KR101929400B1

KR101929400B1 - 신규한 베타-아가레이즈 유전자 및 이를 이용한 베타-아가레이즈의 생산방법

Info

Publication number: KR101929400B1
Application number: KR1020120114555A
Authority: KR
Inventors: 장용근; 지원재; 홍순광; 송재양
Original assignee: 에스케이이노베이션 주식회사; 한국과학기술원
Priority date: 2012-10-16
Filing date: 2012-10-16
Publication date: 2018-12-17
Also published as: KR20140048516A

Abstract

본 발명은 신규한 베타-아가레이즈 유전자 및 이를 이용한 베타-아가레이즈의 생산방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 베타-아가레이즈 유전자는 베타-아가레이즈를 생산하지 못하는 이종균주의 도입시 베타-아가레이즈를 고농도로 배양액 중에 직접 축적시킬 수 있으며, 베타-아가레이즈를 보다 경제적으로 대량생산할 수 있는 장점이 있다.

Description

신규한 베타-아가레이즈 유전자 및 이를 이용한 베타-아가레이즈의 생산방법{Novel beta-agarase producing gene and transformed bacterial strain using thereof}

본 발명은 신규한 베타-아가레이즈 유전자 및 이를 이용한 베타-아가레이즈의 생산방법에 관한 것이다.

최근 경제 발전과 산업화의 진전이 점점 가속화됨에 따라 유래 없는 고유가 시대를 맞이하고, 화석 연료로 인한 환경 오염 및 지구온난화 방지라는 측면까지 부각되면서 전 세계적으로 화석연료를 대체할 에너지에 대한 관심과 수요가 폭발적으로 증가하고 있다. 이에 따라 바이오연료를 개발하기 위한 연구가 세계적으로 활발하게 진행되고 있으며, 바이오연료가 세계경제의 키워드로 부상하였다.

현재까지는 주로 작물, 목재, 천연섬유 등의 식물 셀룰로오스 자원을 보강재로 이용하는 고분자 복합재료 혹은 이들 자원을 이용한 바이오 연료 제조 연구가 주로 많이 진행되고 있으며, 유럽공동체와 북미에서는 실용화도 상당히 이루어진 상태이다. 그러나 상기 전분질, 목질계통의 바이오매스를 이용하는데 여러 문제점들이 대두되어, 이러한 문제점들을 해결하기 위한 다양한 연구와 새로운 천연자원을 찾기 위한 노력이 꾸준하게 진행되고 있는 가운데 최근 해조류에 관심이 집중되고 있다.

해조류는 일반적으로 이용되는 에너지 곡물에 비해 연료 생산량이 월등히 높으며, 지구온난화의 주범인 이산화탄소 흡수능이 뛰어나고, 태양광 및 비식용수만을 이용하며, 매우 빠른 속도로 성장이 이루어진다는 장점을 가지고 있다.

해조류 중에서도 홍조류는 바다 속에 다량 존재하고 있으나 이용률이 높지 않은 수산자원으로 글루칸(glucan) 20%, 갈락탄(galactan) 60%, 단백질 10%, 기타 10%로 구성되어 있으며, 주로 식용 및 화장품에 사용하거나, 정제하여 연구용 아가 (agar) 또는 아가로오스(agarose)로 사용하여 왔다.

홍조류 바이오매스를 기질로 이용하여 에탄올 발효를 수행할 경우, 구성 성분 중 아가로오스를 효율적으로 당화시킬 수 있는 기술 개발이 최우선적으로 필요한 것이 현실이다.

아가(Agar)은 70%의 아가로오스(agarose)와 30%의 아가로팩틴(agaropectin)으로 구성되어 있는 것으로 보고되고 있다. 아가로오스는 갈락토오스(D-galactose)와 3,6-anhydro-L-galactose가 β-1, 4 형태로 결합한 단위체인 아가로바이오스(agarobiose)가 반복되어 α-1, 3 결합으로 연결된 직쇄구조로 되어 있어 있으며, 아가로팩틴의 경우 아가로오스와 같은 구조를 가지고 있으나 그 곁가지(side chain)에 황산기나 포스페이트기(phosphate) 등이 결합하고 있어 겔 화력을 약화시키는 것으로 알려져 있다.

아가로오스(agarose)는 β-1, 4 결합에 작용하는 베타-아가레이즈(β-agarase)를 사용하여 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)를 거쳐 네오아가로바이오스(neoagarobiose)로 분해되고 계속해서 α-1, 3 결합에 작용하는 알파-네오아가로바이오스 하이드로레이즈(α-neoagarobiose hydrolase)를 사용하여 갈락토오스(D-galactose)와 3,6-anhydro-L-galactose로 분해할 수 있다. 아가로오스를 분해하는 베타-아가레이즈의 경우 아직까지 대량으로 효소를 발현할 수 있는 기술이 충분하지 않은 것이 현실이며, 따라서 우수한 아가레이즈의 유전자원을 확보하고 발현 시스템을 개발하는 것은 매우 가치 있는 일이라고 할 수 있다.

Xiao Ting Fu et al., J microbiology and biotechnology 2009 Mar;19(3):257-64

본 발명의 목적은 기질로 제공되는 홍조류 바이오매스 내 아가로오스를 효율적으로 당화시킬 수 있는, 신규한 베타-아가레이즈 생산 유전자 및 이를 이용한 베타-아가레이즈의 생산방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 베타-아가레이즈를 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자 또는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자 또는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환 된 형질전환 세포를 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자가 형질전환된 재조합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 베타-아가레이즈의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 베타-아가레이즈 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터는 베타-아가레이즈를 생산하지 못하는 이종균주의 도입시 베타-아가레이즈를 고농도로 배양액 중에 직접 축적시킬 수 있으며, 베타-아가레이즈를 보다 경제적으로 대량생산할 수 있는 장점이 있다.

나아가, 이를 이용하여 생산하는 네오아가로바이오스와 네오아가로테트라오스는 이후 완전한 환원당을 얻기 위한 에너지, 의학 및 식품분야에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 알테로모나스(Alteromonas sp.) 균주의 유전자 라이브러리로부터 분리한 아가레이즈 DNA 단편을 도식화한 도면이고,
도 2는 알테로모나스(Alteromonas sp.) 균주의 유전자 라이브러리로부터 분리한 아가레이즈 DNA 단편의 염기서열 보여주는 도면이며,
도 3은 베타-아가레이즈 유전자(AG gene)의 아미노산 서열을 보여주는 도면이고,
도 4는 베타-아가레이즈 유전자(AG gene)의 염기서열을 보여주는 도면이며,
도 5는 베타-아가레이즈 유전자(AG gene)를 포함하고 있는 대장균용 고발현 벡터(pET22b-AG vector)를 도식화한 도면이고,
도 6은 베타-아가레이즈 유전자(AG gene)가 형질전환된 대장균의 배양시 배양온도 및 IPTG 농도에 따른 베타-아가레이즈의 활성을 비교한 결과를 보여주는 도면이며,
도 7은 베타-아가레이즈 유전자(AG gene)가 형질전환된 대장균에서 수득한 베타-아가레이즈를 사용하여 아가로오즈를 분해하고, 이를 TLC(thin-layer chromatography)법을 이용하여 분석한 결과를 보여주는 도면이고,
도 8은 베타-아가레이즈 유전자(AG gene)가 형질전환된 대장균에서 수득한 베타-아가레이즈를 사용하여 아가로오즈를 분해하고, 이를 MS(mass spectrometry)를 이용하여 분석한 결과를 보여주는 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 베타-아가레이즈를 제공한다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 알테로모나스 (Alteromonas sp.)균주의 유전자 라이브러리를 제작하고, 제작된 라이브러리로부터 베타-아가레이즈 생산에 관여하는 유전자를 분리하였고, 분리된 유전자 중 903bp의 서열번호 3의 염기서열을 갖는 신규한 유전자를 발견하였다. 신규한 유전자는 NCBI에 등재되어 있지 않으며, 기능은 밝혀지지 않았지만 NCBI Blast search를 통해 미생물 유래의 아가레이즈(agarase)들과 높은 상동성을 가지는, 신규한 베타-아가레이즈 유전자였다.

본 발명의 일 실시예에 따른 베타-아가레이즈 유전자는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어진다.

본 발명의 일 실시예에 따른 베타-아가레이즈 유전자는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어짐에 있어, 유전자 코드의 디제너러시(degeneracy)를 고려하여 서열번호 3에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 베타-아가레이즈 유전자에 포함된다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자 또는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 사용가능한 벡터는 특별히 제한되지 않으며, 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 대장균용 고발현 벡터 pET22b(+) 벡터를 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 벡터는 pET22b(+) 벡터에 서열번호 3의 유전자를 삽입시켜 제조한 재조합 pET22b-AG 벡터일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 벡터에는 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환 세포의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자 또는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환 된 형질전환 균주를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 형질전환 균주는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 베타-아가레이즈 유전자의 발현을 조절하는 조절 인자의 변형에 의해 또는 유전자의 카피 수의 증가에 의해 그 발현이 증가된 미생물일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 형질전환 균주는 알테로모나스 (Alteromonas sp.) 균주로부터 분리된 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 베타-아가레이즈 생산능을 가지는 미생물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 형질전환 균주는 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.), 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속 (Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)에서 선택되는 1종 이상의 미생물일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 베타-아가레이즈 생산능을 가지는 미생물은 서열번호 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 예를 들면 pET22b-AG 벡터로 통상적인 열충격(heat shock) 방법을 이용하여 형질전환 되고, 선별마커인 항생제 암피실린(ampicillin)을 포함하는 배지에서 배양하여 선별될 수 있다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자가 형질전환된 재조합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 베타-아가레이즈의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 베타-아가레이즈의 생산방법은 서열번호 3의 신규한 유전자의 발현이 증가된 베타 베타-아가레이즈 생산능을 갖는 미생물을 배양하는 단계 및 배양액으로부터 베타-아가레이즈를 분리하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 미생물은 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지에서 호기성 조건하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양된다. 탄소원으로서는 글루코오스, 프럭토오스, 살균된 전처리 당밀, 즉, 환원당으로 전환된 당밀 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크, 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기화합물로는 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기 등이 첨가될 수 있다. 배양은 호기적 조건하에서 예를 들면, 진탕배양 또는 통기교반배양에 의해, 10 내지 40℃의 온도 보다 바람직하게는 15 내지 25℃에서 수행될 수 있다. 배지의 pH는 배양하는 동안 pH 6 내지8에서 유지하는 것이 바람직하며, 배양은 0.5 내지 2일 동안 수행할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다

[ 실시예 1] 알테로모나스 균주( Alteromonas sp .)의 유전자라이브러리 작성

그람 음성(Gram negative)균의 경우에는 유전자 자신의 프로모터로 대장균(E. coli) 내에서 발현 될 수 있는 특성이 있다. 이러한 특성을 이용하여 알테로모나스(Alteromonas sp.) 발현 라이브러리(expression library)를 제작하였다. 균주를 액체배지에서 지수적 증식(exponential growth)까지 키운 후, 균체만을 회수하여 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하였다. 게놈 DNA는 제한효소 HindⅢ를 사용하여 절단하고, 절단된 게놈 DNA는 같은 제한효소로 절단된 pBluescriptⅡ KS plasmid 에 라이게이션(ligation) 하였다. 벡터인 pBluescriptⅡ KS는 분리 후에 제한효소로 자른 후 CIAP(calf intestinal alkaline phosphatase)로 5'인산기(5' phosphate group)를 제거하여 게놈 DNA와의 라이게이션 효율을 높였다. ligation mixture는 E. coli JM109에 형질전환하여 암피실린(ampicillin)이 함유된 LB plate에 도말한 후 37℃에서 하루동안 배양하였다. 콜로니(colony)들 중에서 화이트 콜로니(white colony)만을 새로운 고체배지에 계대하여 유전자라이브러리를 구축하였다.

[ 실시예 2] 아가레이즈 유전자의 확보

실시예 1에서 선택된 콜로니들은 루골요오드 용액(Lugol's Iodine solution)으로 염색하여 콜로니 주변에 아가 분해환을 관찰하였다. 환을 형성한 콜로니 만을 선택하여 액체배양 한 후, 플라스미드 DNA(plasmid DNA)를 회수하였다. 회수된 DNA는 여러 종류의 제한효소로 절단 후 제한효소 지도(restriction mapping)로 분석하는 방법을 이용하여 동일한 클론의 유무를 확인하였다. 최종적으로 확보된 DNA 단편내 염기서열분석을 통하여 아가레이즈(agarase) 코드 유전자의 정보를 확인하였다.

도 1에 도시한 바와 같이, DNA 단편은 총 5062 bp의 크기로 세 개의 ORF를 포함하고 있었다(서열번호 1). 각각 ORF1, ORF2, ORF3로 명명하였다.

ORF1은 도 3에 도시한 바와 같이, 301개의 아미노산을 코드하고 있으며(서열번호 2), 아미노산을 이용하여 NCBI Blast search 검색결과 미생물유래 아가레이즈(agarase)들과 높은 상동성을 나타냈다. ORF2는 Tetratricopeptide repeat family 단백질과 상동성을 보였다. ORF3는 HindⅢ 제한효소에 의해서 잘린 상태로 클로닝 되었는데, 밝혀진 염기서열을 이용하여 추정된 아미노산 서열의 상동성을 검색한 결과 미생물유래의 아가레이즈(agarase)들과 높은 상동성을 나타냈다.

따라서 확보된 클론은 온전한 1개의 아가레이즈(ORF1, 이후 AG로 명명함)를 포함하고 있으며, AG(아가레이즈 효소)가 실시예 1의 형질전환체에 대한 아가분해활성에 관여한 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 3] pET22b - AG 재조합 발현 벡터의 제작

AG 유전자를 클로닝 하기 위하여, 실시예 2의 결과로부터 프라이머를 디자인하여 PCR을 사용하여 베타-아가레이즈 유전자를 확보하였다.

확보한 한 다음, 제한효소 NdeI과 HindⅢ를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 반응한 후 0.7% 아가로스 젤에 전기영동 하여 회수하였다.

대장균용 고발현 벡터 pET22b(+)를 역시 제한효소 NdeI과 HindⅢ를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 반응한 후, 0.7% 아가로스 젤에 전기영동하여 회수하였다.

상기 회수된 유전자 단편들을 T4 DNA ligase로 4℃에서 12시간 이상 처리하여 재조합 발현 벡터를 제작하였다.

도 4에 도시한 바와 같이, 재조합 발현 벡터 pET22b-AG를 대장균 DH5α에 열충격(heat shock) 방법을 이용하여 형질전환 하였으며, 형질전환된 대장균을 LBA 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 이상 배양하였다.

배양된 배양물로부터 균체를 회수한 후, 플라스미드 회수 키트를 사용하여 플라스미드를 회수하고, 최종적으로 제작된 재조합 발현 벡터를 확인하였다.

[ 실시예 4] 아가레이즈 생산 유전자의 대장균 BL21 로의 도입

실시예 3에서 얻은 베타-아가레이즈 생산 재조합 발현 벡터 pET22b-AG를 대장균 BL21에 열충격(heat shock) 방법을 이용하여 형질전환 하였다. 형질전환된 대장균을 LBA 고체 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 이상 배양한 후, 1 mM의 IPTG를 넣어 베타-아가레이즈의 발현을 확인하였다.

[ 실시예 5] 아가레이즈 형질전환 대장균으로부터 아가레이즈 발현 최적화

실시예 4에서 대장균 BL21에 형질전환한 형질전환체를 LBA 액체 배지, 37℃에서 12시간 정도 시드(seed) 배양을 한 뒤, 플라스크에 배양액을 1% 접종하여 본배양을 실시하였다.

1차 실험에서 동일한 IPTG 처리시 배양 온도에 따른 아가레이즈 활성을 조사하였다. 본배양 3시간 후에 발현을 위하여 1 mM IPTG를 접종한 이후 플라스크를 각각 18℃, 25℃, 30℃, 37℃에서 6시간 동안 배양한 후 원심분리 하여 세포와 배양액을 분리하였다. 세포는 세척 한 후, 세포 파쇄기(Cell homogenizer)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 배양액과 세포 파쇄액은 50 mM Tris-Cl(pH 7.0) 버퍼에 0.2% 아가로오스를 녹인 후 1/40을 첨가하여 10분간 40℃에서 반응시킨 후, DNS 용액을 1:1 비율로 섞어 10분간 열처리하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여, 아가레이즈 활성을 측정하였다.

또한, 2차 배양에서 IPTG 농도별 처리에 따른 아가레이즈의 활성을 조사하였다. 본배양 3시간 후에 발현을 위하여 각각 1 mM, 0.5 mM, 0.2 mM, 0.1 mM의 IPTG를 첨가한 후 18℃에서 6시간 동안 배양하였다.

도 6에 도시한 바와 같이, 18℃에서 배양한 플라스크에서 가장 높은 아가레이즈 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 0.1 mM IPTG를 첨가한 플라스크에서 가장 높은 아가레이즈 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 6] 베타- 아가레이즈를 사용한 아가로오스의 분해

실시예 5에서 수득된 아가레이즈를 사용하여 아가로오스를 분해하고, 그 분해산물을 분석하였다.

50 mM Tris-Cl(pH 7.0) 버퍼 400 ml에 1%의 아가로오스를 끓여서 녹인 후, 베타-아가레이즈가 첨가된 배양액을 100 ml 첨가하여 40℃에서 12시간 동안 배양한 후 그 분해 산물을 TLC(thin-layer chromatography)를 이용하여 분석하였다.

도 7에 도시한 바와 같이, 표준샘플로 이용한 갈락토오스와 갈락토바이오스와 비슷한 위치에 분해산물이 보이는 것을 확인할 수 있었다.

이를 다시 MS(mass spectrometry)로 분석하였다.

도 8에 도시한 바와 같이, 네오아가로바이오스 (neoagarobiose)와 네오아가로테트라오스 (neoagarotetraose)의 분자량과 같은 위치에서 피크가 보임을 확인할 수 있었다. TLC 상에서는 갈락토오스와 네오아가로바이오스의 점이 같은 위치에 보이고, 갈락토바이오스와 네오아가로테트라오스의 점이 같은 위치에 보이는 것으로 보고된 내용을 미루어보아, 실시예 5에서 수득한 베타-아가레이즈의 경우 아가로오스를 분해하여 네오아가로바이오스와 네오아가로테트라오스를 생산하는 것을 확인할 수 있었다.

<110> SK Innovation Co., Ltd. Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Novel beta-agarase producing gene and transformed bacterial strain using thereof <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5062 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Alteromonas sp. DNA fragment <400> 1 aagcttttcg acgaaagaat gacgtgtgta tttacgcaaa ggtaggcggg tgataatgag 60 ttctatgaaa aaaatggtct atatatttgt ggctgtttca acagctgttg cagcgattcc 120 tttcatcagc aaggccactg aaaaaagttt tgatgttgat gaagcaagcc cattaatgcc 180 atcgtttgtc gcattcgaag atacaacgcc cgccggtatg acatggcaaa aagttgaagc 240 tctttccgat gagtttaatc agtcgtggga cgcgtctaaa tggaaaagat caaattggaa 300 ttattctgac actcctgtga atatggttga tacaaactca ggggtggaga atggctacct 360 ttggattagt gctacgctgg atgattcaac agaagaaagc tggtttaaaa cttcacgggt 420 acattctaaa gcgaaaatta gctttcctat gtacacagaa acacgtttga aagttgcaca 480 catagcggct tataacacat tttggttgaa taatggtgat gcagataatc gagatgaaat 540 tgatattatt gagattaatt ctgatccaac ttgtggggag aatgatgaat atccttggca 600 gatgaattct cagtatttta ttgttaaaaa tggagaaaca gagcgtaata aagggccttg 660 gagcacgaaa aaattatcgg atgccaacac ccgtaaaggc gtgacgtgga accaggacta 720 tcatgtattt ggcgcatggt ggaaagatga acacaatgta cagttttacc tgaatgggga 780 accggcgggt catgtagtga gcagtcagcc tttcacgtta cagcaggagc tgatttggga 840 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gcccgaccac gccgaaactg cctcatcagg tcagctgtct ttgtcgttaa gcgaacagaa 1740 agccataggg cagtggctga tagatgacgg agaaaaaatt gcttcttggc atggagagcc 1800 cagagataac acctttatgg aaacgtgctt tgcctgccac tcgttacgca cgccaatcac 1860 tgatggaata aagccgaatg tcgcctttct cgatcagttt ttgccatcgc tgttagttcc 1920 ccctatgtat catgcagatg gccaaattaa agaagaggtg tacgtttacg gttctttttt 1980 acaaagtaaa atgtatgccg cgggtgttaa ttgtctcgat tgtcatgaca aacatacgat 2040 gaaaattaaa gtagaaggta acgggttatg tttgcaatgt catagcgctg aggtttatca 2100 acaacctgcc catattcgtc atgagattga ttcatcggcg gggcagtgtg tgagttgtca 2160 tatgccagaa acaacgtata tgggagtgga tgctcgccgt gatcacagtt ttaaggttcc 2220 acgtcctgac ctcagtatta agtacgacac gccgaacgca tgtaatggat gccacctttc 2280 tcaaacacca agctgggctg cagatattat tacgcaatgg cgcggtgcgt ctgtactttc 2340 agcatctcag ggtgaagatt ttcttgcgct tatgcatgaa gggcgcttgc cggtatctgc 2400 gcacttttcc cttatcaata acgcagaact tagtgaaata gtgcgtgcca gcgcgatagc 2460 gatgttacca agcagtgttg ccgaactcac tgacaaggat ataaaagcgt gggtaaattc 2520 acagcatgat cttattcggt tcgccgttgc tggtgtaggg caactactgc cagtaaaaga 2580 gcgtttaaaa tcttatcgaa cactgttaga tgacaagtta acggcggtgc gactgactgc 2640 agccaatcat ttgctggatg cgggtttaag ccacaacgac agtttcaaaa atgcattgca 2700 gatattatta aatgctaatg aagtctcaat gtggcgtggg gagtctgcac ttaaccaaag 2760 tatggtatac ctgcaattag gtaagtttaa agacacggtg aaaacgttac agcatggtat 2820 taacgttgac ccatattttg tgccgaacta tgtaaattta gccgatgtgt atcgcaatac 2880 cggggaaggg agcaaagaaa gcctgatcct cgaaaaaggc ttaaaagcga accctacgtc 2940 ggcggtttgc actacgccca aggtatgtct cttatacgcc aacagaaaaa gccagattct 3000 attcaggcat ttcgtcaggc ggttaaatta gcacctgaga atgtacagta cgtatatgtg 3060 tatttcctag ccttggatgg cattggacaa acgccactag cgctacggga gctgaagctg 3120 gctttaagtc gctaccagta tcacccacaa ttacagcagt tgggtttcaa tttcgcacag 3180 aaaatgaatg atcttgaagc actcgcgtat tttcagaaaa tagcaaaaaa aacggcaagg 3240 taacttgccg ttgtagataa ccatataacc ttcaccactt aggcttaccg ctgattaaat 3300 cttgctggat ataaggtggt gttaaattct cttgcggcgt ttaccatttc tgtataggga 3360 atgtctgtaa cggaaacaaa gcccacgtta tagttctctc cgtcaaatgc tcgaccacta 3420 ataggtgagt ctacgtattg gaaccagtga gcgcctacca tgttaggatg gtcgactaca 3480 gactgcatat actgctgata cattttagcc cgatcttctt ggtcggcggc agcaaccagc 3540 cctgggtgaa ataaacccga gtcagtattg gtccctatat gaaattcgcc gataatactt 3600 ggcaggtcta tatcttcaat aaagcgccat tgtgaaggtt gaacgccctc tttgtatata 3660 ttaaaactaa gtacatcgct gtatcgtgtg gctgcgctaa tcgttcatct ggcattcccc 3720 agctggccat acgtgcgccc atataaaggt ggtgtggtaa cgcagtttca agtgcatcat 3780 gtaccacttt aaagtattgc tcagatagca tttcaagcat catcgacaaa tccttctcga 3840 gcgcagccgt aggctgttgt ggctgccacg cattattcag cgcttgccat gaggtgaatg 3900 aggtgcccca accttcattc agtgagttca atgacgagta tttttgtttt aacgcgtcaa 3960 caaacgcttt tttagcaggg ctttcgtcaa tggagtgaga tagtgcgtct aaaataagcc 4020 cgtagcgttg ttcaagagta ccttctgttc gaccccaact tttttcatta tcgacaaaaa 4080 ttccgatgca ccatggtgaa gattgtattt cttttgctat ttgattgatg gtgacttgtg 4140 ctcgacgcac aaattctggg tcgaaggaat cgggcattga gtcccaaaca tcatggacag 4200 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tcaacagaag aaagctggtt taaaacttca 360 cgggtacatt ctaaagcgaa aattagcttt cctatgtaca cagaaacacg tttgaaagtt 420 gcacacatag cggcttataa cacattttgg ttgaataatg gtgatgcaga taatcgagat 480 gaaattgata ttattgagat taattctgat ccaacttgtg gggagaatga tgaatatcct 540 tggcagatga attctcagta ttttattgtt aaaaatggag aaacagagcg taataaaggg 600 ccttggagca cgaaaaaatt atcggatgcc aacacccgta aaggcgtgac gtggaaccag 660 gactatcatg tatttggcgc atggtggaaa gatgaacaca atgtacagtt ttacctgaat 720 ggggaaccgg cgggtcatgt agtgagcagt cagcctttca cgttacagca ggagctgatt 780 tgggatctct ggacgcaaga cagttcttgg gtttgcggcc tgccagaaaa agaagactta 840 ctagaccata agcgcaatac aatgaaggtt gactgggtta ggacatggaa gttagtgtcc 900 aaataa 906

Claims

서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 베타-아가레이즈.
서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자.
제 2항에 있어서,
상기 베타-아가레이즈 유전자는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 유전자.
제 2항 또는 제 3항에 따른 베타-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제 4항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 균주.
제 5항에 있어서,
상기 형질전환 균주는 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.), 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속 (Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)에서 선택되는 1종 이상인 형질전환 균주.
서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 베타-아가레이즈 유전자로 형질전환된 재조합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 베타-아가레이즈의 생산방법.
제 7항에 있어서,
상기 베타-아가레이즈 유전자는 서열번호 3에 기재된 염기서열로 이루어지는 생산방법.
제 7항에 있어서,
상기 배양은 10 내지 40℃에서 수행하는 생산방법.