KR101454889B1 - 신규한 자일로시다아제 ｋｒｉｃｔ ｐｘ ｄ4 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열목록 제2서열에 기재된 아미노산 서열을 가지는 자일로시다아제(xylosidase)를 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 자일로시다아제는 내열성 및 내알칼리성를 갖는다. 기존의 화학적 방법을 대체함으로써 폐기물 및 고가의 정제비용을 절감할 수 있으며, 우수한 자일란 분해활성을 나타내므로 사료 산업, 제지 및 세제 산업에서는 물론 섬유질계 바이오매스의 당화공정에 활용되어 석유 대체원료, 특수기능물질, 바이오 폴리머 등의 원료를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 자일로시다아제 ＫＲＩＣＴ ＰＸ Ｄ4{Novel Enzyme β-D-xylosidases KRICT PXD4 Having Xylolytic Activity}

본 발명은 자일로시다아제 활성을 가진 신규 효소 PXD4-02에 관한 것이다.

21세기를 살아가는 인류는 화석연료 대체자원 개발이라는 커다란 숙제를 해결하기 위하여 8개 분야의 재생에너지(태양열, 태양광발전, 바이오매스, 풍력, 소수력, 지열, 해양에너지 및 폐기물에너지)와 3개 분야의 신에너지(연료전지, 석탄액화가스화 및 수소에너지)로 지정하였다. 이들 중에서 바이오매스만이 유일한 탄소자원이기 때문에 바이오매스 원료를 이용하여 바이오연료와 화학원료를 생산하는 바이오리파이너리 공정을 개발하여야 한다.

자연계에 존재하는 자일란은 바이오매스 건조 중량의 10-30%를 차지하는 매우 중요한 탄소원임에도 불구하고 현재까지 직접적인 이용이 불가능하였기 때문에 대부분이 폐자원으로 처리되는 실정이다. 자일란의 가수분해는 현재까지 화학적 방법으로 주로 이루어지고 있다. 화학적 방법에 의한 자일란의 분해방법은 섬유소계 바이오매스에 황산을 첨가하고 130^oC에서 스팀으로 가압하여 분해하므로 많은 양의 에너지를 소모할 뿐만 아니라, 산 및 고온에 견딜 수 있는 고가의 생산장비가 필요하다. 또한 이때 발생하는 과반응 산물과 폐기물은 환경오염을 유발하거나 분리, 정제비용 등으로 인하여 생산단가가 높아지게 된다. 이에 반하여 엔도자일라나아제와 자일로시다아제는 자일란을 분해하는 효소시스템으로써 엔도자일라나아제는 자일란의 내부 골격을 끊어 자일로올리고당을 만들며 자이로시다아제는 자일로올리고당의 말단을 공격하여 자일로스를 생산한다. 이와 같은 생물학적 방법에 의한 자일란의 분해방법은 화학적 분해방법과 비교할 때 에너지의 소모가 적고 발생하는 폐기물 역시 화학적 방법과 비교할 때 소량일 뿐만 아니라 그 처리가 용이하기 때문에 경제적으로도 매우 유리하다. 그러나 이러한 자일라나아제 효소시스템의 문제점은 엔도자일라나아제와 자일로시다아제의 효소 역가가 낮아 반응속도 및 분해율이 낮고, 기존에 알려진 효소들의 특성이 산업적으로 이용하기에 적합한 내열성, 내알카리성을 충분히 가지지 못하고 있고, 또한 우리나라의 경우에는 이들 효소를 전적으로 수입에 의존하고 있다는 점이다. 따라서 자일라나아제 시스템의 이용을 위해서는 이러한 문제점들의 해결이 필요하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 자연계에 존재하는 바이오매스 건조 중량의 30%를 차지하는 자일란(xylan)을 산업적으로 이용하기 위해 자일란의 분해방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 기존의 많은 에너지를 소모하는 화학적 방법을 대체할 수 있는 내열성 및 내알칼리성의 신규한 자일로시다아제(xylosidase)를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 자일로시다아제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 자일로시다아제를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 형질전환된 세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 탄수화물 분해 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 식품 내 자일란 가공용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 사료 첨가제용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 제지공정용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열에 기재된 아미노산 서열을 가지는 자일로시다아제(xylosidase)를 제공한다.

본 발명자들은 자연계에 존재하는 바이오매스 건조 중량의 30%를 차지하는 자일란(xylan)을 산업적으로 이용하기 위해 자일란의 분해방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 기존의 많은 에너지를 소모하는 화학적 방법을 대체할 수 있는 내열성 및 내알칼리성의 신규한 자일로시다아제(xylosidase)를 개발하였다.

본 발명의 자일로시다아제는 상기한 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 아미노산 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 자일로시다아제는 40-60℃에서 효소활성을 나타내고, 보다 바람직하게는 45-55℃이며, 보다 더 바람직하게는 48-52℃이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 자일로시다아제는 pH 4-11에서 효소활성을 나타내고, 보다 바람직하게는 pH 5-9이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 자일로시다아제는 1-2의 미카엘리스-멘텐 상수(MichaelisMenten constant, Km) 값을 갖는다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열에 기재된 아미노산 서열을 가지는 자일로시다아제를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 자일로시다아제 자체에 변화를 가져올 수도 있다. 자일로시다아제의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 자일로시다아제와 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.

본 발명의 자일로시다아제에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 자일로시다아제와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 자일로시다아제 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 예컨대 최소 99%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NCBI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

바람직하게는, 핵산 분자는 서열목록 제1서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산 분자이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, T7 프로모터, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터 및 trp 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann . Rev . Genet ., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pIVEX, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac. Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 자일로시다아제를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용한 숙주 세포는 E. coli (BL21) 유래의 E. coli (BL21)-Gold이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면. 본 발명의 자일로시다아제 또는 형질전환된 세포를 자일로오즈(xylose)-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드에 접촉시키는 단계를 포함하는 탄수화물 분해 방법을 제공한다.

본 명세서에서, 상기 ‘자일로오즈(xylose)-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드’은 당업계에 공지된 다양한 자일로오스-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 자일로오스를 포함하는 다양한 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드는 자일란, 아라비노자일란(arabinoxylan), 헤미셀룰로오스(hemicellulose) 및 자일로피라노사이드(xylopyranoside)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 단계는 금속이온 또는 산화환원제를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 Na+, K+, Li+, Ca⁺², Mg⁺² 또는 DTT(Dithiothreitol)를 추가적으로 포함하는 경우, 상기 자일로시다아제의 활성이 110-120% 증가한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 자일로시다아제 또는 형질전환된 세포를 포함하는 식품 내 자일란 가공용 조성물을 포함한다.

바람직하게는, 식품 재료의 연화 및 정제 효율개선, 점도감소 추출 및 여과 효율증대를 통한 품질향상에 활용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 자일로시다아제 또는 형질전환된 세포를 포함하는 사료 첨가제용 조성물을 포함한다.

바람직하게는, 가축의 사료 비전분 탄수화물의 감소, 장내 점도개선, 단백질 및 전분의 소화흡수율 증대를 위해 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 자일로시다아제 또는 형질전환된 세포를 포함하는 제지공정용 조성물을 포함한다.

바람직하게는, 제지공정의 생물학적 백화공정, 공정의 단축, 탈묵효과, 전분과 글루텐의 분리 및 화학연료생산에 사용할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 내열성 및 내알칼리성의 신규한 자일로시다아제를 제공한다.

(b) 본 발명의 자일로시다아제는 기존의 화학적 방법을 대체함으로써 폐기물 및 고가의 정제비용을 절감할 수 있다.

(c) 본 발명은 우수한 자일란 분해활성을 나타내므로 사료 산업, 제지 및 세제 산업에서는 물론 섬유질계 바이오매스의 당화공정에 활용되어 석유 대체원료, 특수기능물질, 바이오 폴리머 등의 원료를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 페니바실러스(Paenibacillus) 속 HPL-3의 전자현미경 사진으로 1.1 ㎛의 세포 크기와 2.5 내지 4.0 ㎛의 세포길이를 갖는 막대형(rod)의 그람양성 간균을 나타낸다.
도 2는 1,248개 gDNA 라이브러리로부터 활성클론 선별 결과를 나타낸다.
도 3은 ORF 분석 및 각 ORF 아미조산의 상동성 결과를 나타낸다.
도 4는 형질전환체로부터 자일로시다아제를 분리 정제 후 활성을 나타낸다.
도 5는 pH에 따른 자일로시다아제 활성을 나타낸다.
도 6은 온도에 따른 자일로시다아제 활성을 나타낸다.
도 7은 자일로시다아제 분리정제 후 효소반응속도(kinetics)를 나타내는 그래프이다.
도 8은 자일로시다아제 분리정제 후 효소반응속도(kinetics)를 나타낸다.
도 9는 GEM-T-Easy 벡터(Promega)에 삽입하여 제작한 재조합 플라스미드를 맵으로 도식화 한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 균주 분리 및 선별

균주 분리

본 발명의 균주는 경남 거제시 남부면 다대리에 위치한 가라산 중턱에서 채취한 버섯재배 후 폐목재잔여물이 포함된 토양으로부터 분리하였다. 상기 토양의 표층으로부터 2-5 ㎝ 층에서 토양시료를 채취, 풍건 후 2 ㎜ 채를 통과시켜 토양을 정선하였다. 정선된 토양 30 g을 270 ㎖의 멸균된 생리식염수(NaCl 8.0 g/ℓ)에 넣어서 진탕배양기(37℃, 200 rpm)로 약 20분 동안 진탕한 후 상온에 30분 정도 방치하여 굵은 토양입자 및 불순물 등을 바닥으로 침전시킨 후 상청액을 멸균된 용기로 옮겨 1차 희석액으로 하였다. 이것을 잘 교반한 후 10 ㎖을 취하여 90 ㎖의 생리식염수에 넣어 2차 희석액 100 ㎖을 제조하고, 2차 희석액을 충분히 교반하면서 위와 같은 방법으로 10 ㎖을 취하여 90 ㎖의 생리식염수에 넣어 3차 희석액 100 ㎖을 제조하였다. 이후 동일한 방법으로 6차 희석액까지 제조하였다. 균주 분리용 TSA(Tryptic Soy Agar, Difco Co.) 배지에 3, 4, 5 및 6차 희석액을 0.25 ㎖씩 3회 반복으로 분주한 후, 균일하게 도말하여 37℃ 평상인큐베이터에서 2일 동안 배양한 후 형성된 미생물의 콜로니를 선발하였다. 이때 콜로니의 모양, 크기, 색상 등 여러 가지 요인을 고려하여 분리하며, 분리된 콜로니는 다시 TSA[Tryptic (Trypticase) Soy Agar] 배지에서 계대 배양하여 순수한 균주를 분리하였고 이것을 모 균주로 사용하기 위하여 -70℃에 보관하였다.

균주 선별

순수하게 분리된 균주들 중에서 자일로시다아제 활성을 가지는 활성 균주 선별은 TSA 배지에 자작나무 자일란(Fluka Bio Chemika. Co.)이 0.5-1.0% 함유된 소프트 아가 더블 배지를 만들고 균주를 접종하여 하룻밤 배양한 후 다음날 Congo-red 염색법(Theater RM, PJ. Wood. Appl Environ Microbiol 43, 777-780, 1982; Beguin P. Analytical Biochemistry, 131(2):333-336, 1983)을 통해 배양된 콜로니 주변에 투명환(Halo)을 형성하는 균주 및 활성클론을 선별하였다. 선별된 균주의 자일란 분해능을 다시 한 번 측정하여 재현성을 확인하였고, 그 중 자일란 분해 능력이 가장 우수한 균주를 선발하여 자일로시다아제를 생산하는 미생물로 최종 선발하였다.

실시예 2: 균주 동정

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리한 가장 높은 활성을 지닌 자일로시다아제를 생산하는 균주를 30℃에서 배양한 후 그람 염색(Gram Staining) 및 포자 염색(Spore Staining)을 실시한 결과, 포자를 생성하는 그람양성 간균으로 확인되었다. 전자현미경으로 그 형태를 관찰한 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이 1.1 ㎛의 세포크기와 2.5 ㎛ 내지 4 ㎛의 세포길이를 갖는 막대형(rod)이었으며 편모를 가지지 않는 운동성이 없는 간균으로 나타났다. 또한, 균주의 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 서열목록 제1서열로 기재되는 1,234 bp의 rDNA를 얻은 후 유전자은행 정보자료(GenBank database)를 검색한 결과, 판토애 아글로메란스 ZFJ-15(Pantoea agglomerans ZFJ-15; GenBank 등록번호 EU931554) 균주와 96.4%의 상동성이 있고 페니바실러스 속 WPCB158(Paenibacillus sp. WPCB158; GenBank 등록번호 FJ006910)과 96.3%가 일치함을 확인하였으나 그 이상 일치하는 상동성은 검색되지 않았기 때문에, 본 균주를 페니바실러스 속 HPL-3 균주로 명명하였고, 한국생명공학연구원의 생명자원센터에 2011년 7월 20일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC11987BP이다.

실시예 3: 신규 자일로시다아제 분리

페니바실러스 균주의 유전자 라이브러리제작 및 활성검정

본 발명자들은 상기 실시예 1 및 실시예 2에서 분리 동정한 페니바실러스 속 HPL-3 균주로부터 자일로시다아제 활성을 가지는 효소 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하기 위하여 게놈 DNA를 추출 후 5 kb 이하 크기의 유전자 조각을 가지는 gDNA 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리의 제작은 균주로부터 추출한 DNA를 무작위 절단방법을 통하여 1-6 kb 크기의 DNA 조각들을 만들고, 아가로스 젤에서 전기영동으로 크기를 선발하여 원하는 5 kb 전후 크기의 DNA 조각을 확보하였다. 이를 pCB31 플라스미드 벡터에 삽입 후 E. coli DH10B 세포에 형질전환을 실시하였다. 이렇게 제작된 라이브러리 1,248개의 클론을 고상 또는 액상 조건에서 자일로시다아제 활성을 시험하였다.

자일로시다아제 활성시험

분리된 균주, 활성클론, 형질전환체 및 분리 정제된 효소 등의 자일로시다아제 활성(자일란 분해능력) 측정은 다음과 같은 2가지 방법 중 하나 또는 모두를 사용하였다. 첫 번째 방법은 고체배양 측정방법으로 LB 배지에 자작나무 자일란(Fluka Bio Chemika. Co.)이 0.5-1.0% 함유된 소프트 아가 더블 배지를 만들고 균주를 접종하여 하룻밤 배양한 후 다음날 콩고레드 염색법을 통해 배양된 콜로니 주변에 투명환(halo)을 형성하는 균주 및 활성클론을 선별하였다. 두 번째 방법은 액체배양 효소활성 측정방법으로 자일로시다아제 분석법를 사용하였고, 구체적으로는 100 mM p-니트로페닐 β-D-자일로피라노사이드(p-Nitrophenyl β-D-Xylopyranoside) 10 ㎕과 100 mM 인산칼륨 버퍼(pH 7.0) 90 ㎕의 용액에 GM3 라이브러리를 37℃, 이틀 동안 배양한 후 초음파분해한 효소용액을 100 ㎕ 혼합하였다. 50℃에서 15분 동안 유지해준 후 흡광도(400 ㎚)를 측정하였다. 효소의 1 유니트(unit)는 1분 동안에 1 g의 자일라나아제가 1 m㏖의 환원당(자일로스)을 생산하는 효소활성으로 규정하였다. 액체배양 및 고체배양 활성시험을 통하여 상위 1개 클론 GM3-PXD4를 선발하였다(도 2).

자일로시다아제 활성클론 선발 및 유전자 분석

실시예 3에서 선발된 클론에 삽입된 절편 DNA의 염기서열을 분석하였다. 염기서열을 분석한 결과 플라스미드에 삽입된DNA 절편의 크기는 3,666 bp(서열목록 제2서열)이었고, 이를 NCBI의 Blast P 또는 Blast N 프로그램(//www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 통해 암호화되어 있는 전사 해독틀(ORF, Open Reading Frame)을 분석하였다. 분석된 ORF 중 아미노산 100개 이상의 크기를 갖는 ORF 7개를 PXD4-O1, PXD4-O2, PXD4-O3, PXD4-O4, PXD4-O5, PXD4-O6, PXD4-O7이라 명명하였다. 상기 ORF 중 유전자가 암호화하는 단백질의 상동성 검색결과 O-글리코실 하이드로라아제[O-Glycosyl hydrolase (YP_003869013.1)]와 93% 상동성을 가지는 ORF2(서열목록 제3서열)를 표적으로 하여 그 염기서열을 바탕으로 NdeI과 BamHI 제한효소 인식부위를 첨가한 프라이머를 제작한 뒤 PCR 증폭 후 pGEM-T-Easy 벡터(Promega)에 삽입하여 재조합 플라스미드를 제작하였다.

구체적으로, 상기 재조합 플라스미드 주형 1 ng을 서열목록 제5서열(5'- ACATGCCATATGACCATTCAGACCATT -3')로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열목록 제6서열(5'- ACATGCGGATCCCTTAAGAAGGAATGACGAT -3')로 기재되는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍(10 p㏖)과 혼합한 뒤, PCR 증폭 조건은PCR Premix(GenetBio)를 사용하여 94℃에서 5분간의 변성(Denaturation)을 수행한 후 94℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 결합(Annealing) 및 72℃에서 2분 동안 연장(Extension)을 30회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 7분간 연장으로 마무리하고 4℃에서 유지한 뒤 반응을 종결하였다. PCR을 통해 증폭된 산물을 GENCLEAN II Kit(Q-Biogene)을 사용하여 정제하였고, pGEM-T-Easy 벡터에 T4 리가아제(RBC)를 사용하여 재조합 DNA를 제조하였다. 상기 재조합된 플라스미드를 E. coli JM109에 형질전환시켜 유전자 형질전환 대장균을 제작하였다. 상기 형질전환체를 LB 액체 배지에서 배양한 후 HiYield™ 플라스미드 미니 키트(RBC)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하여 제한효소 NdeI(NEB) 및 BamHI(NEB)로 절단하였고, 이를 전기영동하여 목적하는 DNA 절편이 삽입되어 있음을 확인하였다. 또한, 상기 형질전환체를 실시예 3에서와 같이 액상의 조건에서 자일로시다아제 활성을 시험한 결과 자일로시다아제 활성을 보임을 확인하였다.

상기 형질전환체의 목적 DNA 절편의 염기서열을 확인하여 서열목록 제4서열로 기재된 아미노산 서열의 신규 자일로시다아제 유전자의 ORF를 재확인하였다.

자일로시다아제 과발현체 제작( pIVEX - GST - PX3 )

상기 신규 자일로시다아제를 과발현하는 형질전환체를 제작하기 위하여, GM3-SLX1 플라스미드를 주형으로 하여 서열목록 제5서열 및 서열목록 제6서열의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응액과 반응조건은 상기 실시예 3와 동일하였다. 증폭된 산물을 정제하여 NdeI(NEB, 영국) 및 BamHI(NEB 영국)으로 절단한 뒤, 단백질 과발현벡터 pIVEX-GST(Roche, 미국)에 삽입시켜 재조합 과발현 플라스미드를 제작하였고, 이를 E. coli BL21(RBC)에 형질전환하여 자일로시다아제 과발현 형질전환 대장균을 제작하였다. 제작된 과발현 형질전환 대장균을 배양하여 플라스미드 DNA 추출 후 상기 제한효소를 이용하여 절단한 뒤 전기영동을 통해 벡터와 목적 DNA가 성공적으로 재조합되었는지 확인하였고, 확인된 균체를 LB 액체 배지에서(암피실린 100mg/L 첨가) 18시간 배양한(37℃, 250 rpm, A₆₀₀=1.0) 후 새로운 LB 액체 배지에 재접종하여 A₅₉₅ 흡광도 값이 0.4-0.6와 일 때 1 mM의 IPTG를 처리하고 18℃에서 18시간 더 배양 후 균체를 수확하였다. 수확된 균체를 현탁시켜 초음파 분쇄 후 10,000 g에서 원심분리를 실시하여 상청액 및 침전물로 분리하였고, SDS PAGE를 통하여 목적한 단백질이 상청액에 과발현됨과 분자량이 약 49 kD임을 확인하였다(도 4).

자일로시다아제 활성발현 조건 분석

상기 실시예에서 제작한 신규 자일로시다아제 과발현 형질전환 대장균으로부터 과발현 및 분리된 자일로시다아제의 활성을 pH, 온도 및 금속이온별로 실시예 ‘자일로시다아제 활성시험’의 방법으로 조사하였다. 반응용액의 pH 조절은 시트릭산(Citric acid) 완충용액으로 pH 3-7, 인산(Phosphate) 완충용액으로 pH 6-8, 글라이신/수산화나트륨(Glycine/NaOH) 완충용액으로 pH 8-11 조건으로 수행하였다. 금속이온으로는 1 mM의 CaCl₂, MgCl2, MgCl₂, CuCl₂, ZnCl_{2 ,} 또는 FeCl₃를 첨가하여 자일로시다아제 활성에 미치는 영향을 조사하였고, 기타 NaCl, LiCl, KCl, NH₄Cl, EDTA, CsCl₂, 2-ME(2-Mercaptoethanol), DTT(Dithiothreitol), PMSF(Penylmethylsulfonyl fluoride) 또는 SDS 등의 염을 첨가하여 자일로시다아제 활성발현에 미치는 영향을 조사하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 신규 자일로시다아제는 pH 5-9에서, 도 6에서 나타난 바와 같이 50℃에서 최대 활성을 나타내었다. 또한, 표 1에 나타난 바와 같이 1 mM의 Cu⁺², Fe⁺² 등의 중금속 또는 첨가물에 의해서 자일로시다아제 활성이 각각 93%, 85% 저해되었지만 1 mM의 Na⁺, K⁺, DTT 등에 의해서는 126%, 128%, 121% 증가되는 것으로 나타났다.

첨가제	첨가제 농도에 따른 상대적 활성(%)
	1 mM
음성 대조군	100
NaCl	126
LiCl	120
KCl	128
NH4Cl	105
CaCl2	119
MgCl2	114
MnCl2	118
CuSO4	93
ZnSO4	114
FeCl3	85
EDTA	118
2-ME	113
DTT	121
PMSF	106
SDS	98

실시예 4: 신규 자일로시다아제의 대량 생산

서열목록 제4서열로 기재되는 신규 자일로시다아제를 암호화하는 유전자(서열목록 제3서열)를 포함하는 pIVEX GST-자일로시다아제 재조합 벡터(Bioprogen Co., Ltd., 대한민국)를 대장균 BL21-Gold(DE)(Stratagene, 미국)에 형질전환 시킨 후 암피실린이 첨가(50 ㎍/㎖)된 액체배지(LB 25 g/L)에 접종하여 O.D.₅₉₅ 값이 0.4-0.6이 될 때까지 37℃에서 150 rpm으로 교반 배양하였다. 목표 단백질의 대장균 세포내 발현을 유도하기 위하여, 상기 현탁액에 IPTG(isopropyl-D-thiogalactoside)를 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가한 후에 3시간 더 배양하였다. 배양액을 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 실시하여 회수한 침전물을 PBS로 2회 세척하였다. 세척된 침전물을 다시 PBS에 재현탁 후 초음파 파쇄기(Cosmo Bio Co., LTD)를 이용하여 균체를 파쇄한 후, 원심분리(12,000 rpm, 10분)하여 상청액을 회수하였다. 회수한 상청액 속의 자일로시다아제를 순수분리하기 위해 글루타치온에스-트렌스퍼레이즈 컬럼(GST binding resin column, Novagen)을 사용하였다. 이때 자일나아제 순수분리는 준비된 상청액을 완충용액(Washing buffer solution ; 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl; pH 7.0)으로 평형화된 글루타치온에스-트렌스퍼레이즈 컬럼(GST binding resin column, Novagen)에 부착 시킨 후, factor Xa 프로테아제(NEB, 영국)를 처리하고, 완충용액(Washing buffer solution; 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl; pH 7.0)을 이용하여 순수분리하였다. 정제 단계에서 회수한 각각의 시료로부터 자일로시다아제 효소 활성을 측정 하였으며, 효소 활성 분획의 정제여부를 SDS-PAGE로 확인하였다. 단백질 함량은 브래드포드 방법(Bradford, Sigma Aldrich)을 이용하여 측정하였고, 표준 단백질로는 BSA(bovine serum albumin)를 사용하였다.

그 결과, 글루타치온 레진 컬럼 크로마토그래피 법으로 간편하게 다량의 자일로시다아제를 생산할 수 있었다. 또한 레진에 결합된 자일로시다아제 상태로도 자일로시다아제 활성이 변화되지 않는 특성을 보여주었기 때문에 효소고정화 방법을 통한 고효율 전환공정에 적용할 수 있음을 알 수 있다. 효소활성은 50℃에서 pH 4.0, pH 5.0, pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0, pH 9.0 및 pH 10.0에서 각각 36, 271, 290, 264, 288, 278 및 69 유니트(1분당 1 g의 효소가 생산하는 자일로스 mM 량)로 나타나 내열성과 고활성 및 매우 넓은 pH 적용성을 나타내었다.

실시예 5: 대량생산된 신규 자일로시다아제의 내열성

높은 온도에서도 변하지 않고 잘 견디어 내는 성질을 알아보기 위하여 정제된 자일로시다아제를 시험관에 넣고 50℃, 60℃에서 10분 간격으로 각각 10, 20, 30, 40, 50, 60분 유지하였다. 이렇게 준비된 자일로시다아제를 p-니트로페닐 β-D-자일로피라노사이드(p-Nitrophenyl β-D-Xylopyranoside)를 포함하는 50 mM 구연산염 버퍼(pH 6.0)에 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 15분 동안 반응시켜 내열성을 알아보았다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 50℃에서는 40분까지 변하지 않고 잘 견디다가 50분부터 감소하기 시작하여 60분에서는 20%까지 급격히 감소하였고 60℃에서는 시작부터 급격히 감소하여 10분에서 10% 미만으로 감소하였다.

실시예 6: 대량생산된 신규 자일로시다아제의 기질에 따른 특이성

기질에 따른 자일로시다아제의 특이성을 알아보기 위하여 정제된 자일로시다아제를 시험에 넣고 p-니트로페닐-β-D-자일로피라노사이드(p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside), p-니트로페닐-α-D-글루코피라노사이드(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside), p-니트로페닐-β-D-글루코피라노사이드(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside), p-니트로페닐-β-D-만노피라노사이드(p-nitrophenyl-β-D-mannopyranoside), p-니트로페닐-β-D-셀로비오사이드(p-nitrophenyl-β-D-cellobioside), p-니트로페닐-α-L-아라비노피라노사이드(p-nitrophenyl-α-L-arabinopyranoside), p-니트로페닐-β-L-아라비노피라노사이드(p-nitrophenyl-β-L-arabinopyranoside), p-니트로페닐-α-L-아라비노퓨라노사이드(p-nitrophenyl-α-L-arabinofuranoside), p-니트로페닐-β-D-갈라토피라노사이드(p-nitrophenyl-β-D-galatopyranoside) 각각의 기질을 포함하는 50 mM 구연산염 버퍼(pH 6.0)에 첨가하고 반응 혼합물을 50℃에서 15분 동안 반응시켜 각각의 기질에 대한 특이성을 알아보았다.

그 결과, 표 2에서 나타난 바와 같이 p-니트로페닐-β-D-자일로피라노사이드에서는 290.383 U이 측정되었지만 그 외의 기질에서는 어떠한 특이적인 활성도 측정되지 않았다. 그러므로 신규 자일로시다아제는 p-니트로페닐-β-D-자일로피라노사이드에 대한 매우 강한 기질 특이성을 갖고 있다는 것을 알 수 있다.

기질	Specific activity (U)
p-니트로페닐-β-D-자일로피라노사이드	290.383
p-니트로페닐-α-D-글루코피라노사이드	검출 안됨
p-니트로페닐-β-D-글루코피라노사이드	검출 안됨
p-니트로페닐-β-D-만노피라노사이드	검출 안됨
p-니트로페닐-β-D-셀로비오사이드	검출 안됨
p-니트로페닐-α-L-아라비노피라노사이드	검출 안됨
p-니트로페닐-β-L-아라비노피라노사이드	검출 안됨
p-니트로페닐-α-L-아라비노퓨라노사이드	검출 안됨
p-니트로페닐-β-D-갈라토피라노사이드	검출 안됨

실시예 7: 대량생산된 신규 자일로시다아제의 효소 특성

효소의 특성을 알아보기 위하여 정제된 자일로시다아제를 시험관에 넣고 다양한 양의 p-니트로페닐-β-D-자일로피라노사이드를 포함하는 50 mM 구연산염 버퍼(pH 6.0)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 15분 동안 반응시켜서 효소반응 속도(Hanes-woolf)를 알아보았다.

그 결과, 도 8에서 나타난 바와 같이 p-니트로페닐-β-D-자일로피라노사이드 기질에 대한 친화도 K_m 값은 1.64이었고, 가수분해 산물은 자일로스였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1344 <212> DNA <213> PXD4-02 <400> 1 atgaccattc agaccattca gtggttttcc acttccaaag caaaagcttg gcaatcccaa 60 tctcatcatc ttagcaaaac ccaagagcat gccaacctga ccattacggg ggaaacgcat 120 cagctcgtcg aaggctttgg tggctgtttt aatgaactgg gctatgtggc cttgaaccat 180 ttggagagcg acgaacggga gcaggtgctt cattctctct tccacccgga gggtgagcac 240 aaattcacaa tttgccgact ccctattgga gccagtgact acgcgctgga atggtacagc 300 cacaatgaaa cggatggcga cgtggagatg aagcattatt ccatcgagcg ggatcagcag 360 tatctcattc ctttcattcg ggaagcgtta cgacttaacc cggacttgaa attgttcgct 420 tccccctgga gcccgccgac atggatgaaa tcgcccaagg cttacaatta cggcacattg 480 cgctgggaaa aagatatttt gaaagcgtat gcattatact tcgtcaaatt tgtgcaggct 540 taccgcgagg caggcattac gattcatcag gtccatgtcc aaaatgaagt cattgccgat 600 cagaaattcc cttcctgtgt atggaccgga gaacaactgc gtgaatttat tcgcgactac 660 ttgggccctg ccttcgagga acacgggctg gatacggaaa tttggctggg taccattaat 720 gcccctgatc cgtgggaaga attaatgaag aaaacgtcca ccggattcga tgaatatgcc 780 cataccgtgc tgagtgaccc ggaggcctac aaatatatta agggtgtggg ctatcagtgg 840 gcaggcaaaa atgccatcca gcgcaccgta gccagctatc ctgagcttcg ttacatgcag 900 accgaaaatg aatgcgggaa cggagaaaat tcctgggact acgccaaaca tgtatataac 960 ctgtaccagc actacttcac caatggcgtg aatgcttata tttactggaa catggttttg 1020 gagccgaaag gcaagagcac atggggatgg gagcaaaatt cgatgatcac cgttgacccg 1080 gcggatcgta agcgtaccct gaacccggaa tattacgtga tgaagcactt ttctcatttt 1140 gtattgccgg gtgcgagacg cattggactc cgtggatcat ggacgggaaa tgccgttgct 1200 ttccgcaatg ctgacggaca aacgatagtg gtcattgcca atccgttcca cgaatcacgt 1260 gtgctgaatc tgtccgctgg agaggatacg catcatttcg aactggagcc tgaatctttt 1320 aacaccatcg tcattccttc ttaa 1344 <210> 2 <211> 447 <212> PRT <213> PXD4-02 <400> 2 Met Thr Ile Gln Thr Ile Gln Trp Phe Ser Thr Ser Lys Ala Lys Ala 1 5 10 15 Trp Gln Ser Gln Ser His His Leu Ser Lys Thr Gln Glu His Ala Asn 20 25 30 Leu Thr Ile Thr Gly Glu Thr His Gln Leu Val Glu Gly Phe Gly Gly 35 40 45 Cys Phe Asn Glu Leu Gly Tyr Val Ala Leu Asn His Leu Glu Ser Asp 50 55 60 Glu Arg Glu Gln Val Leu His Ser Leu Phe His Pro Glu Gly Glu His 65 70 75 80 Lys Phe Thr Ile Cys Arg Leu Pro Ile Gly Ala Ser Asp Tyr Ala Leu 85 90 95 Glu Trp Tyr Ser His Asn Glu Thr Asp Gly Asp Val Glu Met Lys His 100 105 110 Tyr Ser Ile Glu Arg Asp Gln Gln Tyr Leu Ile Pro Phe Ile Arg Glu 115 120 125 Ala Leu Arg Leu Asn Pro Asp Leu Lys Leu Phe Ala Ser Pro Trp Ser 130 135 140 Pro Pro Thr Trp Met Lys Ser Pro Lys Ala Tyr Asn Tyr Gly Thr Leu 145 150 155 160 Arg Trp Glu Lys Asp Ile Leu Lys Ala Tyr Ala Leu Tyr Phe Val Lys 165 170 175 Phe Val Gln Ala Tyr Arg Glu Ala Gly Ile Thr Ile His Gln Val His 180 185 190 Val Gln Asn Glu Val Ile Ala Asp Gln Lys Phe Pro Ser Cys Val Trp 195 200 205 Thr Gly Glu Gln Leu Arg Glu Phe Ile Arg Asp Tyr Leu Gly Pro Ala 210 215 220 Phe Glu Glu His Gly Leu Asp Thr Glu Ile Trp Leu Gly Thr Ile Asn 225 230 235 240 Ala Pro Asp Pro Trp Glu Glu Leu Met Lys Lys Thr Ser Thr Gly Phe 245 250 255 Asp Glu Tyr Ala His Thr Val Leu Ser Asp Pro Glu Ala Tyr Lys Tyr 260 265 270 Ile Lys Gly Val Gly Tyr Gln Trp Ala Gly Lys Asn Ala Ile Gln Arg 275 280 285 Thr Val Ala Ser Tyr Pro Glu Leu Arg Tyr Met Gln Thr Glu Asn Glu 290 295 300 Cys Gly Asn Gly Glu Asn Ser Trp Asp Tyr Ala Lys His Val Tyr Asn 305 310 315 320 Leu Tyr Gln His Tyr Phe Thr Asn Gly Val Asn Ala Tyr Ile Tyr Trp 325 330 335 Asn Met Val Leu Glu Pro Lys Gly Lys Ser Thr Trp Gly Trp Glu Gln 340 345 350 Asn Ser Met Ile Thr Val Asp Pro Ala Asp Arg Lys Arg Thr Leu Asn 355 360 365 Pro Glu Tyr Tyr Val Met Lys His Phe Ser His Phe Val Leu Pro Gly 370 375 380 Ala Arg Arg Ile Gly Leu Arg Gly Ser Trp Thr Gly Asn Ala Val Ala 385 390 395 400 Phe Arg Asn Ala Asp Gly Gln Thr Ile Val Val Ile Ala Asn Pro Phe 405 410 415 His Glu Ser Arg Val Leu Asn Leu Ser Ala Gly Glu Asp Thr His His 420 425 430 Phe Glu Leu Glu Pro Glu Ser Phe Asn Thr Ile Val Ile Pro Ser 435 440 445 <210> 3 <211> 1393 <212> RNA <213> HPL-3 16S rRNA <400> 3 ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgagcggg gttatgttaa 60 aagcttgctt ttaacataac ctagcggcgg acgggtgagt aacacgtagg caacctgccc 120 atcagactgg gataactacc ggaaacggta gctaataccg gatacatcct ttccctgcat 180 ggggagagga ggaaagacgg agcaatctgt cactgatgga tgggcctgcg gcgcattagc 240 tagttggtgg ggtgaaggcc taccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc 300 ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 360 ccgcaatggg cgaaagcctg acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg 420 taaagctctg ttgccaggga agaacgtctt gtagagtaac tgctacaaga gtgacggtac 480 ctgagaagaa agccccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggggcaag 540 cgttgtccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg ctctttaagt ctggtgttta 600 atcccgaggc tcaacttcgg gtcgcactgg aaactgggga gcttgagtgc agaagaggag 660 agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatgt ggaggaacac cagtggcgaa 720 ggcgactctc tgggctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt 780 agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgaatgctag gtgttagggg tttcgatacc 840 cttggtgccg aagttaacac attaagcatt ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa 900 actcaaagga attgacgggg acccgcacaa gcagtggagt atgtggttta attcgaagca 960 acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc cctctgatcg gtctagagat agatctttcc 1020 ttcgggacag aggagacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080 gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat gcttagttgc cagcaggtca agctgggcac 1140 tctaagcaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc 1200 cccttatgac ctgggctaca cacgtactac aatggccggt acaacgggaa gcgaaagagc 1260 gatctggagc gaatcctaga aaagccggtc tcagttcgga ttgcaggctg caactcgcct 1320 gcatgaagtc ggaattgcta gtaatcgcgg atcagcatgc ccgcggtgaa tacgttcccg 1380 ggtcttgtac aca 1393 <210> 4 <211> 3666 <212> DNA <213> GM3-PXD4 <400> 4 gtatcgataa gcttgatcag ctcgacctcc gcctgatcta cctcaagccg atgagccatc 60 gtattgagaa tggccgtgcc gaaccgcagg acatgcgact caggcagcac atggccctcc 120 acccgtttca ttagcgcgtt cgcgcgggca atcagcacct tggggctaaa aggcttggta 180 acgtagtcat ctgctcccag ctcaaagccc aatattttat catcatcacc ggatttggcg 240 gtcagcaaaa tgatcggcac cccggaacgg ctgcgaacct gacggcatac ctcccaacca 300 tccagctccg gcatcataat atcgagtatg accaggtcgg gctgcaccga atcaaaccag 360 attagcgcat cttttccatt gtctgcttca tagacttccc aattattctg tttaaaataa 420 tccgcaatga cttcacggat acgaatttca tcctccacga gaagaatcct tttattcaat 480 cgacttccct ctttcggtca ttctaggaca tcagcatact atagacatgt gttctttatg 540 tgttcttagc acttctgatt agcagaatct agcttggatt agggcaaatt tgtcttggct 600 cagaccatct catctcctat gatcctaccc tataataaga agagatacaa aaagcgttca 660 caggagggta atacatgacc attcagacca ttcagtggtt ttccacttcc aaagcaaaag 720 cttggcaatc ccaatctcat catcttagca aaacccaaga gcatgccaac ctgaccatta 780 cgggggaaac gcatcagctc gtcgaaggct ttggtggctg ttttaatgaa ctgggctatg 840 tggccttgaa ccatttggag agcgacgaac gggagcaggt gcttcattct ctcttccacc 900 cggagggtga gcacaaattc acaatttgcc gactccctat tggagccagt gactacgcgc 960 tggaatggta cagccacaat gaaacggatg gcgacgtgga gatgaagcat tattccatcg 1020 agcgggatca gcagtatctc attcctttca ttcgggaagc gttacgactt aacccggact 1080 tgaaattgtt cgcttccccc tggagcccgc cgacatggat gaaatcgccc aaggcttaca 1140 attacggcac attgcgctgg gaaaaagata ttttgaaagc gtatgcatta tacttcgtca 1200 aatttgtgca ggcttaccgc gaggcaggca ttacgattca tcaggtccat gtccaaaatg 1260 aagtcattgc cgatcagaaa ttcccttcct gtgtatggac cggagaacaa ctgcgtgaat 1320 ttattcgcga ctacttgggc cctgccttcg aggaacacgg gctggatacg gaaatttggc 1380 tgggtaccat taatgcccct gatccgtggg aagaattaat gaagaaaacg tccaccggat 1440 tcgatgaata tgcccatacc gtgctgagtg acccggaggc ctacaaatat attaagggtg 1500 tgggctatca gtgggcaggc aaaaatgcca tccagcgcac cgtagccagc tatcctgagc 1560 ttcgttacat gcagaccgaa aatgaatgcg ggaacggaga aaattcctgg gactacgcca 1620 aacatgtata taacctgtac cagcactact tcaccaatgg cgtgaatgct tatatttact 1680 ggaacatggt tttggagccg aaaggcaaga gcacatgggg atgggagcaa aattcgatga 1740 tcaccgttga cccggcggat cgtaagcgta ccctgaaccc ggaatattac gtgatgaagc 1800 acttttctca ttttgtattg ccgggtgcga gacgcattgg actccgtgga tcatggacgg 1860 gaaatgccgt tgctttccgc aatgctgacg gacaaacgat agtggtcatt gccaatccgt 1920 tccacgaatc acgtgtgctg aatctgtccg ctggagagga tacgcatcat ttcgaactgg 1980 agcctgaatc ttttaacacc atcgtcattc cttcttaacg gtcgtagctt tcccgaacgc 2040 tcacagatca ttactcgtca ctgtctggtc cttccgtatc caaaagtatg gttagtttcc 2100 aaaatggatg tatccccttt tgcgtatggt agccataaat agtatacttg gagtaactac 2160 ggacaggagg tcgatgaaca tcactactgt aaaagaccgg attgatttga agctgattaa 2220 ttgtgataag gaattgaccc tcgcagtcat cggcgggaaa tggaagctga ttattttgtg 2280 gcatctcggc ttggaaggca ccaagcggtt cggtgaactg aaaaagctga tcccccatat 2340 cacgcaaaaa atgctgacca accaactgcg cgagctggag gaggataaac tcattcttcg 2400 taaggtctat cctgtcgtcc ctccgcatgt ggaatactca ctgactgagc atggtgaaag 2460 cctgattcca gtactgagag cgatgtacga ttggggatca aactatcgcg agaacgtgat 2520 ttggaaagaa gaagaagcga ttcaggacgt aacgcccgtt taatcagctt aactatacat 2580 tttcatgatg aaggcaattc tggggatacc cggggttgtc tttttgtcat ccttaacctt 2640 tttttgaatg agcggctcca cttgcttctt ccggagaatg aatgagaagt ctatgatcga 2700 tcggtgaaga catgacaatc aggctcgtgt aggttccata cttatcgcac tggttgctga 2760 actcttcgag ggtgcgcgtc gagctggtca ctacttttaa taaataactg tgttctccgc 2820 ttatacggtg gcactcggca acatgtggag atgtatggac aaaatcaaga aatccctggc 2880 aatctctagt ccgaaacaat atataggctg ccgtatcctt tcctattttt tcaggagaga 2940 tgatcgtgcg atactcctcg ataacccctt tttcttccat tcgtttaact cgttctgtta 3000 cagcaggttg ggacaaaccc acgcattttc ctagctccgt cattgaaatc cttgcctgat 3060 tttgaagata aaagaggatt tgtttgtcta catgatccac tttgaatgcc cctcctttaa 3120 aattaatgtt tttacgaaaa attcatttaa ttactttgta taattatcat aatggattga 3180 ttgtgttatg taaaataaat gatttaaatt atataataaa actcacatcg ataaggtgaa 3240 ccaaacatga aaagatagag aggatggcta cccttgagca aatacgttgt aaataaggta 3300 ggcacagcag cagatttaga gttacgcatt gaaggggcta ttgatcgtac aattgacgaa 3360 aaaaggctgg ttggtgctgt tgtacgagtt gcgtttaatg gggcgcaata ttatagttct 3420 gctggatgtc caaaccgtga gcaaaagtct ggagggaact ctcagtgagc ctctccctct 3480 cccgcaaaaa tataattgca ttggccgcta tatgtttgtc cgcattgatg ttcggcctcg 3540 aaatttccag tgtgccagtg atactgccaa ccctggaaaa ggtattgcat ggtgatctca 3600 aggatatgca atggattatg atcgaattcc tgcagcccgg gggatccact agttctagag 3660 cggccg 3666 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> foward primer <400> 5 acatgccata tgaccattca gaccatt 27 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> reverse primer <400> 6 acatgcggat cccttaagaa ggaatgacga t 31

Claims (11)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 서열목록 제2서열에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 자일로시다아제(xylosidase) 또는 상기 자일로시다아제를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포를 자일로오즈(xylose)-포함 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드에 접촉시키는 단계를 포함하는 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드의 분해 방법; 상기 분해는 45-55℃의 반응 온도, pH 5-9의 반응 pH 및 Na⁺, Li⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid), 2-ME(2-Mercaptoethanol) 및 DTT(Dithiothreitol)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이온 또는 화합물을 포함하는 조건에서 실시한다.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제

Images