KR100464061B1 - 아라비노스 이성화효소의 고정화에 의한 타가토스의 생산방법 - Google Patents

아라비노스 이성화효소의 고정화에 의한 타가토스의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아라비노스 이성화효소의 고정화에 의한 타가토스의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 타가토스 생산 방법은, 알긴산나트륨, 알루미나 또는 실리카 중에서 선택된 한 담체에 아라비노스 이성화효소를 부착시키고, 글루타알데하이드를 이용하여 가교 처리함으로써 고정화시킴을 특징으로 한다. 상기 고정화된 효소는 생물 반응기에서 기질인 갈락토스와 반응하여 타가토스를 생산한다.
본 발명의 타가토스 생산 방법은 환경친화적이고, 단가가 낮은 기질을 사용하며, 효소의 활성을 장기간 유지시킬 수 있으므로, 타가토스를 대량 생산하는데 효율적으로 사용될 수 있다.

Description

아라비노스 이성화효소의 고정화에 의한 타가토스의 생산 방법 {Tagatose production method by immobilization of arabinose isomerase}
본 발명은 아라비노스 이성화효소(arabinose isomerase)의 고정화에 의한 타가토스의 생산 방법에 관한 것이다.
타가토스는 갈락토스의 이성질체로, 감미료의 표준인 설탕과 비교할 때 감미의 강도와 종류에 있어서 거의 유사하다. 그러나 설탕과 달리 체내 흡수시 거의 대사되지 않으므로, 열량 기여도가 매우 낮아 다이어트 식품의 유효 성분으로 유용하게 사용된다. 또한 설탕 대체 감미료로 널리 이용되고 있는 당알코올류는 일정량 이상 섭취시 설사를 유발하는 등의 부작용을 일으키는 반면, 타가토스는 그러한 부작용이 없다. 이와 같은 이유로 타가토스는 설탕 대체 감미료의 선두 주자로서 각광받고 있으므로, 식품 산업 분야에 있어서 타가토스를 효율적으로 대량 생산할 수 있는 방법에 대한 관심이 높아지고 있다(EP 257,626, EP 341,062 A2).
타가토스의 생산에는 발효법, 화학적·생물학적 합성법 및 효소법이 있다.
발효법은 타가토스를 생산할 수 있는 미생물을 발효시켜 배지 중으로 분비되는 타가토스를 얻는 방법이다. 마이코박테리움(Mycobacterim), 락토바실러스(Lactobacillus), 엔테로박터(Enterobacter) 등이 갈락토스를 기질로 하여 타가토스를 생산하는데 사용된다. 발효법은 환경친화적이라는 장점을 지니고 있으나, 최고 수율은 2.1%, 생산량은 0.02 g/ℓ/h로 매우 낮아, 산업화 면에서는 부정적이다.
화학적 합성법은 촉매를 이용한 화학반응이나 생물학적 전환 과정을 통해 기질을 이성화시켜 타가토스를 얻는 방법이다. 그 대표적인 예로, 화학적 생산방법에 관하여 미국의 바이오스페릭(Biospherics)사와 덴마크의 유가공업체인 MD 사(MDFood Ingredient, Denmark)는 저렴한 가격의 유당(lactose)을 가수분해하여 나온 저가의 갈락토스를 기질로 하고, 칼슘을 촉매로 사용하여 타가토스-칼슘 복합체를 만들어 이성화시킴으로써 타가토스를 생산하는 방법을 개발하였다. 그러나 이 방법은 수율 측면에서는 우수한 반면, 정제 과정이 매우 까다롭기 때문에 대량 생산시 많은 시간과 노력을 필요로 하며, 강산·강알칼리를 사용하는 반응과정 및 고온·고압 조건의 화학공정을 필요로 하기 때문에 환경 면과 비용면에서 부정적이다.
효소법은 미생물로부터 타가토스를 생산할 수 있는 효소를 분리하여 타가토스를 생산하게 하는 방법이다. 효소법의 대표적인 예로 타가토스 에피머화효소(D-tagatose-3-epimerase)를 이용하여 소르보스(L-sorbose)를 기질로 96시간 반응하여 35%의 수율을 얻은 경우(Itoh, H., T. Sato, T. Takeuchi, A. R. Khan and K. Izumori. 1995. Preparation of D-sorbose from D-tagatose by immobilized D-tagatose-3-epimerase.J. Ferment. Bioeng. 79: 184-187), 아라비노스 이성화효소를 이용하여 갈락토스로부터 타가토스를 생산한 경우(Cheetham, P. S. J. and A.N. Wootton. 1993. Bioconversion of D-galactose into D-tagatose.Enzyme Microb. Technol.15: 105.), 그리고 둘시톨 탈수소화효소(ducitol dehydrogeanse)에 의해서 둘시톨이나 갈락티톨로부터 타가토스를 생산한 경우가 보고된 바 있다(Izumori, K., T. Miyoshi, S. Tokuda and K. Yamabe. 1984. Production of D-tagatose from ducitol byArthrobacter globiformis. Appl. Environ. Microbiol.46: 1055-1057.).
그러나, 타가토스 에피머화효소와 둘시톨 탈수소화효소가 사용하는 기질인 소르보스나 둘시톨은 매우 고가이므로, 산업적인 응용 가치가 거의 없다.
한편, 아라비노스 이성화효소의 경우 저렴한 가격의 갈락토스를 기질로 사용하나, 자연에 존재하는 미생물에서는 매우 소량만이 존재하기 때문에 효소 정제 비용이 많이 들어 경제성이 없다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 아라비노스 이성화효소를 도입한 재조합 균주가 제조된 바 있으나, 이전에 비해 그다지 큰 수율을 얻지 못하고 있는 실정이다.
이처럼, 종래의 모든 방법은 타가토스의 대량 생산에 적합하지 않은 것으로 나타나, 보다 효율적인 타가토스 생산 방법에 대한 발명이 요구되고 있다.
본 발명에서는 아라비노스 이성화효소를 적절한 담체에 고정화시키는 방법과, 고정화된 효소와 기질의 최적 반응 조건을 제시함으로써, 타가토스를 저렴하게 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 아리비노스 이성화효소의 효소 고정화에 의한 타가토스의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 타가토스 생산 방법은, 알긴산나트륨, 알루미나 또는 실리카 중에서 선택된 한 담체에 아라비노스 이성화효소를 부착시키고, 글루타알데하이드를 이용하여 가교 처리함으로써 고정화시킴을 특징으로 한다.
본 발명의 타가토스 생산 방법은 아라비노스 이성화효소를 얻는 과정, 아라비노스 이성화효소를 고정화시키는 과정 및 고정화된 효소와 기질을 반응시켜 타가토스를 얻는 과정으로 이루어진다.
본 발명의 타가토스 생산 방법에서 아라비노스 이성화효소를 얻기 위해서는, 아라비노스 이성화효소의 유전자(araA)를 생산하는 균주 중 적절한 하나를 선택하여, 유전자를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 통해 얻은 후, 적절한 발현 벡터에 삽입하여 아라비노스 이성화효소를 포함하는 재조합 벡터를 제조한다. 상기 재조합 벡터로 적절한 대장균을 형질전환시켜 타가토스 생산균주를 얻은 후, 발효 배지에서 배양하여 아라비노스 이성화효소를 발현시킨다.
본 발명의 타가토스 생산 방법에서 아라비노스 이성화효소의 유전자는, 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus), 대장균 (E.coli), 바실러스(Bacillus), 살모넬라(Salmonella), 엔테로박터(Enterobacter), 클레브실라(Klebsiella), 슈도모나스(Pseudomonas), 락토바실러스(Lactobacillus), 자이모노나스(Zymononas), 글루코노박터(Gluconobacter), 라이조비움(Rhizobium), 아세토박터(Acetobacter), 로도박터(Rhodobacter), 아그로박테리움(Agrobacterium) 등의균주에서 유래한 araA 유전자를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 지오바실러스 스테아로써모필러스에서 유래한 araA 유전자를 사용한다.
본 발명의 타가토스 생산 방법에서 araA 유전자를 클로닝할 때 사용되는 발현 벡터는, pKK223-3를 비롯하여 유전자 재조합에 이용되어 온 벡터라면 모두 사용할 수 있다.
본 발명의 타가토스 생산 방법에서 재조합 벡터로 형질전환시킬 수 있는 균주는, JM105를 비롯하여 유전자 재조합에 이용되어 온 균주라면 모두 사용할 수 있다.
본 발명의 타가토스 생산 방법에서 아라비노스 이성화효소를 고정화시키기 위해서는, 재조합 균주로부터 얻은 아라비노스 이성화효소를 담체에 부착시키고, 글루타알데하이드(glutaraldehyde)를 이용하여 가교 처리한다.
본 발명의 타가토스 생산 방법에서, 고정화를 시키기 위한 아라비노스 이성화효소는 10㎎/㎖의 농도가 되도록 하여 사용한다.
본 발명의 타가토스 생산 방법에서 담체는 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성해준다. 본 발명의 타가토스 생산방법에서 사용 가능한 담체는 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 담체 모두 사용할 수 있으며, 바람직하게는 알긴산나트륨(soduim alginate), 알루미나(alumina) 또는 실리카(silica) 중에서 선택된 하나임을 특징으로 한다.
알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 콜로이드성 다당류로, 만누로닉산(β-D-mannuronic acid)과 글루로닉산(α-L-gluronic acid)이 그 조성과함량면에서 무작위로 베타-1,4 결합을 이루어 형성된 고분자이다.
본 발명의 타가토스 생산 방법에서 알긴산나트륨은 1.5∼4.0% 농도가 되도록 물에 녹여 사용하며, 특히 2.5%의 농도로 사용될 때 최고 수율을 나타낸다.
본 발명의 타가토스 생산 방법에서 효소를 고정화할 담체로 알긴산나트륨을 사용하는 경우, 효소액의 1∼2 배 부피의 알긴산나트륨 수용액에 효소액을 첨가한 후, 상기 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 0.2M 칼슘 이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 함으로써, 효소-알지네이트의 결합체를 얻는다.
알루미나(alumina, Al2O3)와 실리카(silica, SiO2)는 우수한 흡착 특성과 이온 교환능을 지닌 다공성 담체로, 모든 종류의 단백질에 대해 흡착력을 가진다.
본 발명의 타가토스 생산 방법에서 알루미나와 실리카는 60∼70 % 농도가 되도록 50mM 트리스(Tris-HCl) 완충용액에 녹여 사용한다.
본 발명의 타가토스 생산 방법에서 효소를 고정화할 담체로 알루미나 또는 실리카를 사용하는 경우, 효소액의 1∼2 배 부피의 알루미나 또는 실리카 용액에 효소액을 첨가한 후, 상기 혼합액을 3시간 동안 교반시켜 상등액은 버리고 침전된 비드만을 취하여, 효소-알루미나 또는 효소-실리카의 결합체 비드를 얻는다.
본 발명의 타가토스 생산 방법에서, 글루타알데하이드는 담체에 결합된 효소를 가교 처리하기 위해 사용되며, 0.2%의 농도로 1시간 동안 처리하는 것이 바람직하다.
본 발명의 타가토스 생산 방법에서 고정화된 효소를 이용하여 타가토스를 얻기 위해서는, 적절한 조건이 조성된 생물 반응기에서 기질과 반응시킨다.
본 발명의 타가토스 생산 방법에서, 기질은 갈락토스(galactose)를 사용하며, 45∼55 %의 농도가 되도록 pH 7∼8의 트리스 완충 용액(Tris-Cl)에 녹여 제조하는 것이 바람직하다. 기질이 고갈되는 때마다 새로 기질을 공급하기 위해, 일정시간마다 기질 용액을 새 것으로 교환한다.
본 발명의 타가토스 생산 방법에서, 생물 반응기의 온도는 55℃∼65 ℃가 되도록 유지하는 것이 바람직하다.
상기와 같은 조건 하에서, 본 발명의 타가토스 생산방법은 효소의 활성을 장기간 유지하여, 기존의 방법보다 타가토스 생산량을 현저하게 증가시킨다.
본 발명의 타가토스 생산 방법은 미생물로부터 얻은 효소를 이용하므로 환경친화적이며, 간단한 효소 고정화 과정만을 필요로 하고, 타가토스 생산에 사용되는 다른 기질들에 비해 훨씬 값이 저렴한 갈락토스를 기질로 사용하면서도, 타가토스 생산 수율을 이전에 비해 현저하게 증가시키므로, 생산경비를 크게 줄이는 한편 생산 효과를 극대화할 수 있다.
상기 방법으로 대량 생산된 타가토스는 기능성 식품 및 의약품에 첨가되어 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 실시예에서 본 발명을 더욱 상세히 설명하되, 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 국한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 알긴산나트륨의 농도 변화와 기질 교환 횟수 증가에 따른 타가토스의 생산량 확인
본 발명의 타가토스 생산 방법에서 알긴산나트륨의 농도 변화와 기질 교환 횟수 증가에 따른 타가토스의 생산량을 확인하기 위해, 다양한 농도의 알긴산나트륨 수용액을 담체로 하여 아라비노스 이성화효소를 고정화시키고, 고정화된 효소와 기질의 반응시 기질 교환 횟수를 증가시키면서 타가토스의 생성 수율을 비교하였다.
아라비노스 이성화효소를 얻기 위한 재조합 균주로, JM105/pTC101 균주(기탁번호 KCTC-0603BP)를 사용하였다. 미생물 생산 배지로는 LB를 사용하였고 효소 생산배지로는 글리세롤 10g/ℓ, 펩톤 1g/ℓ, 효모 추출물30 g/ℓ, 이인산칼륨 0.14g/ℓ, 일인산나트륨 1g/ℓ로 구성된 배지를 사용하였다.
냉동 보관된 JM105/pTC101 균주를 LB 배지 50㎖가 들어있는 250㎖의 플라스크에 접종하여, 600㎚에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕배양기에서 배양하였다. 상기 배양액을 발효 배지 5ℓ가 들어있는 7ℓ의 발효조(바이오트론, 한국)에 첨가하여 다시 배양하였다. 600㎚에서의 흡광도가 2.0이 될 때, 1mM ITPG를 첨가하여 효소 생산을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 500 rpm, 통기량은 1.0vvm, 배양 온도는 37℃으로 유지하였다.
효소 생산을 유도한 균체를 4℃, 7000g에서 15분간 원심분리하여 상등액은 버리고, 세포 침전물을 50mM 인산 완충용액에 녹여 세포파쇄기(Microfluidizer)로 파쇄하였다. 파쇄액에 황산암모늄(ammonium sulfate) 침전 및 투석을 수행하여 부분 정제한 후, 상기 정제액을 10㎎/㎖의 농도로 맞추어 아라비노스 이성화효소액으로 사용하였다.
효소를 고정화시키기 위한 담체로 알긴산나트륨을 선택하고, 2.0, 2.5, 3.0%의 알긴산나트륨 수용액을 각각 제조하였다. 상기와 같이 다양한 농도로 제조된 알긴산나트륨 수용액을 각각 10㎖씩 취하여 효소액 10㎖과 각각 혼합한 후, 상기 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 0.2M 칼슘이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 하였다. 상기 효소-담체의 결합체 비드를 0.2% 글루타알데하이드에서 1시간 동안 처리하여 가교시켰다.
기질 용액은 pH 7.0의 50mM 트리스 완충 용액에 10g/ℓ의 농도가 되도록 갈락토스를 녹여 제조한 용액을 사용하였으며, 생물반응기에 기질 용액을 넣은 후 고정화된 효소를 40 U 첨가하여 적절한 온도를 유지시키면서 반응시켰다. 이때 효소 역가 1 U(unit)는 60℃, pH 7에서 1분간 1㎍을 생산할 수 있는 효소량으로 정의하였다. 기질이 고갈될 때마다 새로 기질을 공급하기 위해, 3시간마다 기질 용액을 새 것으로 갈아주었으며, 이를 8회 반복하여 장기간 반응시에도 효소의 활성이 유지되는지를 관찰하였다.
기질을 교환할 때마다, 갈락토스와 타가토스의 농도는 슈가 팩 칼럼(Sugar-Pak I column, Millipore)이 장착된 HPLC(Shimadzu C-R6A)의 굴절률 측정기(Refractive Index Detector, Shimadzu RID-6A)를 이용하여 측정하였다. 상기와 같이, 각 조건에서 타가토스의 생성량을 측정하고 그 결과를 표 1에 나타내었다.
교환횟수 알간산나트륨 농도 (%)
2.0 2.5 3.0
1 5.5 5.8 4.3
2 5.0 5.7 4.0
3 4.8 5.7 4.0
4 4.3 5.8 4.0
5 3.8 5.7 4.0
6 3.7 5.6 4.0
7 3.7 5.7 4.0
8 3.5 5.7 4.0
(단위: g/ℓ)
표 1에 나타난 바와 같이, 알긴산나트륨 수용액을 담체로 사용하였을 때, 알긴산나트륨의 다양한 농도에서 모두 우수한 수율을 나타냈다. 특히 2.5% 농도의 알긴산나트륨 수용액을 담체 용액으로 사용하였을 때, 효소의 활성이 가장 잘 유지되었으며, 이는 기존의 화학적 합성법에 비해 100배 가까이 증가한 것이다.
또한 기질 교환 횟수를 매 3시간마다 8회까지 증가시켜도, 타가토스 생산 능력은 처음에 비해 크게 저하되지 않았다. 특히 2.5%의 알긴산나트륨 수용액에서는 첫번째 기질 사용시와 마지막 기질 사용시에도 거의 동일한 생산량을 나타내고 있다.
따라서 본 발명의 타가토스 생산 방법에서 알긴산나트륨을 담체로 사용한 경우, 담체의 최적 농도는 2.5% 전후이며, 기질이 계속하여 공급되는 한 장기간 효소의 활성이 유지된다는 것을 알 수 있다.
[실시예 2] 글루타알데하이드의 농도 변화에 따른 타가토스 생산량 확인
본 발명의 타가토스 생산 방법에서 글루타알데하이드의 농도 변화에 따른 타가토스의 생산량을 확인하기 위해, 다양한 농도의 글루타알데하이드로 효소-담체결합체를 가교시키고, 타가토스의 생성 수율을 비교하였다.
균 배양과 효소 정제 방법은 실시예 1과 같이 수행하였으며, 2.5% 알긴산나트륨 10㎖에 10㎖의 효소액(10㎎/㎖)을 혼합한 후, 상기 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 0.2 M 칼슘이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 하였다.
상기 효소-담체의 결합체 비드를 0.0%, 0.2%, 0.4%, 0.6%의 글루타알데하이드 용액으로 1시간 동안 처리하여 가교시켰다. 고정화된 효소는 실시예 1과 같은 조건으로 기질과 반응시켰으며, 타가토스 생성량을 측정하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.
교환횟수 글루타알데하이드의 농도(%)
0.0 0.2 0.4 0.6
1 4.5 5.8 4.7 3.5
2 4.5 5.7 4.8 3.3
3 4.3 5.7 4.9 3.4
4 4.0 5.8 4.7 3.4
5 4.1 5.7 4.7 3.5
6 3.7 5.6 4.8 3.5
7 3.5 5.7 4.8 3.6
8 3.2 5.7 4.9 3.6
(단위: g/ℓ)
표 2에 나타난 바와 같이, 0.2∼0.4% 농도 범위의 글루타알데하이드를 처리하였을 때 우수한 수율을 나타냈으며, 특히 0.2%의 농도의 글루타알데하이드를 1시간 동안 처리하였을 때 효소의 활성이 가장 잘 유지되었다.
따라서, 본 발명의 타가토스 생산 방법에서 효소를 고정화할 때 글루타알데하이드를 처리하는 최적 조건은 0.2%의 농도로 1시간 동안 처리하는 것임을 알 수 있다.
[실시예 3] 온도 변화에 따른 타가토스의 생산량 확인
본 발명의 타가토스 생산 방법에서 온도 변화에 따른 타가토스의 생산량을 확인하기 위해, 다양한 온도에서 고정화된 효소와 기질을 반응시키고, 타가토스의 생성 수율을 비교하였다.
균 배양과 효소 정제 방법 및 효소의 고정화 방법은 실시예 2과 같이 수행하였으며, 글루타알데하이드를 0.2%의 농도로 처리하여 가교시켜 고정화하였다.
실시예 1과 같이 기질 용액을 준비하고, 50, 60, 70, 80℃의 온도 하에서 고정화된 효소와 기질을 반응시켰다. 반응시의 다른 조건은 실시예 1과 동일하게 수행하였으며, 타가토스 생성량을 측정하여 그 결과를 표 3에 나타내었다.
교환횟수 반응온도(℃)
50 60 70 80
1 3.5 5.8 5.5 2.8
2 3.5 5.7 5.5 2.8
3 3.5 5.7 5.5 2.8
4 3.5 5.8 5.5 2.7
5 3.5 5.7 5.5 2.5
6 3.6 5.6 5.3 2.3
7 3.5 5.7 5.1 2.1
8 3.5 5.7 4.9 1.7
(단위: g/ℓ)
표 3에 나타난 바와 같이, 반응 온도를 50∼70℃로 유지하였을 때 우수한 수율을 나타냈으며, 특히 60℃일 때 효소의 활성이 가장 잘 유지되었다.
따라서, 본 발명의 타가토스 생산 방법에서 고정화된 효소와 기질의 반응시 최적 온도는 55∼65℃ 사이임을 알 수 있다.
[실시예 4] pH 변화에 따른 타가토스 생산량 확인
본 발명의 타가토스 생산 방법에서 pH 변화에 따른 타가토스의 생산량을 확인하기 위해, 다양한 pH에서 고정화된 효소와 기질을 반응시키고, 타가토스의 생성 수율을 비교하였다.
균 배양, 효소 정제 방법 및 효소 고정화는 실시예 3과 같이 수행하였다.
기질 용액 준비시, pH 7, 8, 9가 되도록 50 mM 트리스 완충 용액을 제조하고, pH 10의 경우에는 보릭산(boric acid) 완충용액을 제조하였다. 상기와 같이 다양한 pH로 제조된 완충 용액에 10 g/ℓ의 농도가 되도록 갈락토스를 녹여 기질 용액들을 준비하였다.
상기 기질 용액들을 각각 50㎖씩 플라스크에 넣은 후, 고정화된 효소를 첨가하여 60℃의 온도 하에서 3시간마다 기질을 교환해 주면서 반응시켰으며, 이때 사용한 효소량은 40 단위이었다. 각 조건에서 타가토스의 생성량을 측정하고 그 결과를 표 4에 나타내었다.
교환횟수 기질 용액의 pH
7 8 9 10
1 5.8 5.9 4.5 4.0
2 5.7 5.9 4.5 3.8
3 5.7 5.9 4.5 4.0
4 5.8 6.0 4.7 3.7
5 5.7 5.9 4.5 3.5
6 5.6 5.8 4.0 3.3
7 5.7 5.8 3.8 3.2
8 5.7 5.9 3.7 3.3
(단위: g/ℓ)
표 3에 나타난 바와 같이, 다양한 범위의 pH에서 모두 우수한 수율을 나타내었으나, 특히 pH 7∼8의 범위에서 효소의 활성이 가장 잘 유지되었다.
따라서, 본 발명의 타가토스 생산 방법에서 고정화된 효소와 기질의 반응시 최적 pH는 7∼8 의 범위임을 알 수 있다.
[실시예 5] 본 발명의 타가토스 생산 방법과 기존의 타가토스 생산 방법의 효율성 비교
본 발명의 타가토스 생산 방법과 기존의 타가토스 생산 방법의 효율성을 비교하기 위해, 본 발명의 타가토스 생산 방법대로 효소를 고정화시키는 한편, 그 대조군으로서 고정화되지 않은 효소를 준비하여, 각 경우의 타가토스의 생성 수율을 비교하였다.
본 발명의 타가토스 생산 방법을 사용한 경우, 실시예 4와 같이 모든 실험을 수행하였으며, 이때 기질 용액의 pH는 7로 하였다. 기존의 타가토스 생산 방법을 사용한 경우, 효소를 고정화시키는 단계를 제외하고 모든 과정을 상기와 동일하게 수행하였다. 이때 사용한 효소량은 510U이였으며,각 조건에서 타가토스의 생성량을 측정하고 그 결과를 표 5에 나타내었다.
효소와 기질의 반응 시간(h) 효소의 종류
본 발명의 고정화된 효소 유리 효소
0 0 0
16 25 31
24 52 37
42 56 39
60 58 39
80 58 38
(단위: g/ℓ)
표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 고정화된 효소는 유리 효소보다 현저하게 많은 양의 타가토스를 생성하였다. 즉, 기존의 효소법에 비해 2배 가까이 되는 수율을 나타내었다. 또한 기존의 발효법과 비교할 때, 발효법에서는 장기간 반응에도 불구하고 0.02g/ℓ/h에 그쳤던 데 비해, 본 발명의 타가토스 생산 방법은 장기간 반응시 0.43g/ℓ/h의 생산량을 나타내어, 수십 배 높은 타가토스 생산 효과를 나타냈다.
따라서, 본 발명의 타가토스 생산 방법은 기존의 방법에 비해 현저하게 우수한 효율로 효소의 활성을 유지시킨다는 것을 알 수 있다.
[실시예 6] 본 발명의 타가토스 생산 방법에서 생물 반응기를 이용한 타가토스의 생성 수율 확인
본 발명의 타가토스 생산 방법에서 생물 반응기를 이용한 타가토스의 생성 수율을 다음과 같이 확인하였다.
실시예 5와 마찬가지로 고정화된 효소와 기질을 준비한 후, 고정화된 효소에 기질을 첨가하여 부피를 100 ml로 만들었다. 높이와 직경이 각각 100cm, 26cm인 생물반응기(Pharmacia Biotech., XK 26, UK)에 효소와 기질의 혼합액을 충전한 후, 유속 10㎖/h, 60℃의 조건 하에서 반응시켰다. 이때 사용한 효소량은 4500 단위이였으며, 그 결과를 표 6에 나타내었다.
경과시간(일) 0.5 1 1.5 2 3 5 10 15 20 25 30
타가토스생성량 55 180 240 241 240 138 242 241 241 241 242
(단위: g/ℓ)
표 6에 나타난 바와 같이, 생물 반응기를 이용한 결과, 효소와 기질의 반응은 30일간의 실험기간 내내 안정하였고, 생산성은 24g/ℓ/h, 갈락토스로부터 타가토스로의 전환율은 48%, 생산농도는 240g/ℓ이었다. 이러한 수율은 당류의 대량 생산에서 매우 우수한 수치이다.
따라서, 본 발명의 타가토스 생산 방법에서는 생물 반응기를 이용함으로써, 산업 분야에서 타가토스를 대량 생산할 수 있는 체계를 제공함을 알 수 있다.
본 발명의 타가토스 생산 방법은 환경친화적이고, 단가가 낮은 기질을 사용하며, 효소의 활성을 장기간 유지시킬 수 있으므로, 기존에 비해 매우 경제적으로 타가토스 생산량을 현저히 증가시킬 수 있다.
본 발명의 타가토스 생산 방법은 타가토스를 대량 생산해야 하는 산업 분야에 응용되어, 기능성 식품 및 의약품 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 아라비노스 이성화효소(arabinose isomerase)를 알긴산나트륨(soduim alginate)에 부착시키고, 글루타알데하이드(glutaraldehyde)로 가교시켜 고정화한 후, 상기 고정화된 효소를 생물반응기에서 기질과 반응시킴을 특징으로 하는 타가토스(tagatose)의 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 아라비노스 이성화효소의 농도는 10㎎/㎖임을 특징으로 하는 타가토스의 제조 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 알긴산나트륨은 1.5∼4.0 % 농도가 되도록 물에 녹여 사용함을 특징으로 하는 타가토스의 제조 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서, 상기 글루타알데하이드를 0.2 %의 농도로 1시간 동안 처리함을 특징으로 하는 타가토스의 제조방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 기질은 갈락토스(galactose)임을 특징으로 하는 타가토스의 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 갈락토스는 45∼55 %의 농도가 되도록 pH 7∼8의 트리스 완충 용액(Tris-Cl)에 녹여 제조한 용액으로 사용함을 특징으로 하는 타가토스의 제조방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 갈락토스와 고정화된 효소를 반응시킬 때의 온도는 55℃∼65 ℃의 범위임을 특징으로 하는 타가토스의 제조방법.
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