KR101018790B1

KR101018790B1 - 자일라나아제를 생산하는 신규한 페니바실러스 ｓｐ. ＨＰＬ-001 균주, 이로부터 분리한 신규한 자일라나아제 효소 및 이의 생산 방법

Info

Publication number: KR101018790B1
Application number: KR1020080079939A
Authority: KR
Inventors: 황인택; 박노중; 임희경; 송하영; 조수진; 이종길; 황진수; 김영철; 육신홍; 장종산
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2008-08-14
Filing date: 2008-08-14
Publication date: 2011-03-03
Also published as: KR20100021175A; WO2010018948A2; WO2010018948A3

Abstract

본 발명은 자일라나아제를 생산하는 신규한 페니바실러스 속 균주, 이로부터 분리한 신규한 자일라나아제 효소 및 이의 생산 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 버섯 재배용 목재 잔재가 포함된 토양 시료에서 분리한 신규한 페니바실러스 sp. HPL-001 균주 및 이 균주가 분비하는 자일라나아제 효소 유전자의 염기서열, 상기 유전자가 코딩하는 아미노산 서열 및 이를 형질전환 시킨 균주를 제공하며, 본 발명의 신규한 페니바실러스 sp. HPL-001 균주 및 자일라나아제는 다양한 섬유소 바이오매스의 주성분인 자일란을 분해시킴으로서 바이오 연료 및 대체원료, 특수기능물질, 바이오 폴리머 등의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

페니바실러스 속, 자일라나아제 유전자 및 대량생산, 효소정제

Description

자일라나아제를 생산하는 신규한 페니바실러스 ｓｐ. ＨＰＬ-001 균주, 이로부터 분리한 신규한 자일라나아제 효소 및 이의 생산 방법{A Paenibacillus sp. HPL-001 strain for producing xylanase and a xylanase produced thereby and a producing method thereof}

본 발명은 자일라나아제를 생산하는 신규한 페니바실러스 sp. HPL-001 균주, 상기 균주가 분비하는 자일라나아제 효소, 상기 효소의 유전자의 염기 서열, 상기 유전자가 코딩하는 아미노산 서열 및 이를 형질전환 시킨 형질전환체에 관한 것이다.

20세기 중반부터 석유를 중심으로 한 화학산업이 크게 발달하여, 정밀 화학제품(Fine Chemicals), 의약품(Pharmaceutical Chemicals), 범용화학제품(Bulk Chemicals), 플라스틱 및 연료에 이르는 다양한 제품들이 석유로부터 생산되게 되었다. 그러나 화석원료로 대표되는 석유, 가스 및 석탄은 그 자원의 한정성으로 인하여 가격이 지속적으로 상승하고 있으며, 이의 원활한 확보를 위한 국가 간 경쟁 이 가열되고 있다. 더욱이 화석원료로부터 부산물로 생성되는 지구온난화 가스와 폐기물은 인류에게 심각한 환경 위기를 초래하고 있으며, 이는 기존의 화학산업을 급격히 위축시키는 요인이 되고 있다. 따라서 화석원료에 기반을 둔 화학공정을 대체할 수 있는 원료 바이오매스(Biomass) 원료에 기반을 둔 환경친화적 생물화학공정의 개발 필요성이 급격하게 부상되고 있다. McKinsey 보고서(2003)에 따르면 현재 약 5%의 화학제품이 생물공정으로 생산되고 있지만 그 비중은 급격히 증가하여 2010년경에는 약 10~20%(금액으로는 2,800억 달러) 2050년경에는 약 50%에 이를 것이며, 특히 정밀 화학분야에서는 2010년까지 총생산물의 60%를 바이오매스원료를 기반으로 하는 환경친화적 생물화학공정(Biorefinery)이 담당할 것으로 예상하고 있다. 따라서 세계적으로 많은 국가들은 바이오매스를 원료로 하는 생물화학공정에 대한 연구를 수행 중에 있다.

매년 엄청난 양의 바이오매스가 농림산업으로부터 쏟아지고 있으며, 이것들의 대부분은 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스로 이루어져 있다. 헤미셀룰로오스는 지구상에서 셀룰로오스 다음으로 풍부한 탄수화물로 연간 약 450억 톤이 생산되고 있지만, 대부분이 폐자원으로 처리되고 있는 실정이다. 그러나 이 바이오매스를 당화과정(Saccharification)을 거처 단당류로 만들게 되면 유용한 자원이 되는 것이다. 이로 인한 경제적 부가가치는 경제적으로 엄청나지만, 아직까지는 이 바이오매스를 현실적으로 이용하기엔 기술적으로 부족한 점이 많다.

이들 바이오매스 원료를 기반으로 하는 바이오리파이너리 기술은 바이오 연료개발 중심으로 최근 5년 사이에 급성장하고 있는 분야로서 그 가운데 목 질(Lignocellulose)계 생물자원의 전환기술과 바이오 화학제품 제조기술은 현재 첨단 신기술 분야로 인식되고 있다. 바이오리파이너리 기술에는 바이오매스의 생산량 증대 및 수거, 전처리, 효소/촉매 발굴, 생물/화학적 전환기술, 고부가가치 신화학물질 합성/분리/정제, 완제품 생산기술 등을 포함하고 있다. 특히 섬유소계 생물자원 전환을 위한 당화효소 및 균주개발은 생물자원을 유효 화학자원화하기 위한 핵심 원천기술이기 때문에 대표적으로 셀룰로오스(38%)와 헤미셀룰로오스(28%)의 당화효소 대량생산을 위한 균주 및 기술개발에 전 세계적 관심이 집중되고 있다. 따라서 저렴한 비용으로 재생 가능한 섬유소계 바이오매스를 당화하여 다양한 바이오매스 기반 제품(Biomass-Based Products)을 생산한다면 고갈되어가는 화석연료를 대체하고 이산화탄소(CO₂)를 줄여 자연환경을 보존하면서 인류의 지속적인 발전을 달성할 수 있을 것이다(Angenent et al., Trends in Biotechnology 22(9), 477-485, 2004; Demain et. al., Microbiology and Molecular Biology Rev., 69(1), 124-154, 2005; Kamm and Kamm Applied Microbiology and Biotechnology, 64(2), 137-145, 2004; Percival et. al., Biotechnology Advances, 24(5), 452-481, 2006).

목질계 섬유소 원료를 당화하여 바이오연료와 화학원료를 생산하는 공정에서는 목질계 원료 속에 포함되어 있는 15~30%의 자일란이 부산물로 생성되는 것은 피할 수 없다. 그러므로 셀룰라아제를 이용한 섬유소의 당화공정 개발에는 자일란의 이용기술도 반드시 동시에 이루어져야 할 것이다. 자일란의 이용에는 자일라나아제 를 이용하여 자일로스를 생산하는 것이며, 이 과정에서 중요한 것은 목질계 원료로부터 자일란의 효율적인 추출과 고역가의 자일라나아제 대량생산기술의 확보이다.

자일란의 가수분해는 현재까지 화학적 방법으로 주로 이루어지고 있다. 화학적 방법에 의한 자일란의 분해방법은 섬유소계 바이오매스에 황산을 첨가하여 130^oC에서 스팀으로 가압하여 분해하므로 많은 양의 에너지를 소모할 뿐만 아니라 산 및 고온에 견딜 수 있는 고가의 장치가 필요하다. 또한 이때 발생하는 폐기물의 처리비용 등으로 인하여 생산단가가 높아지게 된다.

이에 반하여 자일라나아제를 이용하는 생물학적 방법에 의한 자일란의 분해방법은 화학적 분해방법과 비교할 때 에너지의 소모가 적고 발생하는 폐기물 역시 소량일 뿐만 아니라, 그 처리가 용이하기 때문에 경제적으로도 매우 유리하다. 그러나 이러한 효소시스템의 문제점은 효소 역가가 낮아 반응속도 및 분해율이 낮고 기존에 알려진 효소들의 특성이 산업적으로 이용하기에 부족한 점이 많다는 것이다. 또한 산업적으로 경제적인 자일라나아제 생산을 위해서는 대량생산 체제를 갖추어야 할 것이다. 따라서 높은 분해력을 가진 신규의 자일라나아제 효소계의 개발이 필요하며, 산업화하기 위해서는 개발된 재조합 균주가 자일란 분해효소를 대량 생산할 수 있는 조건의 확립과 효소를 이용한 새로운 반응기의 설계 및 생산기술의 확립이 필요하다. 따라서 산업에 직접적인 이용을 위해서는 기존의 자일라나아제가 아닌 신규의 미생물 및 효소 시스템을 탐색하여 높은 온도 및 pH 조건하에서도 활성도를 유지하는 자일라나아제 유전자의 확보가 필요하며, 이를 통하여 기존의 특허 등으로 인해 발생하는 문제를 해결할 수 있을 것이다.

헤미셀룰로오스의 주성분인 자일란을 자일로스로 분해하여 당화하는데, 일반적으로 세 가지 종류의 효소 즉, 엔도 자일라나아제(Endo-β-xylanase), 엑소 자일라나아제(Exo-β-xylanase) 및 자일로시다아제(β-xylosidase)가 함께 작용해야 하는 것으로 알려져 있으며 이들을 자일라나아제 효소로 통칭하고 있다(Biely P. Trends in Biotechnology 3(11), 286-290, 1985). 지금까지 보고된 자일라나아제의 생산 미생물로 트리코더마(Trichoderma) 속 곰팡이 균주들이 주로 이용되어 왔는데 이들의 효소 생산성은 자일라나아제를 생산하는 세균의 효소 생산성에 비해 대체로 우세하며 주로 산성조건에서 최대 활성을 나타낸다(Tenkanen et. al., Enzyme and Microbial Technology, 14(7), 566-74, 1992). 자일라나아제를 생산하는 세균으로는 애로모나스(Aeromonas) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 아스퍼질루스(Apspergillus) 속 등에 속하는 다양한 종류가 있으며, 세균에 따라 생산하는 자일라나아제의 반응특성도 다양하며, 이들 효소를 암호화하는 유전자들도 다양하게 보고 되어있다.

자일라나아제 효소에 대한 국내외 기술현황으로는 경희대 정대균 박사 팀에 서 섬유소 분해효소를 생산하는 Trichoderma sp. C-4 균주를 선별하였지만 산업화를 위해서는 더 높은 활성이 요구되고 있다(Sul et. al., Appl Microbiol Biotechnol. 66(1), 63-70, 2004). 동해대 강명규 박사 팀에서 내알카리성 자일라나아제를 생산하는 Cephalosporium sp. RYM-202 균주를 선별하여 펄프공정에 이용가능성을 연구하고 있다(강명규 외, 한국환경생물학회지 17(2), 191~198, 1999). KAIST의 김정회 교수 팀에서는 Bacillus 유래의 효소(Endoxylanase)를 세포외부로 생산하는 재조합 균주인 Bacillus subtilis DB104/pJHKJ4를 구축하였다(Kim J.H. et. al., J. Microbiol. Biotechnol., 10(4), 551-553, 2000)

국외의 경우 대만에서는 혐기성 곰팡이 Neocallimastix patriciarum으로부터 유전자 복제된 자일라나아제가 방향적 효 소진화 방법을 통하여 내염기성이 증가된 사례가 있으며(Yew-Loom Chen, et. al., Can. J. Microbiol. 47(12), 10881094, 2001). 최근에는 펄프공정 후 발생하는 폐수로부터 내염기성 균주인 Bacillus firmus가 분리 동정되었다(Pochih Chang, Biochemical and Biophysical Research Communications 319, 10171025, 2004). 이 자일라나아제는 pH 4부터 pH 11까지의 고른 범위에서 높은 활성을 가지고 있으며, 62℃에서 16시간을 배양하여도 초기 활성의 70% 정도의 잔여활성을 보일 정도로 높은 내열성을 가지고 있다. 이와 같이 세계 여러 나라에서 다양한 균주를 발굴하고 방향진화적인 진화를 통하여 기능을 향상시키고 있다.

기존의 자일라나아제와 관련된 특허를 살펴보면 자일라나아제를 생산하는 균주를 동정한 후 이들 야생균주를 이용하거나 대장균 등을 이용한 재조합 균주를 만 들어 자일라나아제를 생산하는 방법을 이용하고 있다(WO 제93/08275호, WO 제92/01793호, WO 제92/17573호, 국내특허 제10-0072225호, 제10-02211204호, 제10-0411771호). 또한 사료첨가제로서의 자일라나아제 관련 특허로는 자일라나아제를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속 ＷＬ-2 균주에 대한 특허(대한민국 공개특허 제2001-0111986호), 고초균 유래 엔도 자일라나아제의 신호서열 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 및 그를 이용한 외래단백질의 제조방법에 관한 특허(대한민국 공개특허 제2000-0034279호), 바실러스 속 AMX-4(Bacillus sp. AMX-4) 균주의 자일라나아제(Xylanase)를 코드화 하는 신규한 자일라나아제 유전자(대한민국 공개특허 제2003-0085679호) 등이 있다.

본 발명의 목적은 자일라나아제를 생산하는 신규한 페니바실러스 sp. HPL-001 균주, 이로부터 분리한 신규한 자일라나아제 효소에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자일라나아제를 생산하는 페니바실러스 sp. HPL-001 균주(KCTC11365BP)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주로부터 생산되는 자일라나아제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 암호화하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 형질전환체를 이용한 자일라나아제 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 형질전환체가 생산하는 자일라나아제를 포함하는 자일란 분해제를 제공한다.

또한, 본 발명은 섬유소계 바이오매스에 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 형질전환체가 생산하는 자일라나아제를 가하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 동물의 사료 재료에 섬유소계 바이오매스에 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 및 형질전환체가 생산하는 자일라나아제를 가하는 단계를 포함하며, 자일란 분해제를 포함하는 사료 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 식품 가공용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 사료첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 제지공정용 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 자일라나아제를 자일란 함유액에 처리하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법을 제공한다.

본 발명의 신규 균주인 페니바실러스(Paenibacillus) sp. HPL-001 및 이로부터 분리한 자일라나아제는 비교적 넓은 범위의 온도 및 pH 조건에서 우수한 자일란 분해활성을 나타내므로 사료 산업, 제지 및 세제 산업에서는 물론 섬유질계 바이오매스의 당화공정에 활용되어 석유 대체원료, 특수기능물질, 바이오 폴리머 등의 원료를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

1. 본 발명은 자일라나아제를 생산하는 페니바실러스 sp. HPL-001 균주 (KCTC11365BP)를 제공한다.

본 발명의 페니바실러스 sp. HPL-001 균주는 버섯 재배 후 폐기된 목재의 잔여물과 톱밥이 포함된 토양 시료로부터 분리되는 것이 바람직하다. 본 발명자들은 충북 옥천군 군서면에 위치한 장수풍뎅이 사육농장에서 채취한 토양시료로부터 본 발명의 균주를 분리하였다. 보다 상세하게는 상기 토양시료를 희석하여 존재하는 균주들을 단일 콜로니로 분리한 후 자일란 분해능을 측정하여 그중 자일란 분해능이 뛰어난 균주를 선별하였다. 상기 선별된 균주를 동정한 결과, 그람 양성 간균이며, 1.1 μm의 세포크기와 2.5 μm 내지 4 μm의 세포길이를 갖는 막대형이며, 편모를 가지지 않은 운동성 없는 간균이었다(도 1 참조). 본 발명의 페니바실러스 sp. HPL-001 균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA를 가지며, 뛰어난 자일라나아제 활성을 가진다(도 1 참조).

상기 균주의 16S rRNA 염기서열 분석 결과(표 1 참조), 페니바실러스 시네리스 균주와 98.5%의 상동성이 있고, Paenibacillus favisporus(T); GMP01; AY208751과는 97.2%, Paenibacillus favisporus: GMP03; AY308758과 97.7%가 일치함을 확인하였으며, 본 발명의 상기 균주를 페니바실러스(Paenibacillus) sp. HPL-001로 명명하고, 한국생명공학연구원에 2008년 7월 17일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC11365BP이다.

2. 본 발명은 페니바실러스 sp. HPL-001 균주로부터 생산되는 신규한 자일라 나아제 효소를 제공한다.

이후 본 발명자들은 상기 페니바실러스 sp. HPL-001 균주로부터 자일라나아제 활성을 가지는 효소 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하기 위하여 페니바실러스 균주의 게놈 DNA를 추출 후 5 kb이하 크기의 유전자 조각을 가지는 gDNA 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리의 제작은 균주로부터 추출한 DNA를 무작위 절단방법을 통하여 1~6 kb 크기의 DNA 조각들을 만들고, 아가로스 젤(Agarose gel)에서 전기영동으로 크기를 선발(Size Selection)하여 원하는 5 kb전후 크기의 DNA 조각을 확보하였다. 이를 pCB31 플라스미드 벡터(Plasmid Vector)에 삽입 후 E. coli DH10B 세포에 형질전환 시켰다. 이렇게 제작된 라이브러리 1,536개의 클론을 고상, 액상 조건에서 자일라나아제 활성을 시험하였다. 상기 실험을 통해 10개의 클론을 선별하였고, 이 중 활성도가 제일 높았던 2H6 클론(도 2 참조)에 삽입된 절편 DNA의 염기서열을 분석하였다.

분석 결과 DNA 절편의 크기는 5,487 bp이었고, 아미노산 400개 이상의 범위에 7개의 ORF를 포함하고 있음을 확인하였다(도 3 참조). 본 발명자들은 상기 ORF를 표적으로 하는 프라이머를 제작하고 PCR 방법으로 DNA를 증폭한 후 대장균에 형질전환 하였으며, 상기 각각의 ORF를 형질전환 시킨 대장균을 대상으로 액체배양 및 고체배양을 통하여 자일라나아제 활성을 확인하였다. 그 결과 ORF7로 명명된 DNA 절편에서 자일라나아제 활성이 뛰어남을 확인하였다(도 4 참조).

상기 ORF7의 염기서열은 서열번호 2로 기재되어 있으며, 상기 996 bp 염기 서열을 KRICT PX1이라 명명하였다. 또한, 상기 염기서열이 암호화하는 아미노산 서 열은 서열번호 3으로 기재되었으며, 332개의 아미노산 잔기로 구성되어 있음을 확인하였다. 상기 KRICT PX1으로 암호화된 아미노산 서열을 이용하여 유사성 분석을 한 결과, 비배양박테리아의 인트라셀룰라 자일라나아제와 70%, 페니바실러스 종의 엔도-1,4-베타 자일라나아제와 68%, 지오바실러스 스리아로더미플러스의 인트라셀률라 자일라나아제와 67%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 이로써 본 발명의 자일라나아제 효소를 암호화하는 유전자는 신규한 자일라나아제 유전자임을 확인하였다(도 5 참조).

상기 신규한 자일라나아제의 효소 활성을 조사하기 위하여 최적 조건을 확인한 결과 pH 6.0 내지 7.0에서, 온도 45℃ 내지 50℃에서 최대 활성을 나타냄을 확인하였다(도 6 내지 도 7 참조). 또한 중금속 원으로 첨가한 여러 가지 원소들 중에서 1 mM의 Cu⁺², Zn⁺², Fe⁺³등에 의해서 85%, 77%, 94% 저해되었지만 100 μM 이하에서는 영향을 받지 않거나 효소활성을 다소 증가시키는 것으로 나타났다(표 2 참조).

이후 본 발명자들은 신규한 자일라나아제 유전자로 분리된 KRICT PX1 유전자를 pIVEX-GST 단백질 발현 벡터에 재조합하여 KRICT PX1을 형질전환 시킨 대장균으로부터 자일라나아제를 대량으로 생산하기 위하여 몇 가지 레진 결합 벡터를 사용하여 분리정제 효율을 비교 선별하였고, 형질전환 대장균으로부터 생산, 분리정제한 자일라나아제의 반응특성(Enzyme Kinetics)을 분석하였다. 분리정제 효율을 높이기 위해서는 생산된 자일라나아제가 상징액으로 용존 되는 비율이 높아야 하는 데, 타 벡터들도 50% 내외의 용존율을 보였지만 용존율이 가장 높았던 벡터로서는 글루타치온-레진 결합 벡터이었고, 상징액으로의 용존율은 70% 이상을 보이면서 레진이 결합된 상태로서도 자일라나아제 활성에는 변함이 없었다. 생산된 효소의 반응특성으로 기질친화력을 표현하는 K_m 값은 3.16으로, 반응속도를 나타내는 V_max는 15.4로 나타났다(도 8 내지, 도 9 내지, 도 10 참조).

1) 본 발명은 상기 자일라나아제를 암호화하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 자일라나아제를 암호화하는 유전자는 하기의 서열 중 어느 하나를 포함하는 것이 바람직하다: a) 서열번호 2에 기재된 염기 서열; b) 서열번호 2에 기재된 염기 서열과 95% 상동성을 가지는 염기 서열; c) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열; d) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열; e) 서열번호 2에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화 되는 DNA 염기 서열이며, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 염기 서열.

상기 엄격한 조건은 혼성화 후 세정 시에 결정된다. 엄격한 조건 중의 하나는 상온에서 6×SSC, 0.5% SDS로 15분 세정한 뒤 45℃에서 2×SSC, 0.5% SDS로 30 분간의 세정하고, 50℃에서 0.2×SSC, 0.5% SDS로 30분간의 세정을 두 번 반복한다. 더 바람직한 엄격한 조건은 더 높은 온도를 이용하는 것이다. 상기 엄격한 조건의 다른 부분은 동일하게 수행하되 마지막의 두 번의 30분은 60℃에서 0.2×SSC, 0.5% SDS로 세정한다. 또 다른 엄격한 조건은 상기 엄격한 조건에서 마지막 두 번을 65℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS로 세정하는 것이다. 당업자라면 필요한 엄격한 조건을 얻기 위하여 이러한 조건을 명백히 설정할 수 있다.

2) 본 발명은 상기 자일라나아제의 아미노산 서열을 제공한다.

본 발명의 자일라나아제의 아미노산 서열은 하기의 서열 중 어느 하나를 포함하는 것이 바람직하다: a) 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열; b) 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열과 95% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열; c) 서열번호 2에 기재된 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열; d) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열; 및 e) 서열번호 2에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화 되는 DNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열이며, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열.

상기 엄격한 조건은 혼성화 후 세정 시에 결정된다. 엄격한 조건 중의 하나는 상온에서 6×SSC, 0.5% SDS로 15분 세정한 뒤 45℃에서 2×SSC, 0.5% SDS로 30분간의 세정하고, 50℃에서 0.2×SSC, 0.5% SDS로 30분간의 세정을 두 번 반복한 다. 더 바람직한 엄격한 조건은 더 높은 온도를 이용하는 것이다. 상기 엄격한 조건의 다른 부분은 동일하게 수행하되 마지막의 두 번의 30분은 60℃에서 0.2×SSC, 0.5% SDS로 세정한다. 또 다른 엄격한 조건은 상기 엄격한 조건에서 마지막 두 번을 65℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS로 세정하는 것이다. 당업자라면 필요한 엄격한 조건을 얻기 위하여 이러한 조건을 명백히 설정할 수 있다.

3. 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

발명은 페니바실러스 sp.HPL-001 균주로부터 분리한 자일라나아제를 코딩하는 신규한 유전자의 염기서열을 밝혔으므로 당업계 공지된 통상의 방법을 이용하면 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작할 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 상용화된 벡터를 이용할 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자가 적합한 재조합 벡터를 제조하여 이용하는 것도 무방하다.

4. 본 발명은 상기 재조합벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 사용할 수 있는 숙주세포는 한정된 것은 아니나, 대장균, 박테리아를 포함한 원핵세포, 효모, 동물세포, 곤충세포를 포함하는 원핵세포로 이루어진 군으로부터 선택하여 이용하는 것이 바람직하며, 대장균을 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

5. 상기 균주 또는 형질전환체를 이용한 자일라나아제 생산 방법을 제공한 다.

본 발명에 있어서, 자일라나아제는 하기의 방법에 의해 생산될 수 있다:

1) 배지에 본 발명의 페니바실러스 sp. HPL-001 균주(KCTC11365BP) 또는 본 발명의 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 조효소액을 수득하는 단계; 및

2) 단계 1)에서 수득된 조효소액에서 자일라나아제를 정제하는 단계.

상기 방법에 있어서, 배지는 본 발명의 페니바실러스 sp. HPL-001 균주(KCTC11365BP) 또는 본 발명의 형질전환체에 적합한 배지를 당업자에게 공지된 상용 배지 중에서 선별하여 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명자들은 정제과정을 단순화 시키면서 정제효율을 높이기 위한 방법으로 형질전환체를 제작할 때 컬럼크로마토그래피를 위한 특정 레진 결합 벡터를 사용하고, 정제과정에서는 레진에 결합된 효소만을 선별분리를 하는 것이 바람직하다. 엄격한 조건으로는 글루타치온 결합벡터, 칼모듈린 결합벡터, 말토스 결합벡터 등을 사용할 수 있으며, 컬럼 충진용 레진은 사용 벡터에 따라 결정된다. 본 발명에서는 글루타치온 결합벡터와 레진을 사용한 결과만을 제시하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

6. 본 발명은 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 형질전환체가 생산하는 자일라나아제를 포함하는 자일란 분해제를 제공한다.

본 발명의 자일란 분해제는 상기 균주 또는 상기 형질전환체에서 생산하는 자일라나아제뿐만 아니라 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 직접 자일란 분해제로 사용할 수 있다.

7. 본 발명은 섬유소계 바이오매스에 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 형질전환체가 생산하는 자일라나아제를 가하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 상기 형질전환체가 생산하는 자일라나아제의 첨가량은 당업자에 의해 조정될 수 있다.

8. 본 발명은 동물의 사료 재료에 섬유소계 바이오매스에 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 형질전환체가 생산하는 자일라나아제를 가하는 단계를 포함하며, 자일란 분해제를 포함하는 사료 제조 방법을 제공한다.

9. 본 발명은 상기 자일라나아제의 새로운 용도를 제공한다.

본 발명은 상기 자일라나아제를 포함하는 식품 가공용 조성물을 제공한다.

현재 자일라나아제 효소시장을 점유하고 있는 용도는 크게 식품, 사료 및 기술로 분류할 수 있다(Bedford and Morgana, World's Poultry Science Journal 52, 61-68, 1996). 식품(과일 및 야채생산, 양조 및 주류생산, 제빵 및 제과)시장에서는 재료의 연화 및 정제효율 개선, 점도감소, 추출 및 여과 효율증대 등을 통한 품질향상에 활용되고 있다. 사료시장에서는 돼지, 가금류, 반추동물 등의 사료의 비전분 탄수화물의 감소, 장내 점도개선, 단백질 및 전분의 소화흡수율 증대 등에 이용되고 있다(Kuhad and Singh, Crit. Rev. Biotechnol. 13, 151-172, 1993). 아울러 기술적으로는 제지공정에서 생물학적 백화공정, 염소소비의 감소, 기계적인 제지공정 단축을 통한 에너지 감소, 탈묵효과, 전분과 글루텐의 분리, 재생가능 연료(바이오에탄올) 및 화학원료생산 등에 활용되고 있다.

그러므로 본 발명의 신규한 자일라나아제는 용지 생산 및 폐지 재생, 사료 첨가 및 식품의 품질 향상 또는 산업상 사용하는 자일라나아제의 분해에 유용하게 이용될 수 있으며 이는 당업자에게 자명하다. 상기 조성물들은 당업자에게 공지된 방법으로 제형되고 제제화될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 균주 분리 및 선별

본 발명의 미생물은 충북 옥천군 군서면에 위치한 장수풍뎅이 사육농장에서 채취한 것으로 자세하게는 표고버섯 재배 후 폐기된 목재의 잔여물과 톱밥이 포함된 토양시료로부터 균주를 분리하였다. 상기 토양의 표층으로부터 2~5 ㎝ 층에서 토양시료를 채취, 풍건 후 2 ㎜ 채를 통과시켜 토양을 정선하였다. 정선된 토양 30 g을 270 ㎖의 멸균된 생리식염수(NaCl 8.0 g/ℓ)에 넣어서 진탕배양기(37℃, 200 rpm)로 약 20분간 진탕 후 상온에 30분 정도 방치하여 굵은 토양입자 및 불순물 등을 바닥으로 침전시킨 후 상징액을 멸균된 용기로 옮겨 1차 희석액으로 하였다. 이것을 잘 교반한 후 10 ㎖을 취하여 90 ㎖의 생리식염수에 넣어 2차 희석액 100 ㎖을 제조하고, 2차 희석액을 충분히 교반하면서 위와 같은 방법으로 10 ㎖을 취하여 90 ㎖의 생리식염수에 넣어 3차 희석액 100 ㎖을 제조하였다. 이후 동일한 방법으로 6차 희석액까지 제조하였다. 균주 분리용 TSA(Tryptic Soy Agar, Difco Co.) 배지에 3, 4, 5, 6차 희석액을 0.25 ㎖씩 3회 반복으로 분주, 균일하게 도말하여 37℃ 평상인큐베이터에서 2일간 배양 후 형성된 미생물의 콜로니를 선발하였다. 이때 콜로니의 모양, 크기, 색상 등 여러 가지 요인을 고려하여 분리하며, 분리된 콜로니는 다시 TSA 배지에서 계대 배양하여 순수한 균주를 분리하였고 이것을 모 균주로 사용하기 위하여 -70℃에 보관하였다. 순수하게 분리된 균주들 중에서 자일라나아제 활성을 가지는 활성 균주 선별은 TSA 배지에 자작나무 자일란(Fluka Bio Chemika. Co.)이 0.5~1.0% 함유된 소프트 아가 더블 배지를 만들고 균주를 접종하 여 하룻밤 배양한 후 다음날 Congo-red 염색법(Theater RM, PJ. Wood. Appl Environ Microbiol 43, 777-780, 1982; Beguin P. Analytical Biochemistry, 131(2), 333-336, 1983)을 통해 배양된 콜로니 주변에 투명환(Halo)을 형성하는 균주 및 활성클론을 선별하였다. 선별된 균주의 자일란 분해능을 다시 한 번 측정하여 재현성을 확인하였고, 그중 자일란 분해 능력이 가장 우수한 균주를 선발하여 자일라나아제를 생산하는 미생물로 최종 선발하였다(도 1).

< 실시예 2> 균주 동정

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리한 가장 높은 활성을 지닌 자일라나아제를 생산하는 균주를 30℃에서 배양한 후 그람 염색(Gram Staining) 및 포자 염색(Spore Staining)을 실시한 결과, 포자를 생성하는 그람양성 간균으로 확인되었다. 전자현미경으로 그 형태를 관찰한 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이 1.1 ㎛의 세포크기와 2.5 ㎛ 내지 4 ㎛의 세포길이를 갖는 막대형(rod)이었으며 편모를 가지지 않는 운동성이 없는 간균으로 나타났다. 또한, 균주의 16S rRNA 염기서열 분석결과 서열번호 1로 기재되는 1,440 bp의 rDNA를 얻어 유전자은행 정보자료(GenBank database) 검색 결과(표 1), 페니바실러스 시네리스(Paenibacillus cineris) 균주와 가장 높은 98.5% 상동성을 나타내고, Paenibacillus favisporus(T); GMP01; AY208751과 97.2%, Paenibacillus favisporus; GMP03; AY308758과 97.7% 일치하여 본 균주를 페니바실러스(Paenibacillus) sp. HPL-001 균주로 명명하였고, 한국생명공학연구원에 2008년 7월 17일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC11365BP이다.

16s rRNA (1,404 bp )를 통한 균주 동정을 위한 분석결과

domain(20) (match sequences)
phylum(20)
class(20)
order(20)
familyPaenibacillaceae(20)
genusPaenibacillus(20)
S000000859 not_calculatedBacillus sp. USC14; AF346495
S000105760 not_calculatedPaenibacillus chibensis JCM 9905; AB073194
S000130360 not_calculatedPaenibacillus amylolyticus NCIMB 8144; X60606
S000131211 not_calculatedPaenibacillus azoreducens (T); CM1; AJ272249
S000366497 not_calculatedPaenibacillus cineris (T); type strain:LMG 18439;AJ575658
S000366498 not_calculatedPaenibacillus cineris LMG 21976; AJ575659
S000401711 not_calculatedPaenibacillus favisporus (T); GMP01; AY208751
S000405010 not_calculatedPaenibacillus sp. 448-L5; AY266990
S000405599 not_calculatedPaenibacillus favisporus KNUC56; AY279193
S000406592 not_calculatedPaenibacillus favisporus GMP03; AY308758
S000426261 not_calculatedPaenibacillus sp. 2; AY745242
S000549738 not_calculatedPaenibacillus rhizosphaerae (T); CECAP06; AY751754
S000549739 not_calculatedPaenibacillus rhizosphaerae CECAP16; AY751755
S000626984 not_calculatedPaenibacillus sp. JA-08; AM162312
S000650960 not_calculatedPaenibacillus sp. 2S3; DQ243814
S000776506 not_calculatedPaenibacillus favisporus MKI10; EF173324
S000776608 not_calculatedPaenibacillus cineris 1Re49; EF178439
S000860597 not_calculatedEnterobacteriaceae bacterium MB6-2; EF581856
S000892366 not_calculatedPaenibacillus sp. K4-01; EF612325
S000967378 not_calculatedPaenibacillus lautus DAN9; EU249586

< 실시예 3> 자일라나아제 유전자 확인

<3-1> 페니바실러스 균주의 유전자 라이브러리제작 및 활성검정

본 발명자들은 상기 <실시예 1>과 <실시예 2>에서 분리 동정한 페니바실러스 sp. HPL-001 균주로 부터 자일라나아제 활성을 가지는 효소 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하기 위하여 게놈 DNA를 추출 후 5 kb 이하 크기의 유전자 조각을 가지는 gDNA 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리의 제작은 균주로부터 추출한 DNA를 무작위 절단방법을 통하여 1~6 kb 크기의 DNA 조각들을 만들고, 아가로스 젤에서 전기영동으로 크기를 선발하여 원하는 5 kb 전후 크기의 DNA 조각을 확보하였다. 이를 pCB31 플라스미드 벡터에 삽입 후 E. coli DH10B 세포에 형질전환 시켰다. 이렇게 제작된 라이브러리 1,536개의 클론을 고상, 액상 조건에서 자일라나아제 활성을 시험하였다.

<3-2> 자일라나아제 활성시험

분리된 균주, 활성클론, 형질전환체 및 분리 정제된 효소 등의 자일라나아제 활성(자일란 분해능력) 측정은 다음과 같은 2가지 방법 중 하나 또는 모두를 사용하였다. 첫 번째 방법은 고체배양 측정방법으로 LB 배지에 버치우드 자일란(Fluka Bio Chemika. Co.)이 0.5~1.0% 함유된 소프트 아가 더블 배지를 만들고 균주를 접종하여 하룻밤 배양한 후 다음날 콩고레드 염색법을 통해 배양된 콜로니 주변에 투명환(plaque)을 형성하는 균주 및 활성클론을 선별하였다. 두 번째 방법인 액체배양 효소활성은 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid) 정량법(Miller G.L. Anal Chem 31, 426-428, 1959)을 사용하였고, 구체적으로는 100 ㎕의 효소용액에 100 ㎕의 기질용액(1% 버치 우드 자일란이 포함된 50 mM 인산나트륨용액, pH 6.0)을 넣고 50℃에서 10분간 반응시킨 후 700 ㎕의 DNS 용액을 첨가한 다음 100℃에 5분간 처리한 후 흡광도 540 nm에서 측정하였다. 효소의 1유니트(unit)는 1분 동안에 1 μ㏖의 환원당(자일로스)을 생산하는 효소활성으로 규정하였다.

<3-3> 자일라나아제 활성클론 선발 및 유전자 분석

액체배양 및 고체배양 활성시험을 통하여 상위 10개 클론(2H6, 5D2, 6H7, 7F1, 8F4, 8G9, 11A6, 11G9, 15G6 및 15G7)을 선발하였다(도 2). 이중 활성도가 제일 높았던 2H6 클론에 삽입된 절편 DNA의 염기서열을 분석하였다. 염기서열을 분석한 결과 2H6 클론의 플라스미드에 삽입된 DNA 절편의 크기는 5,487 bp이었고, 이를 엔씨비아이(NCBI)의 해독프로그램(http://www.ncbi.nlm.gov/)을 통해 암호화 되어 있는 전사 해독틀(ORF, Open Reading Frame)을 분석하였다. 분석된 ORF 중 아미노산 400개 이상의 크기를 갖는 ORF 7개를 ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, ORF7이라 이름 붙였다(도 3). 동시에 이들 ORF를 암호화하는 각각의 DNA 염기서열을 바탕으로 BamHI과 HindIII 제한효소 인식부위를 첨가한 프라이머를 제작한 뒤 각각의 단위로 PCR 증폭 후 pSTV28(TaKaRa) 벡터에 삽입하여 재조합 플라스미드를 제작하였다. PCR 증폭 조건은 PCR Premix(GenetBio)를 사용하여 도 3의 상기 ORF 각각에 대응하는 서열번호 4 내지 17로 기재되는 프라이머 쌍 10 pmol, 2H6 플라스미드 주형 1 ng을 혼합한 뒤 94℃에서 5분간의 변성(Denaturation)을 수행한 후 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 결합(Annealing), 72℃에서 1분의 연장(Extension)을 30회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 7분간 연장으로 마무리하고 4℃에서 유지한 뒤 반응을 종결하였다. PCR을 통해 증폭된 산물을 GENCLEAN II Kit(Q-Biogene)을 사용하여 정제하였고 제한효소 BamHI(NEB)과 HindIII(NEB)로 잘려진 pSTV28 벡터(TaKaRa)에 T4 ligase(RBC)를 사용하여 재조합 DNA를 만들었다. 이 재조합된 플라스미드를 E.coli EPI-100에 형질전환 시켜 유전자 형질전환 대장균을 제작하였다. 이 형질전환체들을 LB액체 배지에서 배양 후 HiYield^TM Plasmid Mini Kit(RBC)을 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하여 제한효소 BamHI(NEB)와 HindIII(NEB)로 절단하고, 목적하는 DNA절편이 삽입되어져 있음을 확인함으로서 재조합이 성공되었음을 알 수 있었다(도 3). 이 각각의 ORF를 암호화하고 있는 DNA 재조합 형질전환 대장균체를 자일라나아제 활성검정에 이용하였다. 각각의 균체를 <실시예 3-2>에서와 같이 고상, 액상의 조건에서 자일라나아제 활성을 시험한 결과 ORF7이라 이름붙인 DNA 절편이 재조합된 플라스미드 DNA가 형질 전환된 E. coli가 활성을 보임을 확인하였다(도 4). ORF7의 DNA 염기 서열은 도 5와 같고, KRICT PX1이라 재 명명하였다. KRICT PX1은 996 bp(서열번호 2)의 염기로 이루어진 DNA로써 332개의 아미노산 잔기로 구성되어 있음을 확인하였고 보고된 유전자와의 유사성(Blast N), 유전자 염기서열을 이용한 보고된 아미노산과의 유사성(Blast X), 얻은 유전자의 염기서열을 이용해 번역된 단백질의 아미노산 서열을 이용한 보고된 아미노산 서열과의 유사성(Blast P)을 Blast program을 통하여 Genbank에 등록된 자료들을 대상으로 분석하였다. 분석결과 GenBank에 등록된 데이터 베이스에서는 유사성이 있는 DNA 염기서열이 검색되지 않았고, 번역된 331개의 아미노산 서열(서열번호 3)을 이용한 유사성 분석에서는 비배양박테리아(Unclutured Bacterium)의 인트라셀룰라 자일라나아제(gb:AAP51133-1)와 70%, 페니바실러스 종(Paenibacillus sp.)의 엔도- 1,4-베타 자일라나아제(gb:EDS52673-1)와 68%, 지오바실러스 스리아로더미플러스(Geobacillus srearothermiphlus)의 인트라셀룰라 자일라나아제(gb: ABI49937-2)와 67%의 상동성을 가지는 것으로 나타났다(도 5). 이로서 KRICT PX1은 자일라나아제 효소를 암호화 하고 있는 신규 자일라나아제 유전자로 판명되었다.

<3-4> 자일라나아제 과발현체 제작( pIVEX - GST - PX1 )

KRICT PX1 유전자의 단백질 과발현체를 제작하기 위하여 클로닝한 KRICT PX1 DNA의 염기서열을 바탕으로 시작코돈과 종결코돈을 포함하는 996bp 서열의 양 말단에 번역틀을 맞추어 PacI과 BamHI 제한효소 인식부위를 도입한 두 개의 올리고뉴클레오티드(5'-TTA ATT AAG ATG AGG TTG CGC GAA G-3': 서열번호 18, 5'-GGA TCC ATG AGG TTG CGC G-3': 서열번호 18)를 설계하여 제작하였고, 이들 올리고뉴클레오티드를 양방향 프라이머로 하고 2H7 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응액과 반응조건은 앞에서와 동일하였다. 증폭된 산물을 정제하여 프라이머를 도입시켜준 제한효소 인식부위를 이용하여 제한효소 PacI(NEB)과 BamHI(NEB)으로 절단한 뒤, 단백질 과발현벡터 pIVEX-GST(Roche)의 PacI과 BamHI 인식부위 사이에 삽입시켜 재조합 과발현 plasmid를 제작하여 E.coli BL21(RBC)에 형질전환 시킴으로서 자일라나아제 과발현 형질전환 대장균을 제작하였다. 제작된 과발현 형질전환 대장균을 배양하여 플라스미드 DNA 추출 후 넣어준 제한효소 인식 부위를 이용하여 절단한 뒤 전기영동을 통해 벡터와 목적 DNA가 성공적으로 재조합 되었는지 확인하였고, 확인된 균체를 LB 액체 배지에서(100 ampicillin/㎖ 첨가) 18시간 배양시킨(37℃, 250 rpm, A₆₀₀=1.0)후 새로운 LB 액체 배지에 재접종하여 A₆₀₀ 흡광도 값이 0.4~0.6일 때 1 mM의 IPTG를 처리하고 3시간 더 배양 후 균체를 수확하였다. 수확된 균체를 현탁 시켜 초음파 분쇄 후 10,000 g에서 원심분리하여 상징액과 침전물로 분리하고 SDS PAGE를 통하여 목적한 단백질이 상징액에 과발현 됨과 분자량이 약 36 kD임을 확인하였다(도 8).

<3-5> 자일라나아제 활성발현 조건 분석

실시예 <3-3>에서 제작한 KRICT PX1 유전자 형질전환 대장균으로부터 생산된 자일라나아제의 활성을 pH와 온도 및 금속이온별로 조사하였다. 반응용액의 pH 조절은 시트릭산(Citric acid) 완충용액으로 pH 4~6, 인산(Phosphate) 완충용액으로 pH 7, 트리스/염산(Tris/HCl) 완충용액으로 pH 8~9, 탄산나트륨(Sodium carbonate) 완충용액으로 pH 10 등 이었다. 기타 방법은 실시예 <3-2>의 액체배양 효소활성 측정방법과 동일하게 하였다. 금속이온으로는 1 mM의 CaCl₂, MgCl₂, MnCl₂, CuCl₂, ZnCl₂, FeCl₃ 등 이었고, 기타 NaCl, LiCl, KCl, NH₄Cl, EDTA, CsCl₂, 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol, PMSF(Penylmethylsulfonyl fluoride) 등을 첨가하여 자일라나아제 활성발현에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, KRICT PX1 유전자 형질전환 대장균으로부터 생산된 자일라나아제는 pH 6.0~7.0에서, 45℃ 내지 50℃에서 최대 활성을 나타냄을 확인하였다(도 9 내지 도 10 참조). 자일라나아제 활성을 저해하는 중금속으로서는 1 mM의 Cu⁺², Zn⁺², Fe⁺³등에 의해서 85, 77, 94% 저해되었지만 100 μM 이하에서는 영향을 받지 않거나 효소활성을 다소 증가시키는 것으로 나타났다(표 2).

< 실시예 4> KRICT PX1 형질전환 대장균으로부터 자일라나아제 생산

신규한 자일라나아제 유전자로 분리된 KRICT PX1 유전자를 포함하는 pIVEX GST-xylanase 재조합 벡터(Bioprogen Co., Ltd., Korea)를 대장균 BL21-Gold(DE)(Stratagene, USA)에 형질 전환시킨 후 액체배지(Luria broth 25g/L)에 접종 한 후, O.D.₆₀₀ 값이 0.7이 될 때까지 37℃에서 150 rpm으로 교반 배양하였다. 목표 단백질의 대장균 세포내 발현을 유도하기 위하여, 상기 현탁액에 IPTG(isopropyl-D-thiogalactoside)를 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가한 후에 2시간 더 배양하였다. 배양액을 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 하여 회수한 침전물을 포스페이트버퍼살린(Phosphate buffered saline, PBS)으로 3회 세척하였다. 세척된 침전물을 다시 용해용 완충용액(Lysis buffer; 200 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 10 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA, pH 7.0)에 재 현탁 후 초음파 파쇄기(Cosmo Bio Co., LTD)를 이용하여 균체를 파쇄 하였다. 파쇄 용액은 컬럼크로마토그래피(BIOLOGIC LP system, BIO RAD)를 사용하여 분획하였다. 이때 자일라나아제만의 선택적 분리 및 정제는 50 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl ; pH 7.0으로 평형화된 글루타치온 에스퍼-트렌스퍼레이즈 컬럼(GST binding resin column, Novagen)을 사용하여 글루타치온 에스퍼-트렌스퍼레이즈 결합단백질(Glutathione S-transferase binding protein)에 부착된 자일라나아제 만을 완충용액(Elution buffer solution, 50 mM Tris-HCl, 20 mM Glutathione, 15 mM NaCl; pH 7.0)으로 선택적 분리 및 정제를 하였다. 효소 활성 분획의 정제여부를 SDS-PAGE로 확인하였고 정제 단계에서 회수한 각각의 시료로부터 자일라나아제 효소 활성을 측정하였다. 단백질 함량은 브래드포드 방법(Bradford, Sigma Aldrich)을 이용하여 측정하였고, 표준 단백질로는 BSA(bovine serum albumin)를 사용하였다.

그 결과 pIVEX-GST-PX1 재조합 플라스미드(plasmid)를 형질전환시킨 대장균 BL21-Gold(DE)(RBC)로부터 다량의 자일라나아제를 생산할 수 있었고, 이들은 모두 글루타치온 레진 컬럼크로마토그래피 법으로 간편하게 분리정제 할 수 있었다. 또한 레진에 결합된 자일라나아제 상태로서도 자일라나아제 활성이 변화되지 않는 특성을 보여주었기 때문에 효소고정화 방법을 통한 고효율 전환공정에 적용할 수 있을 것이다(도 9). 상기 방법에 의해 정제된 효소는 정제하기 전의 효소보다 3배 이상의 활성을 나타내었다. 효소의 특성을 알아보기 위하여 정제된 자일라나아제를 시험관에 넣고 다양한 양의 자작나무 자일란(0.5~1.0 mg)을 포함하는 50 mM Tris-Hcl(pH 7.0) 완충용액 250 μl을 넣는다. 반응 혼합물을 50℃에서 10분간 반응시켜서 효소반응 속도론(Lineweaver-Burk)을 알아보았다. 또한 가수분해 산물을 HPLC 분석을 하였다. 그 결과 자일란 기질에 대한 친화도 K_m 값은 3.16이었고, 가수분해 산물은 대부분이 자일로스이었다(도 10 내지 도 11).

도 1은 선발균주의 전자현미경 사진 및 자일란 분해능력 평가 사진이다.

도 2는 1,536개 gDNA 라이브러리로부터 활성클론 선별 결과이다.

도 3은 ORF분석 그림, 각 ORF 클로닝 프라이머 및 결과 분석 사진이다.

도 4는 ORF별 고체 및 액체 배양 활성 테스트 결과이다.

도 5는 ORF7의 염기 및 아미노산 서열을 나타낸 결과이다.

도 6은 자일라나아제 활성발현 최적 pH 그래프이다.

도 7은 자일라나아제 활성발현 최적 온도 그래프이다.

도 8은 KRICT PX-1 형질전환체 제작을 나타낸 그림이다.

도 9는 효소의 분리정제 후 전기영동 및 효소활성도이다.

도 10은 대량생산 자일라나아제 효소특성분석 그래프이다.

도 11은 반응생성물 분석 그래프이다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> A paenibacillus sp. HPL-001 strain for producing xylanase and a xylanase produced thereby <130> 8p-07-16 <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1404 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 1 tagagtttga tcatggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgag 60 cggacttgat ggagagcttg ctctcctgat ggttagcggc ggacgggtga gtaacacgta 120 ggcaacctgc ctgcaagacc gggataaccc acggaaacgt gagctaatac cggatatctc 180 atttcctctc ctgagggaat gatgaaagac ggagcaatct gtcacttgcg gatgggcctg 240 cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct 300 gagagggtga acggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 360 gtagggaatc ttccgcaatg ggcgaaagcc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag 420 gttttcggat cgtaaagctc tgttgccagg gaagaacgtc cggtagagta actgctatcg 480 gagtgacggt acgtgagaag aaagccccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 540 gtagggggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggtcatttaa 600 gtctggtgtt taaggccaag gctcaacctt ggttcgcact ggaaactggg tgacttgagt 660 gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagatat gtggaggaat 720 cnccagtggc gaaggcgact ctctgggctg taactgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg 780 agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgc taggtgttag 840 gggtttcgat acccttggtg ccgaagttaa cacattaagc attccgcctg gggagtacgg 900 tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg gggacccgca caagcagtgg agtatgtggt 960 ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atccctctga ccggtctaga 1020 gatagacctt tccttcggga cagaggagac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt 1080 cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgattttagt tgccagcact 1140 tcgggtgggc actctagaat gactgccggt gacaaaccgg aggaaggcgg ggatgacgtc 1200 aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtact acaatggcca gtacaacggg 1260 aagcgaagcc gcgaggtgga gccaatccta tcaaagctgg tctcagttcg gattgcaggc 1320 tgcaactcgc ctgcatgaag tcggaattgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga 1380 atacgttccc gggtcttgta caca 1404 <210> 2 <211> 996 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 2 atgaggttgc gcgaagcgtt taaagaacag tttttgatcg gggccgccgt caatccggtg 60 acgttggact cgcagcgtga tttgcttatt gagcatttca acagcgtgac tgccgaaaat 120 gaaatgaaat tcgaaagatt gcatcccacg gaggaccggt atacgtttga ggcggcagac 180 cgtatggtgg ccctggctaa agccaacggt atgggagtaa ggggccatac gctggtgtgg 240 cacaatcaga cgccgacatg ggtgtttgaa aatgaagacg gcagccaaac ggatcgggtg 300 acgctgctgg cccgcatgaa atctcatatc aacacggtcg tatcccgtta ccagggagaa 360 ctctatgctt gggacgtggt gaacgaagcg gtatccgaca gcggcagcga actgctgcgg 420 ccttcgaagt ggctcgatat tatcggcgag gatttcatcg ccaaggcgtt tgagtacgcc 480 catgaagccg atccggaggc gctgctgttc tacaacgatt acaacgaggc cgatccggtg 540 aaaagcgaga aaatctacac gctcgtcaaa tcgctgctcg agcagggggt gccgatccat 600 ggcatcgggc ttcaggcgca ctggagcctg tatcacccgt cgctggataa tatccgcgtg 660 gcgatcgaga aatacgccag tttgggcgtg aaactgcata ttacggagct ggacgtttcg 720 atgtttgcgt tcgatgaccg gcggaccgac ctcacggctc cgacggaaga gatgctggct 780 cttcaagcgg aacgttacgg tcaatttttc cggctgttcc aggaatacag cgaatatatc 840 acttccgtca ctttttgggg cgctgccgat gattatactt ggctggacca tttccctgta 900 cggggccgaa aaaattggcc attcttattt gatgcgaagc atcagcccaa accgtcttat 960 tcggaagtgc tgaagacagt gggcttgact ctttag 996 <210> 3 <211> 331 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. <400> 3 Met Arg Leu Arg Glu Ala Phe Lys Glu Gln Phe Leu Ile Gly Ala Ala 1 5 10 15 Val Asn Pro Val Thr Leu Asp Ser Gln Arg Asp Leu Leu Ile Glu His 20 25 30 Phe Asn Ser Val Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Phe Glu Arg Leu His 35 40 45 Pro Thr Glu Asp Arg Tyr Thr Phe Glu Ala Ala Asp Arg Met Val Ala 50 55 60 Leu Ala Lys Ala Asn Gly Met Gly Val Arg Gly His Thr Leu Val Trp 65 70 75 80 His Asn Gln Thr Pro Thr Trp Val Phe Glu Asn Glu Asp Gly Ser Gln 85 90 95 Thr Asp Arg Val Thr Leu Leu Ala Arg Met Lys Ser His Ile Asn Thr 100 105 110 Val Val Ser Arg Tyr Gln Gly Glu Leu Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn 115 120 125 Glu Ala Val Ser Asp Ser Gly Ser Glu Leu Leu Arg Pro Ser Lys Trp 130 135 140 Leu Asp Ile Ile Gly Glu Asp Phe Ile Ala Lys Ala Phe Glu Tyr Ala 145 150 155 160 His Glu Ala Asp Pro Glu Ala Leu Leu Phe Tyr Asn Asp Tyr Asn Glu 165 170 175 Ala Asp Pro Val Lys Ser Glu Lys Ile Tyr Thr Leu Val Lys Ser Leu 180 185 190 Leu Glu Gln Gly Val Pro Ile His Gly Ile Gly Leu Gln Ala His Trp 195 200 205 Ser Leu Tyr His Pro Ser Leu Asp Asn Ile Arg Val Ala Ile Glu Lys 210 215 220 Tyr Ala Ser Leu Gly Val Lys Leu His Ile Thr Glu Leu Asp Val Ser 225 230 235 240 Met Phe Ala Phe Asp Asp Arg Arg Thr Asp Leu Thr Ala Pro Thr Glu 245 250 255 Glu Met Leu Ala Leu Gln Ala Glu Arg Tyr Gly Gln Phe Phe Arg Leu 260 265 270 Phe Gln Glu Tyr Ser Glu Tyr Ile Thr Ser Val Thr Phe Trp Gly Ala 275 280 285 Ala Asp Asp Tyr Thr Trp Leu Asp His Phe Pro Val Arg Gly Arg Lys 290 295 300 Asn Trp Pro Phe Leu Phe Asp Ala Lys His Gln Pro Lys Pro Ser Tyr 305 310 315 320 Ser Glu Val Leu Lys Thr Val Gly Leu Thr Leu 325 330 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 4 agggatcccg atgcgtgcac t 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 5 ccaagcttgc taacggagca tc 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 6 agggatcccg atgaactgga ac 22 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 7 ccaagcttgt cacgtacgaa tgac 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 8 agggatcccg atggataaag aaag 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 9 ccaagcttgt cacatgtgta cgac 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 10 agggatcccg atgaatgaat acag 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 11 ccaagcttgt taaggcgata ccgt 24 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 12 agggatcccg atgtatccaa atc 23 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 13 ccaagcttgt tacttcagca gcac 24 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 14 agggatccca tggtccagc 19 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 15 ccaagcttgg cttacacttt gg 26 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 16 agggatccca tgaggttgcg 20 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 17 ccaagcttgg cctaaagagt caag 24 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of PacI and BamHI <400> 18 ttaattaaga tgaggttgcg cgaag 25 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of PacI and BamHI <400> 19 ggatccatga ggttgcgcg 19

Claims

기탁번호 KCTC11365BP로 기탁된, 자일라나아제를 생산하는 신규 페니바실러스 sp. HPL-001 균주.
제1항의 균주로부터 생산되는, 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 자일라나아제.
삭제
제 2항에 있어서, 상기 자일라나아제는 45℃ 내지 50℃에서 최대 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 자일라나아제.
제 2항에 있어서, 상기 자일라나아제는 pH 6.0 ~ 7.0에서 최대 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 자일라나아제.
제 2항의 자일라나아제를 암호화하는, 서열번호 2에 기재된 염기 서열을 가지는 유전자.
삭제
제 6항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제 8항의 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체.
제 9항에 있어서, 숙주세포는 대장균을 포함한 원핵세포, 효모, 동물세포, 곤충세포를 포함하는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
1) 배지에 제 1항의 페니바실러스 sp. HPL-001 균주(KCTC11365BP) 또는 제 9항의 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 조효소액을 수득하는 단계;

2) 단계 1)에서 수득된 조효소액에서 자일라나아제를 정제하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법.
제 1항의 균주, 제 2항의 자일라나아제 또는 제 9항의 형질전환체를 포함하는 자일란 분해제.
섬유소계 바이오매스에 제 1항의 균주, 제 2항의 자일라나아제 또는 제 9항의 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법.
동물의 사료 재료에 제 1항의 균주, 제 2항의 자일라나아제 또는 제 9항의 형질전환체를 첨가하는 단계 및 자일란 분해제를 포함하는 사료 제조 방법.
제 2항의 자일라나아제를 포함하는 식품 가공용 조성물.
제 2항의 자일라나아제를 포함하는 사료첨가제.
제 2항의 자일라나아제를 포함하는 제지공정용 조성물.
제 2항의 자일라나아제를 자일란 함유액에 처리하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법.
제 18항에 있어서, 재생 가능 연료 또는 화학 원료의 생산 공정에 이용되는 것을 특징으로 하는 자일란 분해 방법.