KR100821377B1 - 내열성 아라비노오스 이성화효소 활성을 갖는 신규한지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al 균주, 그 효소 및타가토오스의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내열성 아라비노오스 이성화효소 활성을 갖는 신규한 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-A1(Geobacillus thermodenitrificans CBG-A1) 균주, 그 효소 및 타가토오스의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명의 균주는 내열성 아라비노오스 이성화효소를 생산하며, 이 효소는 높은 온도에서도 안정적으로 효소반응을 촉매할 수 있다.

본 발명의 타가토스 생산 방법은, 알긴산나트륨, 알루미나 또는 실리카 중에서 선택된 한 담체에 아라비노스 이성화효소를 부착시키고, 글루타알데하이드를 이용하여 가교 처리함으로써 고정화시킨다.

본 발명의 균주, 그에 의해 생산되는 내열성 아라비노오스 이성화효소 및 타가토오스의 생산방법은 타가토스의 대량 생산에 효율적으로 사용될 수 있다.

Description

내열성 아라비노오스 이성화효소 활성을 갖는 신규한 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al 균주, 그 효소 및 타가토오스의 생산방법{A Noble Geobacillus thermodenitrificans CBG-Al strain expressing thermostable L-arabinose isomerase activity, the said enzyme and tagatose-production method}

본 발명은 내열성 아라비노오스 이성화효소 활성을 갖는 신규한 균주, 그 효소 및 타가토오스의 생산방법에 관한 것이다.

타가토오스(tagatose)는 갈락토오스(galactose)의 이성질체로, 프룩토오스(fructose)와 거의 유사한 감미도를 나타내는 것으로 알려져 있는 육탄당이다.

타가토오스는 설탕의 0.92배의 감미도를 지니며 설탕과 가장 유사한 물리적, 화학적 성질을 지니면서도, 체내에 흡수시 거의 대사되지 않아 열량에 기여를 하지 않는 비칼로리성 감미료(non-caloric sweetener)이다.

실험쥐에 30％의 설탕을 투여시 체중이 20％ 이상 증가하는데 비해 같은 양의 타가토오스 투여시 오히려 체중이 15％ 감소된다는 연구결과가 보고됨에 따라, 타가토오스는 다이어트용 감미료로서 기대받고 있다.

설탕 대체용 감미료로서 이용되는 솔비톨, 자일리톨, 말티톨, 이소말트, 락티톨 등의 당알코올류는 일정량 이상 섭취시 설사를 유발하는 현상인 렉서티브 현 상(laxative effect)이 있는데 비해, 타가토오스는 이러한 부작용을 나타내지 않는다.

또한 타가토오스는 70℃ 이상에서 장시간 노출될 경우 구조가 파괴되어 설탕처럼 갈변화되므로, 식품가공시 적절한 풍미를 더하는 장점이 있다.

따라서 타가토오스는 설탕을 대체하기에 가장 적절한 감미료로 관심을 받고 있으며, 시장 잠재력이 큰 물질로 알려지고 있다(Zehener, 1988. EP 257626; Marzur, 1989, EP 0341062A2).

현재 사용되는 타가토오스의 생산방법에는 발효법, 화학적·생물학적 합성법 및 효소법이 있다.

발효법은 타가토오스를 생산할 수 있는 미생물을 발효시켜 배지중으로 분비되는 타가토오스를 얻는 방법이다. 마이코박테리움(Mycobacterim), 락토바실러스 (Lactobacillus), 엔테로박터(Enterobacter) 등이 갈락토오스를 기질로 하여 타가토오스를 생산하는데 사용된다. 발효법은 환경친화적이라는 장점을 지니고 있으나, 최고 수율은 2.1％, 생산량은 0.02g/ℓ /h로 매우 낮아, 산업화 면에서는 부정적이다.

화학적 합성법은 촉매를 이용한 화학반응이나 생물학적 전환 과정을 통해 기질을 이성화시켜 타가토오스를 얻는 방법이다. 그 대표적인 예로, 화학적 생산방법에 관하여 미국의 바이오스페릭(Biospherics)사와 덴마크의 유가공업체인 MD 사(MDFood Ingredient, Denmark)는 저렴한 가격의 유당(lactose)을 가수분해하여 나온 저가의 갈락토오스를 기질로 하고, 칼슘을 촉매로 사용하여 타가토오스-칼슘 복 합체를 만들어 이성화시킴으로써 타가토오스를 생산하는 방법을 개발하였다. 그러나 이 방법은 수율 측면에서는 우수한 반면, 정제 과정이 매우 까다롭기 때문에 대량 생산시 많은 시간과 노력을 필요로 하며, 강산·강알칼리를 사용하는 반응과정 및 고온·고압 조건의 화학공정을 필요로 하기 때문에 환경 면과 비용면에서 부정적이다.

이들 방법은 경제성이나 생산 수율이 매우 낮고, 특정한 조건에서만 반응이 진행되는 비효율성을 비롯하여 산업폐기물의 유발 등 많은 문제점을 나타내어 타가토오스의 대량생산에는 적합하지 않은 것으로 여겨지고 있다.

효소법은 미생물로부터 타가토오스를 생산할 수 있는 효소를 분리하여 타가토오스를 생산하게 하는 방법으로, 상기 발효법, 합성법에 비해 친환경적이라는 장점이 있다.

효소법의 대표적인 예로, Itoh 등은 타가토오스 에피머화효소(D-tagatose-3-epimerase)를 이용하여 소르보스(L-sorbose)를 기질로 96시간 반응하여 35％의 수율을 얻는 방법을 개시하였으며(Itoh, H., T. Sato, T. Takeuchi, A. R. Khan and K. Izumori. 1995. Preparation of D-sorbose from D-tagatose by immobilized D-tagatose-3-epimerase. J. Ferment. Bioeng 79: 184-187), Izumori 등은 둘시톨 탈수소화효소(ducitol dehydrogeanse)에 의해서 둘시톨이나 갈락티톨로부터 타가토오스를 생산하는 방법을 개시하였다(Izumori, K., T. Miyoshi, S. Tokuda and K. Yamabe. 1984. Production of D-tagatose from ducitol by Arthrobacter globiformis. Appl. Environ. Microbiol. 46: 1055-1057).

그러나, 타가토오스 에피머화효소와 둘시톨 탈수소화효소가 사용하는 기질인 소르보스나 둘시톨은 매우 고가이므로, 산업적인 응용 가치가 거의 없다.

Cheetham 등은 아라비노오스 이성화효소를 이용하여 갈락토오스로부터 타가토오스를 생산하는 방법을 개시하였으며(Cheetham, P.S.J. and A. N. Wootton. 1993. Bioconversion of D-galactose into D-tagatose. Enzyme Microb. Technol. 15: 105), Kim 등은 엔테로박터 아글로머란스(Enterobacter agglomerans)를 이용하는 타가토오스 생산방법을 개시하였다(Kim 등. 1997. Kor.J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 25, 490-494)

상기 방법에서 사용하는 아라비노오스 이성화효소는 저렴한 가격의 갈락토오스를 기질로 사용한다는 장점이 있다.

그러나 아라비노오스 이성화효소는 자연에 존재하는 미생물에서는 매우 소량만이 존재하기 때문에 효소 정제 비용이 많이 들어 경제성이 없다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 아라비노오스 이성화효소를 도입한 재조합 균주가 제조된 바 있으나, 이전에 비해 그다지 큰 수율을 얻지 못하고 있는 실정이다.

또한 아라비노오스 이성화효소를 생산하는 것으로 알려진 균주들은 대부분 저온성·중온성 미생물로, 50℃ 이상의 온도 범위에서는 효소의 안정성이 급격하게 감소되어 대량생산에 적합한 정도의 활성을 나타낼 수 없다.

18∼40℃의 온도 범위에서 활성을 나타내는 저온성·중온성 미생물 유래의 효소에 비해, 내열성 아라비노오스 이성화효소는 50℃ 이상의 온도 범위에서 더 높은 활성을 나타내는 것으로 확인되었으며(대한민국 특허2002-0050067), 반응온도가 증가할수록 타가토오스의 전환율이 증가하는 것으로 알려져 있다(대한민국 특허 2002-0051835).

현재까지 고온에서 안정적으로 높은 수율의 타가토오스 전환률을 나타내는 균주는 소수에 불과하여 산업적으로 이용된 예가 많지 않으며, 더우기 70℃ 이상에서 높은 열안정성을 나타내는 균주의 효소에 대해서는 연구가 극히 부진한 상태이다.

이에 본 발명자들은 고온에서 안정적으로 타가토오스를 생산할 수 있는 균주를 분리하고, 상기 균주로부터 내열성 아라비노오스 이성화효소를 분리한 후, 그와 같은 효소를 적절한 담체에 고정화하여 높은 수율 및 낮은 생산단가로 타가토오스를 생산하는 방법을 발명하였다.

본 발명에서는 고온에서 안정적으로 타가토오스를 생산할 수 있는 신규한 균주와 함께, 그로부터 분리한 내열성 아라비노오스 이성화효소 및 그와 같은 효소를 이용하여 타가토오스를 생산할 수 있는 최적 반응 조건을 제시함으로써, 타가토오스를 높은 수율로 저렴하게 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 내열성 아라비노오스 이성화효소(thermostable L-arabinose isomerase) 활성을 갖는 신규한 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al(Geobacillus thermodenitrificans CBG-Al) 균주를 제공한다.

본 발명의 균주는 70℃에서 2.8 unit/mg 이상의 내열성 아라비노오스 이성화효소 활성을 가짐을 나타낸다.

본 발명에서 효소활성단위 1 unit는 단백질 1 mg당 타가토오스 1 mg을 생산하는 효소량으로 정의한다.

본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al 균주의 분리 과정은 다음과 같다.

우리나라 전국 각지의 극한 고온환경으로부터 토양 시료 또는 폐수를 얻고 영양한천배지에 도말하여 단일 균 집락을 순수분리한다.

각 분리균을 상기 영양배지와 같은 조성의 액체배지에서 배양하여 균체를 얻은 후 파쇄시켜 조효소액을 얻고, 갈락토오스를 기질로 첨가하여 70℃에서 효소반응이 일어나도록 한다.

상기 반응액에 대해 갈락토오스로부터 전환되어 새로 생성된 타가토오스 양을 정량하여 내열성 아라비노오스 이성화효소 활성을 측정한다. 활성측정결과 우수한 내열성 아라비노오스 이성화효소 활성을 나타내는 균주를 선별한다.

본 발명에서 분리한 균주의 미생물학적 특성은 다음과 같다.

본 발명의 균주는 3％ 한천을 포함하는 영양한천배지에서 유백색의 요철이 있는 표면이 거친 형태의 균집락을 형성하며, 45℃ 이상 70℃ 이하의 호기적 조건에서 생육 가능한 고온성 미생물이다.

본 발명의 균주는 그램양성이며, 광학현미경 관찰 결과 외형은 긴 막대모양이며, 운동성이 없고, 세포의 중앙부위에 내생포자를 형성한다.

본 발명에서 분리한 균주의 생화학적 특성은 다음과 같다.

본 발명의 균주는 아라비노오스를 비롯하여 갈락토오스, 셀로바이스, 락토오스 등의 다양한 당을 탄소원으로 사용할 수 있다.

본 발명의 균주는 카탈라제를 함유하며, 카제인 분해능 및 전분 분해능을 지닌다.

본 발명의 균주의 분류학적 위치를 동정하기 위해 16S rRNA의 부분 염기서열(서열번호 1)을 분석하고 상동성을 확인한 결과, 본 발명의 균주는 지오바실러스 더모디니트리피컨스와 97％의 근연관계를 나타내는 것으로 확인된다.

본 발명의 균주는 '지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al'라고 명명하며, 2002년 12월 7일 한국생명공학연구원 유전자원센터에 수탁번호 'KCTC 10399BP'로 기탁된 상태이다.

또한 본 발명은 상기 군주에 의해 생산되는 내열성 아라비노오스 이성화효소를 함유하는 조효소액을 함께 제공한다.

본 발명은 상기 균주에 의해 생산되는 내열성 아라비노오스 이성화효소를 함께 제공한다.

본 발명의 내열성 아라비노오스 이성화효소의 분자량은 56 kDa이고, 등전점은 5.3이며, 최적 효소반응 pH는 pH 8.0이고, 최대 열안정성 온도는 60℃임을 특징으로 한다.

본 발명의 내열성 아라비노오스 이성화효소는 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진다.

MMLSLRPYEFWFVTGSQHLYGEEALKQVEEHSRTIVNELNRDSVFPFPLVFKPIVTTPEEIRNICLEANASEQCAGVVTWMHTFSPAKMWIGGLLELRKPLLHLHTQFNRDIPWDSIDMDFMNLNQSAHGDREYGFIGARMGVARKVVVGHWEDPEVRERLAKWMRTAVAFAESRHLKVARFGDNMREVAVTEGDKVGAQIQFGWSINGYGIGDLVQSIRDVSEQSVNELLDEYAELYDIVPAGRQDGPVRESIREQARIELGLKAFLQDGNFTAFTTTFEDLHGMKQLPGLAVQRLMAEGYGFGGEGDWKTAALVRLMKVMADGKGTSFMEDYTYHFEPGNEMILGAHMLEVCPTIAATRPRIEVHPLSIGGKEDPARLVFDGGEGAAVNASLIDLGHRFRLIVNEVDAVKPEYDMPKLPVARILWKPRPSLRDSAEAWILAGGAHHTCFSFAVTAEQLEDFAEMTGIECVVINEHTSVSSFKNELRWNEVFWRGR

본 발명은 상기 서열번호 2의 아미노산 서열과 95％ 이상의 상동성을 나타내는 내열성 아라비노오스 이성화효소의 변이체(variant)들을 함께 제공한다. 이들 변이체 효소들은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 효소와 유사한 수준의 내열성 아라비노오스 이성화효소 활성을 나타낸다.

본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al 균주는 고온에서도 생육이 가능하고, 70℃의 높은 반응 온도에서도 D-갈락토오스를 기질로 하여 D-타가토오스를 생산하는데 적합한 신규 내열성 아라비노오스 이성화 효소 생산균주로 이용될 수 있다.

본 발명의 균주 및 그에 의해 생산되는 내열성 아라비노오스 이성화효소는 고수율을 필요로 하는 타가토오스의 대량 생산 분야에서 유용하게 이용될 수 있다.

따라서 본 발명은 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al 균주 또는 그로부터 생산되는 효소를 이용하여 갈락토오스로부터 타가토오스를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 타가토오스 생산방법은 본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al 균주의 균체를 직접 이용할 수도 있으며, 필요에 따라 상기 균주의 내열성 아라비노오스 이성화효소를 포함하는 조효소액 또는 상기 효소를 분리하여 타가토오스를 생산할 수도 있다.

본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al 균주의 균체를 직접 이용할 때는, 본 발명의 균주의 배양액을 원심분리하여 얻은 균체를 현탁한 후, 상기의 10％ 갈락토오스 용액을 기질로 하여 고온에서 효소반응이 일어나도록 함으로써 직접 타가토오스를 생산할 수 있다.

또한 다양한 고정화 담체에 본 발명의 균주를 고정하여 갈락토오스로부터 타가토오스를 생산할 수 있으며, 이때 고정화 담체로는 셀룰로오스(cellulose), 덱스트란(dextran), 아가로오스(agarose), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 알긴산 나트륨(sodium alginate) 등이 이용될 수 있고 고정화 방법은 공유결합, 이온결합, 흡착법, 가교법, 포괄법 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 균주로부터 아라비노오스 이성화효소를 포함하는 조효소액을 분리할 때는 영양액체배지(nutrient broth)에서 본 발명의 균주를 하루정도 배양한 후 원심분리하여 균체를 얻고, 상기 균체를 0.1 M 트리스 완충액(pH 8.0)에 현탁시킨 후 초음파 파쇄기로 파쇄하여 조효소액을 얻는다.

본 발명의 균주로부터 아라비노오스 이성화효소를 분리할 때는 30∼70％의 유안침전, 이온교환, 소수성크로마토그래피를 통해 부분정제된 효소를 이용하여 타가토오스를 생산할 수 있으며, 대량생산을 위해 유안침전에 의한 활성부분을 이용하여 직접 갈락토오스로부터 타가토오스를 생산할 수 있다.

상기와 같이 분리한 조효소액 및 효소는 일반적인 타가토오스 생산 방법에 모두 사용할 수 있으며, 수율 및 경제성을 최대화할 수 있도록 효소 고정화에 의한 타가토오스 생산 방법을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명은 아라비노오스 이성화효소의 효소 고정화에 의한 타가토오스의 생산 방법을 함께 제공한다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법은, 알긴산나트륨, 알루미나 또는 실리카 중에서 선택된 한 담체에 아라비노오스 이성화효소를 부착시키고, 글루타알데하이드를 이용하여 가교 처리함으로써 고정화시킴을 특징으로 한다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법은 아라비노오스 이성화효소를 얻는 과정, 아라비노오스 이성화효소를 고정화시키는 과정 및 고정화된 효소와 기질을 반응시켜 타가토오스를 얻는 과정으로 이루어진다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법에서 사용하는 아라비노오스 이성화효소는 모든 종류의 아라비노오스 이성화효소가 될 수 있으며, 예를 들면 본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al 균주를 비롯하여 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus), 대장균(E.coli), 바실러스(Bacillus), 살모넬라(Salmonella), 엔테로박터(Enterobacter), 클레브실라(Klebsiella), 슈도모나스(Pseudomonas), 락토바실러스(Lactobacillus), 자이모노나스(Zymononas), 글루코노박터(Gluconobacter), 라이조비움(Rhizobium), 아세토박터(Acetobacter), 로도박터(Rhodobacter), 아그로박테리움(Agrobacterium) 등의 균주에서 유래한 아라비노오스 이성화효소를 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 타가토오스 생산 방법에서 사용하는 아라비노오스 이성화효소는 유전자 재조합 방법에 의해 얻은 아라비노오스 이성화효소가 될 수 있다.

유전자 재조합 방법에 의해 아라비노오스 이성화효소를 얻기 위해서는, 아라비노오스 이성화효소의 유전자(araA)를 생산하는 균주 중 적절한 하나를 선택하여, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 통해 아라비노오스 이성화효소에 대한 해당 유전자를 얻은 후, 적절한 발현 벡터에 삽입하여 아라비노오스 이성화효소를 포함하는 재조합 벡터를 제조한다. 상기 재조합 벡터로 적절한 대장균을 형질전환시켜 타가토오스 생산균주를 얻은 후, 발효 배지에서 배양하여 아라비노오스 이성화효소를 발현시킨다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법에서 araA 유전자를 클로닝할 때 사용되는 발현 벡터는, pKK223-3를 비롯하여 유전자 재조합에 이용되어 온 벡터라면 모두 사용할 수 있다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법에서 재조합 벡터로 형질전환시킬 수 있는 균주는, JM105를 비롯하여 유전자 재조합에 이용되어 온 균주라면 모두 사용할 수 있다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법에서 아라비노오스 이성화효소를 고정화시키기 위해서는, 재조합 균주로부터 얻은 아라비노오스 이성화효소를 담체에 부착시키고, 글루타알데하이드(glutaraldehyde)를 이용하여 가교 처리한다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법에서, 고정화를 시키기 위한 아라비노오스 이성화효소는 10mg/㎖의 농도가 되도록 하여 사용한다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법에서 담체는 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성해준다. 본 발명의 타가토오스 생산방법에서 사용 가능한 담체는 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 담체 모두 사용할 수 있으며, 바람직하게는 알긴산나트륨(soduim alginate), 알루미나(alumina) 또는 실리카(silica) 중에서 선택된 하나임을 특징으로 한다.

알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 콜로이드성 다당류로, 만누로닉산(β -D-mannuronic acid)과 글루로닉산(α -L-gluronic acid)이 그 조성과 함량면에서 무작위로 베타-1,4 결합을 이루어 형성된 고분자이다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법에서 알긴산나트륨은 1.5∼4.0％ 농도가 되도록 물에 녹여 사용하며, 특히 2.5％의 농도로 사용될 때 최고 수율을 나타낸다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법에서 효소를 고정화할 담체로 알긴산나트륨을 사용하는 경우, 효소액의 1∼2 배 부피의 알긴산나트륨 수용액에 효소액을 첨가한 후, 상기 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 0.2M 칼슘 이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 함으로써, 효소-알지네이트의 결합체를 얻는다.

알루미나(alumina, Al₂O₃)와 실리카(silica, SiO₂)는 우수한 흡착 특성과 이온 교환능을 지닌 다공성 담체로, 모든 종류의 단백질에 대해 흡착력을 가진다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법에서 알루미나와 실리카는 60∼70％ 농도가 되도록 50mM 트리스(Tris-HCl) 완충용액에 녹여 사용한다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법에서 효소를 고정화할 담체로 알루미나 또는 실리카를 사용하는 경우, 효소액의 1∼2 배 부피의 알루미나 또는 실리카 용액에 효소액을 첨가한 후, 상기 혼합액을 3시간 동안 교반시켜 상등액은 버리고 침전된 비드만을 취하여, 효소-알루미나 또는 효소-실리카의 결합체 비드를 얻는다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법에서, 글루타알데하이드는 담체에 결합된 효소를 가교 처리하기 위해 사용되며, 0.2％의 농도로 1시간 동안 처리하는 것이 바람직하다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법에서 고정화된 효소를 이용하여 타가토오스를 얻기 위해서는, 적절한 조건이 조성된 생물 반응기에서 기질과 반응시킨다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법에서, 기질은 갈락토오스(galactose)를 사용하며, 45∼55 ％의 농도가 되도록 pH 7∼8의 트리스 완충 용액(Tris-Cl)에 녹여 제조하는 것이 바람직하다. 기질이 고갈되는 때마다 새로 기질을 공급하기 위해, 일정시간마다 기질 용액을 새 것으로 교환한다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법에서, 생물 반응기의 온도는 55℃∼65 ℃가 되도록 유지하는 것이 바람직하다.

상기와 같은 조건 하에서, 본 발명의 타가토오스 생산방법은 효소의 활성을 장기간 유지하여, 기존의 방법보다 타가토오스 생산량을 현저하게 증가시킨다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법은 미생물로부터 얻은 효소를 이용하므로 환경친화적이며, 간단한 효소 고정화 과정만을 필요로 하고, 타가토오스 생산에 사용되는 다른 기질들에 비해 훨씬 값이 저렴한 갈락토오스를 기질로 사용하면서도, 타가토오스 생산 수율을 이전에 비해 현저하게 증가시키므로, 생산경비를 크게 줄이는 한편 생산 효과를 극대화할 수 있다.

상기 방법으로 대량 생산된 타가토오스는 저칼로리의 식품감미료 및 충전제와 광학적 활성을 갖는 화합물 합성의 중간체 및 세제, 화장품 및 의약품 제제의 첨가제로 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 균주의 생장곡선 및 pH 변화에 따른 내열성 아라비노오스 이성화효소의 활성을 나타낸 도이다.

도 2는 본 발명의 균주의 계통도이다.

도 3은 본 발명의 균주로부터 얻은 조효소액의 내열성 아라비노오스 이성화효소 활성을 고온에서 측정한 결과를 나타낸 도이다.

도 4는 본 발명의 균주로부터 얻은 조효소액을 이용하여 고온에서 타가토오스를 합성한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.

＜실시예 1＞ 본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al 균주의 분리 및 동정

1) 본 발명의 균주의 분리

본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al 균주를 다음과 같이 분리 및 동정하였다.

우리나라 전국 각지의 극한 고온환경 토양, 부식토, 하천, 고온폐수, 두엄, 온천 등지에서 토양 시료 또는 폐수를 멸균 증류수에 현탁하여 채취한 후, 0.5％ 카세인 펩톤, 0.3％ 육즙, 2％ 한천을 포함하는 영양한천배지(pH 7.0)에 도말하여 70℃에서 하룻동안 배양한 후, 형성된 단일 균 집락을 순수분리하였다.

분리균의 내열성 아라비노오스 이성화효소 활성측정을 위해, 상기 영양배지와 같은 조성의 액체배지에서 하루정도 배양한 후 원심분리하여 균체를 얻고 0.1 M 트리스 완충액 (Tris-HCl, pH 8.0)에 현탁시켰다. 초음파 파쇄기를 이용하여 조효소액을 얻은 후, 0.1 M 트리스 완충액 (Tris-HCl, pH 8.0)을 함유하는 10％ (w/v) D-갈락토오스 용액을 기질로 첨가하여 70℃에서 효소반응이 일어나도록 하였다.

상기 반응액에 황산-시스틴-카바졸 용액((황산, 70％ v/v)-시스틴, 0.15g/10ml 증류수-카바졸, 60 mg/50ml-에탄올))을 첨가하여 37℃에서 일정시간 정치시킨 후, 560 nm에서 흡광도를 측정하여 타가토오스 양을 정량하였다. 효소반응에 의해 갈락토오스로부터 전환된 타가토오스의 양은 D-타가토오스 표준물질(MD foods Ingredients amba, Denmark)을 이용하여 얻은 곡선을 정량표준곡선으로 하여 계산하였다(Chaplin, M. F. and J. F. Kennedy. Carbohydrate analysis p 1-6, 1986),

이때 음성 효소활성비교 균주로 타카라사(Takara, Japan)의 아라비노오스 이성화효소(araA) 결손균주인 대장균 MC1061(hsdR, mcrB, araD139, (araABC-leu)7679, lacX74, galU, galK, rpsL, thi)을 이용하였으며, 37℃에서 효소활성을 측정하는 것만을 제외하고는 상기의 과정과 동일하게 실험을 수행하였다.

상기와 같이 효소활성을 측정한 결과, 분리균 중 20여 종으로부터 내열성 아라비노오스 이성화효소 활성이 확인되었으며, 그 중 활성이 가장 높게 나타나는 균주를 선별하여 그 활성을 표 1에 나타내었다.

＜표 1＞

표 1에 나타난 바와 같이, 본 실시예에서 분리한 균주는 높은 내열성 아라비노오스 이성화효소 활성을 나타내었다.

또한 도 1에 나타난 바와 같이 본 발명의 균주는 호기적인 배양조건에서 균체 성장에 비례하여 효소활성이 증가하였으며, 정체기 이후에는 비교적 완만한 효소실활이 확인되었으며, 초기 대수기 이후에 급격한 pH 감소현상이 확인되었다(도 1).

2) 본 발명의 균주의 동정

본 발명의 균주를 다음과 같이 동정하였다.

본 발명의 균주의 집락 형태를 확인하기 위해 상기 1)에서 분리한 균주를 3％ 한천을 포함하는 영양한천배지에 접종하여 70℃에서 10시간 동안 배양하였다. 그 결과 본 발명의 균주는 표면이 거친 유백색의 균 집락을 형성함을 관찰하였다.

본 발명의 균주의 생장가능한 온도 범위를 확인한 결과 45℃ 이상 70℃ 이하 의 호기적 조건에서 생육이 가능하고, 45℃ 이하 또는 75℃ 이상에서는 생육이 불가능한 것으로 나타나 본 발명의 균주가 고온성 미생물임을 확인하였다.

본 발명의 균주의 형태를 현미경으로 관찰한 결과 대수기에서 나타나는 일반적인 형태는 가늘고 긴 막대형으로 관찰되었다. 본 발명의 균주는 편모가 없는 비운동성 균주로 포자형성능을 지니며, 내생포자가 중앙부에 형성됨을 관찰하였다.

본 발명의 균주에 대한 산소 요구 여부를 확인하기 위해 혐기성 조건에서 균생육을 조사한 결과, 24시간 배양 후 균의 성장이 확인되지 않아 본 발명의 균주는 호기성 균주임을 확인하였다.

상기와 같이 확인한 본 발명의 균주의 생물학적·생화학적 특성을 표 2에 정리하여 나타내었다.

＜표 2＞

본 발명의 균주의 정확한 동정을 위하여 한국미생물보존센터(KCCM)에 의뢰하여 16S rRNA의 부분 염기서열을 분석하고(서열번호 1) NCBI의 GenBank database의 BLAST search 프로그램을 이용하여 상동성을 확인한 결과, 본 발명의 균주는 지오바실러스 더모디니트리피컨스와 97％의 근연관계를 나타내는 것으로 확인되어(도 2) '지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al'라는 명칭을 부여하였다.

본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al 균주는 2002년 12월 7일 한국생명공학연구원 유전자원센터에 수탁번호 'KCTC 10399BP'로 기탁되었다.

＜실시예 2＞ 본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al 균주로부터 내열성 아라비노오스 이성화효소 조효소액의 분리 및 활성 측정

본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al 균주로부터 내열성 아라비노오스 이성화효소를 함유하는 조효소액을 분리한 후, 고온인 60℃와 70℃에서 그 활성을 측정하였다.

본 발명의 균주로부터 내열성 아라비노오스 이성화효소를 함유하는 조효소액을 분리하기 위해, 상기 균주를 영양 액체 배지에서 10시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 얻고, 0.1 M 트리스 완충액 (pH 8.0)에 현탁시켰다. 균체 현탁액을 초음파 파쇄기로 파쇄한 후, 4℃에서 15,000 rpm으로 30분간 원심분리하고 상층액만을 분리하여 내열성 아라비노오스 이성화효소를 함유하는 조효소액을 얻었다.

조효소액 내의 내열성 아라비노오스 이성화효소 활성을 측정하기 위해, 상기에서 얻은 조효소액을 최종 단백질 농도가 1mg이 되도록 기질 용액에 첨가하고 60℃와 70℃에서 효소반응이 일어나도록 하였다. 기질 용액은 0.1 M 트리스 완충용액을 함유하는 10％(w/v)의 D-갈락토오스 용액을 사용하였으며, 음성대조군은 상기 실시예에서 사용한 타카라 (Takara, Japan)의 대장균 MC1061 균주를 사용하였다.

효소반응에 의해 갈락토오스로부터 전환된 타가토오스의 양은 상기 실시예와 같은 방법에 의해 측정하고 타가토오스 생산을 위한 효소활성은 1 unit를 단백질 1 mg당 타가토오스 1 mg을 생산하는 효소량으로 정의하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al 균주로부터 분리한 조효소액은 고온인 60℃와 70℃에서 모두 높은 수준의 아라비노오스 이성화효소 활성을 나타내었다. 이러한 정도의 활성은 기존에 공지된 저온성·중온성 균주와 비슷하거나 그 이상의 수준이다.

또한 본 발명의 조효소액은 60℃보다 70℃에서 2.5배 높은 아라비노오스 이성화효소 활성을 나타내어, 온도가 높아질수록 활성이 증가하는 것으로 나타났다.

따라서 본 발명의 균주는 고온에서 안정적으로 D-타가토오스를 생산하는 내열성 아라비노오스 이성화효소를 발현함을 알 수 있다.

＜실시예 3＞ 본 발명의 균주가 생산하는 내열성 아라비노오스 이성화효소의 동정

1) 본 발명의 균주가 생산하는 내열성 아라비노오스 이성화효소의 아미노산 서열 확인

본 발명의 균주가 생산하는 내열성 아라비노오스 이성화효소의 아미노산 서열을 다음과 같이 확인하였다.

본 발명의 균주를 배양하여 WizardTM DNA 정제 키트(Promega)에 의해 게놈 DNA를 분리한 후, 내열성 아라비노오스 이성화효소의 유전자를 증폭할 수 있도록 프라이머를 제작하여 PCR 반응을 수행하였다.

그 결과 얻은 유전자를 pGEM vector(Promega)에 클로닝하여 그 염기서열을 Automatic DNA Sequencer(ABI 377)에 의해 확인한 후, 상기 유전자에 의해 발현되는 아미노산의 서열을 결정하였다.

그 결과, 본 발명의 균주가 생산하는 내열성 아라비노오스 이성화효소는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어짐을 확인하였다.

2) 본 발명의 균주가 생산하는 내열성 아라비노오스 이성화효소의 생화학적 특성 확인

본 발명의 균주가 생산하는 내열성 아라비노오스 이성화효소를 다음과 같이 정제하여 그 생화학적 특성을 동정하였다.

상기 1)에서 얻은 내열성 아라비노오스 이성화효소의 유전자를 pLEX 벡터(Stratagene)에 클로닝한 후, 상기 플라스미드를 이용하여 E. Coli DH5a 의 형질전환균주를 제작하였다.

상기 균주의 배양액에 1mM isoprophy1-β -D- thiogalactopyranoside(IPTG)를 첨가하고 수시간 동안 배양하여 단백질을 유도하였다. 상기 배양액을 원심분리하여 균체를 얻은 후 0.1 M 트리스 완충액 (pH 8.0)에 현탁시켰다. 균체 현탁액을 초음파 파쇄기로 파쇄한 후, 4℃에서 15,000 rpm으로 30분간 원심분리하고 상층액만을 분리하였다.

상기 액을 resource-Q 컬럼, phenyl-suphrose 컬럼 및 mono-Q 컬럼에서 순차적으로 크로마토그래피를 사용하여 본 발명의 내열성 아라비노오스 이성화효소를 정제하였다.

정제된 효소에 대해 분자량, 등전점, pH 의존성 및 열안정성을 통상의 방법에 따라 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 균주가 생산하는 내열성 아라비노오스 이성화효소는 분 자량은 56 kDa이고, 등전점은 5.3이며, 최적 효소반응 pH는 pH 8.0이고, 최대 열안정성이 60℃인 것으로 나타났다.

＜실시예 4＞ 본 발명의 내열성 아라비노오스 이성화효소를 함유하는 조효소액을 이용한 타가토오스의 생산

본 발명의 내열성 아라비노오스 이성화효소를 함유하는 조효소액을 이용하여 다음과 같이 타가토오스를 생산하였다.

상기 실시예 2의 방법에 의해 본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al 균주로부터 내열성 아라비노오스 이성화효소를 함유하는 조효소액을 분리하였다. 상기 조효소액에 0.1 M 트리스 완충용액을 함유하는 10％ (w/v)의 D-갈락토오스 용액을 기질로 첨가하여 60℃와 70℃에서 6시간 동안 효소반응이 일어나도록 한 후, 새로 생성된 D-타가토오스의 양을 정량하였다.

타가토오스 생산을 위한 효소활성은 1unit를 단백질 1 mg당 타가토오스 1 mg을 생산하는 효소량으로 정의하였으며, 6시간 효소전환반응에 의한 타가토오스의 생산성을 관찰하여 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-Al 균주로부터 얻은 조효소액은 60℃와 70℃에서 모두 높은 수준으로 갈락토오스를 타가토오스로 전환하였다.

특히 타가토오스의 생성률은 70℃에서 더욱 증가하였는데, 이러한 결과는 상기 도 3에 나타난 고온에서의 효소활성 증가경향과 일치하는 것이다.

따라서 본 발명의 균주는 고온에서 안정적으로 D-타가토오스를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

＜실시예 5＞ 아라비노오스 이성화효소를 이용한 본 발명의 타가토오스 생산방법 -1

아라비노오스 이성화효소를 이용하는 본 발명의 타가토오스 생산방법에서, 알긴산나트륨의 농도와 기질 교환 횟수를 변화시키면서 타가토오스의 생산량을 확인하기 위해, 다양한 농도의 알긴산나트륨 수용액을 담체로 하여 아라비노오스 이성화효소를 고정화시키고, 고정화된 효소와 기질의 반응시 기질 교환 횟수를 증가시키면서 타가토오스의 생성 수율을 비교하였다.

아라비노오스 이성화효소를 얻기 위한 재조합 균주로, JM105/pTC101 균주(기탁번호 KCTC-0603BP)를 사용하였다. 미생물 생산배지로는 LB를 사용하였고 효소 생산배지로는 글리세롤 10g/ℓ, 펩톤 1g/ℓ, 효모 추출물30 g/ℓ, 이인산칼륨 0.14g/ℓ, 일인산나트륨 1g/ℓ 로 구성된 배지를 사용하였다.

냉동 보관된 JM105/pTC101 균주를 LB 배지 50㎖가 들어있는 250㎖의 플라스크에 접종하여, 600nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕배양기에서 배양하였다. 상기 배양액을 발효 배지 5ℓ 가 들어있는 7ℓ 의 발효조(바이오트론, 한국)에 첨가하여 다시 배양하였다. 600nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때, 1mM ITPG를 첨가하여 효소 생산을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 500 rpm, 통기량은 1.0vvm, 배양 온도는 37℃으로 유지하였다.

효소 생산을 유도한 균체를 4℃, 7000g에서 15분간 원심분리하여 상등액은 버리고, 세포 침전물을 50mM 인산 완충용액에 녹여 세포파쇄기(Microfluidizer)로 파쇄하였다. 파쇄액에 황산암모늄(ammonium sulfate) 침전 및 투석을 수행하여 부분 정제한 후, 상기 정제액을 10mg/㎖의 농도로 맞추어 아라비노오스 이성화효소액으로 사용하였다.

효소를 고정화시키기 위한 담체로 알긴산나트륨을 선택하고, 2.0, 2.5, 3.0％의 알긴산나트륨 수용액을 각각 제조하였다. 상기와 같이 다양한 농도로 제조된 알긴산나트륨 수용액을 각각 10㎖씩 취하여 효소액 10㎖과 각각 혼합한 후, 상기 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 0.2M 칼슘이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 하였다. 상기 효소-담체의 결합체 비드를 0.2％ 글루타알데하이드에서 1시간 동안 처리하여 가교시켰다.

기질 용액은 pH 7.0의 50mM 트리스 완충 용액에 10g/ℓ 의 농도가 되도록 갈락토오스를 녹여 제조한 용액을 사용하였으며, 생물반응기에 기질 용액을 넣은 후 고정화된 효소를 40 U 첨가하여 적절한 온도를 유지시키면서 반응시켰다. 이때 효소 역가 1 U(unit)는 60℃, pH 7에서 1분간 1㎍을 생산할 수 있는 효소량으로 정의하였다. 기질이 고갈될 때마다 새로 기질을 공급하기 위해, 3시간마다 기질 용액을 새 것으로 갈아주었으며, 이를 8회 반복하여 장기간 반응시에도 효소의 활성이 유지되는지를 관찰하였다.

기질을 교환할 때마다, 갈락토오스와 타가토오스의 농도는 슈가 팩 칼럼(Sugar-Pak I column, Millipore)이 장착된 HPLC(Shimadzu C-R6A)의 굴절률 측정기(Refractive Index Detector, Shimadzu RID-6A)를 이용하여 측정하였다. 상기와 같이, 각 조건에서 타가토오스의 생성량을 측정하고 그 결과를 표 3에 나타내었다.

＜표 3＞

표 3에 나타난 바와 같이, 알긴산나트륨 수용액을 담체로 사용하였을 때, 알긴산나트륨의 다양한 농도에서 모두 우수한 수율을 나타냈다. 특히 2.5％ 농도의 알긴산나트륨 수용액을 담체 용액으로 사용하였을 때, 효소의 활성이 가장 잘 유지되었으며, 이는 기존의 화학적 합성법에 비해 100배 가까이 증가한 것이다.

또한 기질 교환 횟수를 매 3시간마다 8회까지 증가시켜도, 타가토오스 생산 능력은 처음에 비해 크게 저하되지 않았다. 특히 2.5％의 알긴산나트륨 수용액에서는 첫번째 기질 사용시와 마지막 기질 사용시에도 거의 동일한 생산량을 나타내고 있다.

따라서 본 발명의 타가토오스 생산 방법에서 알긴산나트륨을 담체로 사용한 경우, 담체의 최적 농도는 2.5％ 전후이며, 기질이 계속하여 공급되는 한 장기간 효소의 활성이 유지된다는 것을 알 수 있다.

＜실시예 6＞ 아라비노오스 이성화효소를 이용한 본 발명의 타가토오스 생산 방법 -2

아라비노오스 이성화효소를 이용하는 본 발명의 타가토오스 생산방법에서, 글루타알데하이드의 농도를 변화시키면서 타가토오스의 생산량을 확인하기 위해, 다양한 농도의 글루타알데하이드로 효소-담체 결합체를 가교시키고, 타가토오스의 생성 수율을 비교하였다.

균 배양과 효소 정제 방법은 실시예 5와 같이 수행하였으며, 2.5％ 알긴산나트륨 10㎖에 10㎖의 효소액(10mg/㎖)을 혼합한 후, 상기 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 0.2 M 칼슘이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 하였다.

상기 효소-담체의 결합체 비드를 0.0％, 0.2％, 0.4％, 0.6％의 글루타알데하이드 용액으로 1시간 동안 처리하여 가교시켰다. 고정화된 효소는 실시예 4과 같은 조건으로 기질과 반응시켰으며, 타가토오스 생성량을 측정하여 그 결과를 표 4에 나타내었다.

＜표 4＞

표 4에 나타난 바와 같이, 0.2∼0.4% 농도 범위의 글루타알데하이드를 처리하였을 때 우수한 수율을 나타냈으며, 특히 0.2%의 농도의 글루타알데하이드를 1시간 동안 처리하였을 때 효소의 활성이 가장 잘 유지되었다.

따라서, 본 발명의 타가토오스 생산 방법에서 효소를 고정화할 때 글루타알데하이드를 처리하는 최적 조건은 0.2%의 농도로 1시간 동안 처리하는 것임을 알 수 있다.

＜실시예 7＞ 아라비노오스 이성화효소를 이용한 본 발명의 타가토오스 생산방법 -3

아라비노오스 이성화효소를 이용하는 본 발명의 타가토오스 생산방법에서, 온도를 변화시키면서 타가토오스의 생산량을 확인하기 위해, 다양한 온도에서 고정화된 효소와 기질을 반응시키고, 타가토오스의 생성 수율을 비교하였다.

균 배양과 효소 정제 방법 및 효소의 고정화 방법은 실시예 6와 같이 수행하였으며, 글루타알데하이드를 0.2%의 농도로 처리하여 가교시켜 고정화하였다.

실시예 5와 같이 기질 용액을 준비하고, 50, 60, 70, 80℃의 온도 하에서 고정화된 효소와 기질을 반응시켰다. 반응시의 다른 조건은 실시예 4과 동일하게 수행하였으며, 타가토오스 생성량을 측정하여 그 결과를 표 5에 나타내었다.

＜표 5＞

표 5에 나타난 바와 같이, 반응 온도를 50∼70℃로 유지하였을 때 우수한 수율을 나타냈으며, 특히 60℃일 때 효소의 활성이 가장 잘 유지되었다.

따라서, 본 발명의 타가토오스 생산 방법에서 고정화된 효소와 기질의 반응시 최적 온도는 55∼65℃ 사이임을 알 수 있다.

＜실시예 8＞ 아라비노오스 이성화효소를 이용한 본 발명의 타가토오스 생산방법 -4

아라비노오스 이성화효소를 이용하는 본 발명의 타가토오스 생산방법에서, pH를 변화시키면서 타가토오스의 생산량을 확인하기 위해, 다양한 pH에서 고정화된 효소와 기질을 반응시키고, 타가토오스의 생성 수율을 비교하였다.

균 배양, 효소 정제 방법 및 효소 고정화는 실시예 7과 같이 수행하였다.

기질 용액 준비시, pH 7, 8, 9가 되도록 50 mM 트리스 완충 용액을 제조하고, pH 10의 경우에는 보릭산(boric acid) 완충용액을 제조하였다. 상기와 같이 다 양한 pH로 제조된 완충 용액에 10g/ℓ 의 농도가 되도록 갈락토오스를 녹여 기질 용액들을 준비하였다.

상기 기질 용액들을 각각 50㎖씩 플라스크에 넣은 후, 고정화된 효소를 첨가하여 60℃의 온도 하에서 3시간마다 기질을 교환해 주면서 반응시켰으며, 이때 사용한 효소량은 40 단위이었다. 각 조건에서 타가토오스의 생성량을 측정하고 그 결과를 표 6에 나타내었다.

＜표 6＞

표 6에 나타난 바와 같이, 다양한 범위의 pH에서 모두 우수한 수율을 나타내었으나, 특히 pH7∼8의 범위에서 효소의 활성이 가장 잘 유지되었다.

따라서, 본 발명의 타가토오스 생산 방법에서 고정화된 효소와 기질의 반응시 최적 pH는 7∼8 의 범위임을 알 수 있다.

＜실시예 9＞ 본 발명의 타가토오스 생산 방법과 기존의 타가토오스 생산방법의 효율성 비교

본 발명의 타가토오스 생산 방법과 기존의 타가토오스 생산 방법의 효율성을 비교하기 위해, 본 발명의 타가토오스 생산 방법대로 효소를 고정화시키는 한편, 그 대조군으로서 고정화되지 않은 효소를 준비하여, 각 경우의 타가토오스의 생성 수율을 비교하였다.

본 발명의 타가토오스 생산 방법을 사용한 경우, 실시예 8와 같이 모든 실험을 수행하였으며, 이때 기질 용액의 pH는 7로 하였다. 기존의 타가토오스 생산 방법을 사용한 경우, 효소를 고정화시키는 단계를 제외하고 모든 과정을 상기와 동일하게 수행하였다. 이때 사용한 효소량은 510U이였으며,각 조건에서 타가토오스의 생성량을 측정하고 그 결과를 표 7에 나타내었다.

＜표 7＞

표 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 고정화된 효소는 유리 효소보다 현저하게 많은 양의 타가토오스를 생성하였다. 즉, 기존의 효소법에 비해 2배 가까이 되는 수율을 나타내었다. 또한 기존의 발효법과 비교할 때, 발효법에서는 장기간 반응에도 불구하고 0.02g/ℓ /h에 그쳤던 데 비해, 본 발명의 타가토오스 생산 방법 은 장기간 반응시 0.43g/ℓ /h의 생산량을 나타내어, 수십 배 높은 타가토오스 생산 효과를 나타냈다.

따라서, 본 발명의 타가토오스 생산 방법은 기존의 방법에 비해 현저하게 우수한 효율로 효소의 활성을 유지시킨다는 것을 알 수 있다.

＜실시예 10＞ 본 발명의 타가토오스 생산 방법에서 생물 반응기를 이용한 타가토오스의 생성 수율 확인

본 발명의 타가토오스 생산 방법에서 생물 반응기를 이용한 타가토오스의 생성 수율을 다음과 같이 확인하였다.

실시예 9과 마찬가지로 고정화된 효소와 기질을 준비한 후, 고정화된 효소에 기질을 첨가하여 부피를 100 ml로 만들었다. 높이와 직경이 각각 100cm, 26cm인 생물반응기(Pharmacia Biotech., XK 26, UK)에 효소와 기질의 혼합액을 충전한 후, 유속 10㎖/h, 60℃의 조건 하에서 반응시켰다. 이때 사용한 효소량은 4500 단위이였으며, 그 결과를 표 8에 나타내었다.

＜표 8＞

표 8에 나타난 바와 같이, 생물 반응기를 이용한 결과, 효소와 기질의 반응은 30일간의 실험기간 내내 안정하였고, 생산성은 24g/ℓ /h, 갈락토오스로부터 타가토오스로의 전환율은 48%, 생산농도는 240g/ℓ 이었다. 이러한 수율은 당류의 대 량 생산에서 매우 우수한 수치이다.

따라서, 본 발명의 타가토오스 생산 방법에서는 생물 반응기를 이용함으로써, 산업 분야에서 타가토오스를 대량 생산할 수 있는 체계를 제공함을 알 수 있다.

＜실시예 11＞ 본 발명의 균주 및 본 발명의 효소 고정화 방법에 의한 타가토오스의 생산

본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-A1 균주에 대해, 본 발명의 효소 고정화 방법을 사용하여 타가토오스를 생산하였다.

상기 실시예 2의 방법에 의해 본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-A1 균주로부터 내열성 아라비노오스 이성화효소를 함유하는 조효소액을 분리하였다.

효소를 고정화시키기 위한 담체로 알긴산나트륨을 선택하고, 2.5%의 알긴산나트륨 수용액을 각각 제조하였다. 상기와 같이 다양한 농도로 제조된 알긴산나트륨 수용액을 각각 10㎖씩 취하여 효소액 10㎖과 각각 혼합한 후, 상기 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 0.2M 칼슘이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 하였다. 상기 효소-담체의 결합체 비드를 0.2% 글루타알데하이드에서 1시간 동안 처리하여 가교시켰다.

갈락토오스와 타가토오스의 농도는 슈가 팩 칼럼(Sugar-Pak I column, Millipore)이 장착된 HPLC(Shimadzu C-R6A)의 굴절률 측정기(Refractive Index Detector, Shimadzu RID-6A)를 이용하여 측정하였다.

기질 용액은 pH 8.0의 50mM 트리스 완충 용액에 100g/ℓ 의 농도가 되도록 갈락토오스를 녹여 제조한 50 ㎖용액을 사용하였으며, 생물반응기에 기질 용액을 넣은 후 고정화된 효소를 10 mg을 첨가하여 온도를 70℃ 유지시키면서 반응시켰다.

대조군은 기존에 아라비노오스 이성화효소를 생산하는 것으로 공지된 대표적 균주인 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus) 유래 효소를 선택하여, 상기와 같은 방법으로 고정화 및 효소반응을 수행하였다.

각 균주의 타가토오스의 생성 수율을 비교하여 결과를 표 9에 나타내었다.

＜표 9＞

표 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-A1 균주로부터 내열성 아라비노오스 이성화 고정화 효소는 지오바실러스 스테아로써모필러스 유래 고정화 효소보다 17% 이상의 많은 양의 타가토오스를 생성하였고 16시간 기준으로 생산속도도 1.8배 증가하였다. 이러한 증가율은 당류의 대량 생산에서 매우 우수한 수치이다.

따라서, 본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-A1 균주로부터 내 열성 아라비노오스 이성화 고정화 효소에 의한 타가토오스 생산방법은 기존의 균주 지오바실러스 스테아로써모필러스 유래 고정화 효소에 비해 우수한 효소의 활성을 지닌다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-A1 균주는 70℃ 이상의 고온에서도 안정적으로 D-타가토오스를 생산할 수 있다.

또한 본 발명의 타가토오스 생산 방법은 환경친화적이고, 단가가 낮은 기질을 사용하며, 효소의 활성을 장기간 유지시킬 수 있으므로, 기존에 비해 매우 경제적으로 타가토오스 생산량을 현저히 증가시킬 수 있다.

따라서 본 발명의 균주, 그에 의해 생산되는 내열성 아라비노오스 이성화효소 및 타가토오스 생산 방법은 타가토오스를 대량 생산해야 하는 산업 분야에 응용되어, 기능성 식품 및 의약품 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

기탁된 미생물 또는 기타 생물학적 물질에 관한 표시

Claims (31)

1. 70℃에서 2.8 unit/mg 이상의 내열성 아라비노오스 이성화효소 활성을 갖는 지오바실러스 더모디니트리피컨스 CBG-A1 (Geobacillus thermodenitrificans CBG-A1) 균주(수탁번호 : KCTC 10399BP)
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4. 제 1항의 균주에 의해 생산되는 내열성 아라비노오스 이성화효소를 함유하는 조효소액
5. 제1항의 균주에 의해 생산되고, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어짐을 특징으로 하는 내열성 아라비노오스 이성화효소

   (서열번호 2)

   
6. 제 5항에 있어서, 분자량은 56 kDa이고, 등전점은 5.3이며, 최적 효소반응 pH는 pH 8.0이고, 최대 열안정성이 60℃임을 특징으로 하는 내열성 아라비노오스 이성화효소
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