMX-4의 유전자 라이브러리를 이용하여 대장균 XL-1을 형질전환시키고 LB-자일란 한천배지에 도말하여 약 10,000개의 형질전환체를 얻었다. 이들 형질전환주 중 콜로니 주변에 자일란 분해환을 보이는 형질전환체 1 주 선발함으로써 자일라나제 유전자를 포함하는 대장균 형질전환체를 획득하였다.

실시예 3 : 본 발명 자일라나제를 코드하는 유전자 염기배열의 결정

실시예 2의 단계2 에서 얻은 형질전환체를 앰피실린 (50 mg/L)을 첨가한 LB 액체배지에서 키워 얻은 균체로부터 알칼리 분해방법 (Birnboim, H. C. and J. Doly, Nucleic Acid Res. 7, 1513-1523 (1979))으로 플라스미드를 분리하고 여러 가지 제한효소를 처리하여 조사한 결과 재조합 플라스미드는 약 0.8kb 크기의 클론된 DNA 단편을 함유하고 있었으며, 이 재조합 플라스미드를 pXT4로 명명하였다. pXT4의 제한효소 지도를 도 1에 표시하였다. 도 1에서 Xyl은 본 발명의 자일라나제 유전자를 포함하는 DNA 단편이다.

플라스미드 pXT4에 있는 클론된 0.8kb DNA 단편의 염기서열을 결정하기 위해 여러 가지 제한 효소를 이용하여 단편을 작은 조각으로 나누어 pUC19에 삽입시켜 디데옥시뉴클레이티드 시퀀싱 (dideoxynucleotide sequencing) 방법으로 총 748 bp의 염기서열을 결정하였다. 이 염기서열에는 자일라나제의 구조유전자에 해당하는 총 642 bp의 오픈리딩프레임 (open reading frame)이 존재하였다 (서열번호 1). 이러한 구조유전자의 염기배열로부터 추론된 자일라나제 효소의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸 것으로 총 213개 아미노산으로 이루어진 단백질이다. 이렇게 밝혀진 바실러스 속 AMX-4의 자일라나제 유전자의 염기배열로부터 유추된 자일라나제의 아미노산 배열을 기존에 밝혀진 바실러스 속 균주의 자일라나제의 아미노산 배열의 유사성이 높은 것을 조사한 결과 213개 아미노산으로 구성된 자일라나제 (Jeong, K. J., P. C. Lee, I. Y. Park, M. S. Kim, and S. C. Kim, Enzyme Microb. Technol. 22, 599-605 (1996))와 약 95.3%의 상동성을 보이며 213개 아미노산 중 10개 아미노산 배열의 차이가 있었다.

실시예 4 : 본 발명 형질전환된 대장균의 발현에 의해 생산되는 자일라나제 활성의 조사

상기 실시예 3에서 제조된 재조합 플라스미드 pXT4를 함유한 대장균 형질전환체를 발현시켜 생산되는 자일라나제의 반응온도와 pH에 따른 가수분해 활성을 조사하기 위하여, 앰피실린 (50 mg/L)을 첨가한 LB 액체배지에 pXT4로 형질전환된 대장균 형질전환주를 접종하여 37℃에서 16시간 동안 진탕 배양하고 배양된 균체를 초음파 파쇄한 후 파쇄액을 황산 암모니움염 분획, 이온 크로마토그래피, 농축과정을 통해 효소를 정제한 다음, 이 정제된 효소를 반응온도와 pH를 달리하여 귀리 자일란에 반응시킴으로써 자일라나제 활성을 측정하였다. 실험결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 50∼55℃와 pH 7.0에서 최고의 효소 활성을 보였으며 pH 5.0∼7.0 범위에서는 90% 이상의 활성을 보였다. 특히 동물 장내의 생리적 조건인 pH 6.5에서 최고활성의 98% 이상에 해당하는 활성을 보였다. 한편 사료첨가제로 사용시 위를 통과하는 과정에서 불활성화 되지 않는 것이 중요하므로 pH에 따른 자일라나제의 안정성을 분석하기 위해 정제된 효소를 pH를 3.0∼9.0 범위의 서로 다른 완충액에 1시간 동안 방치한 후 효소의 잔존 활성을 측정하였다. 실험결과 표 2에 나타낸 바와 같이 pH 4.0∼8.0 범위에서는 잔존활성이 90% 이상이었으며, pH 3.0에서는 약 88%의 잔존활성을 보였다. 따라서 위와 유사한 조건인 pH 3.0에서 방치시간을 달리하면서 잔존활성을 조사한 결과 4시간 방치시까지 약 85% 이상의 잔존활성을 보이는 것으로 나타났다.

또한, 정제된 자일라나제를 이용하여 자일란의 종류에 따른 효소 활성을 측정하기 위해 아라비노자일란, 귀리 자일란, 자작나무 자일란의 가수분해 상대 활성도을 비교하였다. 이때 반응 조건은 pH 7.0과 50℃로 하여 반응을 수행하였다. 실험결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 사료원료로 많이 사용되는 소맥 유래의 자일란인 아라비노자일란의 가수분해력이 귀리 자일란의 가수분해력 보다 높은 것으로 확인되었다.

이와 같은 결과를 살펴볼 때 본 발명 바실러스 속 AMX-4 균주의 자일라나제 유전자를 함유하는 대장균 형질전환체에 의해 생산되는 자일라나제는 사료첨가에 적합함을 알 수 있었다.

본 발명 형질전환된 대장균의 발현에 의해 생산되는 자일라나제의 자일란 종류에 따른 활성도 비교

기질의 종류	상대 활성치 (%)
아라비노 자일란	100
자작나무 자일란	83
귀리 자일란	70

본 발명 형질전환된 대장균의 발현에 의해 생산되는 자일라나제의 pH에 따른 활성

pH	3.0	4.0	5.0	6.0	7.0	8.0	9.0
잔존활성의 상대활성치(%)	88.0	90.3	93.2	100	100	97.3	84.8

실시예 5 : 본 발명 형질전환된 대장균의 발현에 의해 생산되는 자일라나제의 자일란 가수분해 산물 조사

실시예 4에서 얻어진 정제된 자일라나제에 의한 자일란 최종반응 산물을 분석하기 위해 귀리 자일란을 기질로 하여 최적 반응조건하에서 가수분해 반응을 실시하고 최종 가수분해 산물을 박층 크로마토그래피(TLC)를 하였다. 그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이 최종산물로 자일로즈는 생성되지 않고 자일로바이오즈와 자일로트리오즈, 자일로테트라오즈 등이 생성되었다. 이는 본 발명 자일라나제에 의한 자일란 가수분해 산물과 실시예 3에서 볼 수 있는 바와 같이 본 발명 자일라나제와 아미노산 배열의 유사도가 높은 것으로 분석된 바실러스 속 균주 유래의 자일라나제에 의한 자일란 가수분해 산물 (Jeong, K. J., I. Y. Park, M. S. Kim, and S. C. Kim, Appl. Microbiol. Biotechnol. 50, 113-118 (1998))을 비교한 결과 본 발명 자일라나제에 의한 가수분해 산물로서 자일로즈가 생성되지 않는다는 것이 가장 큰 차이점으로 확인되었다. 또한 자일로바이오즈, 자일로트리오즈, 자일로테트라오즈, 자일로펜토즈를 기질로 하여 본 발명 자일라나제를 각각 반응시킨 후 가수분해 산물을 박층 크로마토그래피를 수행하여 조사한 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 자일로바이오즈와 자일로트리오즈를 분해하지 않았으며, 자일로테트라오즈와 자일로펜토즈를 자일로바이오즈와 자일로트리오즈로 분해하는 것이 확인되었고, 이때도 반응산물에는 자일로즈가 없는 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명의 자일라나제는 자일란 물질을 분해하여 기능성이 우수한 자일로올리고당을 생성하는 것으로 나타났다.

상기에서 설명한 바와 같이 본 발명 바실러스 속 AMX-4 균주의 자일라나제 유전자를 도입하여 형질전환된 대장균의 발현에 의해 생산된 자일라나제는 소맥, 귀리, 자작나물 유래 자일란의 가수분해에 뛰어난 효과가 있을 뿐만아니라, 그 가수분해 산물은 동물의 장내 유용세균의 성장인자로 작용하는 자일로바이오즈와 자일로트리오즈를 포함한 자일로올리고당이므로 식사료 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 본 발명 바실러스 속 AMX-4 균주의 자일라나제를 코드하는 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 pXT4의 제한효소 지도이다.

도 2는 본 발명 재조합 플라스미드 pXT4를 함유한 대장균 형질전환체가 생산하는 자일라나제의 반응온도와 반응 pH에 따른 활성을 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명 재조합 플라스미드 pXT4를 함유한 대장균 형질전환체가 생산하는 자일라나제에 의한 귀리 자일란의 최종 분해 산물의 박층크로마토그래피 사진이다.

도 4는 본 발명 재조합 플라스미드 pXT4를 함유한 대장균 형질전환주가 생산하는 자일라나제에 의한 자일로바이오즈, 자일로트리오즈, 자일로테트라오즈, 자일로펜토즈의 최종 분해 산물의 박층크로마토그래피 사진이다.

<110> CTC BIO,INC. <120> Gene sequences of xylanase biosynthesis enzyme and transformant thereof <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 642 <212> DNA <213> Bacillus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(639) <400> 1 atg ttt aag ttt aaa aag aat ttc tta gtt gga tta acg gca gca tta 48 Met Phe Lys Phe Lys Lys Asn Phe Leu Val Gly Leu Thr Ala Ala Leu 1 5 10 15 atg agt att agt ttg ttt tca gca agc gct tct gca gct ggc aca gac 96 Met Ser Ile Ser Leu Phe Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Gly Thr Asp 20 25 30 tac tgg caa aat tgg act gat ggg ggc gga aca gta aac gct gtc aat 144 Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr Val Asn Ala Val Asn 35 40 45 gga tct gga gga aat tac agt gtt aat tgg tct aat acc gga aat ttc 192 Gly Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Ser Asn Thr Gly Asn Phe 50 55 60 gtt gtt ggt aaa ggt tgg act aca ggt tcg cca ttt agg aca ata aac 240 Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Pro Phe Arg Thr Ile Asn 65 70 75 80 tat aat gcc ggt gtt tgg gcg cct aat ggc aat gga tat ttg act tta 288 Tyr Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Gly Tyr Leu Thr Leu 85 90 95 tat ggt tgg acg aga tca cct ctc atc gaa tat tat gta gtg gat tca 336 Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser 100 105 110 tgg ggt act tac aga cct acc gga acg tat aaa ggt act gta aac agt 384 Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Asn Ser 115 120 125 gat gga ggt aca tat gac atc tat aca acg aca cgt tat aat gca cct 432 Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro 130 135 140 tcc att gat ggc gat aac act act ttt acg cag tac tgg agc gtc cgt 480 Ser Ile Asp Gly Asp Asn Thr Thr Phe Thr Gln Tyr Trp Ser Val Arg 145 150 155 160 cag acg aag aga cca act gga atc aac gct gca atc act ttc agc aat 528 Gln Thr Lys Arg Pro Thr Gly Ile Asn Ala Ala Ile Thr Phe Ser Asn 165 170 175 cat gtt aac gca tgg aag agt cat gga atg aat ctg ggc agt aat tgg 576 His Val Asn Ala Trp Lys Ser His Gly Met Asn Leu Gly Ser Asn Trp 180 185 190 tct tac caa gtc tta gcg aca gag gga tat caa agt agt gga agt tct 624 Ser Tyr Gln Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser 195 200 205 aac gta aca gtg tgg t aa 642 Asn Val Thr Val Trp 210 <210> 2 <211> 213 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 2 Met Phe Lys Phe Lys Lys Asn Phe Leu Val Gly Leu Thr Ala Ala Leu 1 5 10 15 Met Ser Ile Ser Leu Phe Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Gly Thr Asp 20 25 30 Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr Val Asn Ala Val Asn 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Ser Asn Thr Gly Asn Phe 50 55 60 Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Pro Phe Arg Thr Ile Asn 65 70 75 80 Tyr Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn Gly Tyr Leu Thr Leu 85 90 95 Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser 100 105 110 Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Asn Ser 115 120 125 Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro 130 135 140 Ser Ile Asp Gly Asp Asn Thr Thr Phe Thr Gln Tyr Trp Ser Val Arg 145 150 155 160 Gln Thr Lys Arg Pro Thr Gly Ile Asn Ala Ala Ile Thr Phe Ser Asn 165 170 175 His Val Asn Ala Trp Lys Ser His Gly Met Asn Leu Gly Ser Asn Trp 180 185 190 Ser Tyr Gln Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser 195 200 205 Asn Val Thr Val Trp 210

Claims (6)

1. 서열번호 1의 핵산 서열로 표시되는 유전자.
2. 제 1항 기재의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
3. 제 2항 기재의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 대장균.
4. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 자일라나제.
5. 제 3항 기재의 형질전환된 대장균을 배양하는 것을 특징으로 하는 제 4항의 재조합 자일라나제를 제조하는 방법.
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