CN107400667B - 一种含重组耐高温葡萄糖异构酶细胞的固定化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含重组耐高温葡萄糖异构酶细胞的固定化方法：将含耐高温葡萄糖异构酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH值6.5‑7.5的缓冲液制成菌悬液；向菌悬液中添加硅藻土，搅拌混匀，再加入聚乙烯亚胺室温搅拌絮凝1～2h，然后加入三羟甲基磷，在0～30℃、100r/min搅拌交联1～2h后，抽滤，滤饼粉碎，得到所述含耐高温葡萄糖异构酶固定化细胞颗粒；本发明固定化细胞具有优良热稳定性和重复使用率，于90℃保温72h保持70.1％以上，在85℃条件下连续催化D‑葡萄糖生成D‑果糖的15个批次中，转化率均大于50％，并且催化剂仍保留85.8％以上初始酶活。

Description

一种含重组耐高温葡萄糖异构酶细胞的固定化方法
(一)技术领域
本发明涉及一种固定化细胞的技术与应用，特别涉及一种制备具有高温优良热稳定性的固定化重组耐高温葡萄糖异构酶细胞的方法，以及在高温下异构化D-葡萄糖制备D-果糖的应用。
(二)背景技术
葡萄糖异构酶(glucose isomerase，简称GI，EC 5.3.1.5)，在体外主要用于催化D-葡萄糖异构化生成D-果糖，是工业上利用生物转化法制备高果糖浆的关键酶。
高果糖浆(high fructose corn syrup，简称HFCS)是D-葡萄糖和D-果糖的混合物，是一种重要的甜味剂。根据其D-果糖含量的不同，HFCS可分为HFCS-90、HFCS-42和HFCS-55。1967年和1970年，HFCS-42和HFCS-55先后被引入食品行业，以改善饮料和各种食品的甜度。其中，HFCS-55是主流甜味剂。目前，HFCS工业化生产流程是通过固定化GI生物转化法先制得HFCS-42，将其浓缩至HFCS-90，再经勾兑以制得HFCS-55。(Moeller et al,Journal ofthe American College of Nutrition,28:619-626,2009)。
GI介入的D-葡萄糖异构化过程是热力学平衡反应，在85℃或更高的温度下进行生物转化，所生成的具有高D-果糖浓度的HFCS可有效降低后续富集HFCS-90的成本。目前，很多研究致力于挖掘新型耐高温GI或改造现有酶，以提高其高温热稳定性。其中，较为突出的范例是来自于Thermus oshimai的耐高温GI(ToGI)，在添加20mM Mn2+，于85℃保温48h，仍具有80％以上的初始酶活，该热稳定性优于已报道的耐高温GI催化剂(Jia et al,EnzymeMicrobial Technology,99:1-8,2017；郑裕国等,一种葡萄糖异构酶、基因、载体、工程菌及其应用,专利申请号CN201610999999.4)。
固定化酶(细胞)是通过物理、化学的方法把酶(细胞)固定成具有高活力、水不溶性、颗粒状的固定化制剂，以实现生产的连续化、自动化、低成本化。固定化GI的方法主要有吸附法、交联法、共价结合和包埋法。其中，最为常用是利用戊二醛(GLU)作为交联剂的交联法(Ge et al，Applied Biochemistry and Biotechnology,69:17-29,1998)。但是，对于一些耐高温酶，以GLU交联剂为例，在交联固定后的高温催化条件下，GLU与酶氨基物质形成的C＝N键很容易水解，会导致固定化酶的活力损失严重。因此，为了增强固定化耐高温酶(如ToGI)在高温反应时的热稳定性，需要考察不同交联剂的应用效果。鉴于此背景，为了研制新型的固定化耐高温GI制剂，本发明考察了丁二醛、对苯二醛、戊二醛和三羟甲基磷(THP)对耐高温ToGI的固定化效果，比较了四种固定化酶(细胞)的高温热稳定性，得到的固定化产品在更高温度下拥有更好的热稳定性，可以用于高温下生产HFCS，对于推动HFCS生产工艺的改进具有重要意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种改良的、提高性能(如热稳定性)的、适用于耐高温ToGI重组细胞的固定化方法，以及该固定化催化剂在高温下连续生物催化D-葡萄糖异构化为D-果糖的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种含重组耐高温葡萄糖异构酶(简称重组ToGI)细胞的固定化方法，所述方法：将含葡萄糖异构酶(ToGI)基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH值6.5-7.5的缓冲液制成菌悬液；向菌悬液中添加硅藻土，搅拌混匀，再加入聚乙烯亚胺(PEI)室温搅拌(优选25℃、100r/min)絮凝1～2h，然后加入三羟甲基磷(THP)，在0～30℃(优选20～25℃)、100r/min搅拌交联1～2h后，抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，粉碎成粒(优选粒径为0.5～2mm)，得到所述含耐高温葡萄糖异构酶细胞固定化颗粒；所述硅藻土与菌悬液中湿菌体重量比为0.01～0.1：1。
本发明所述ToGI基因的核苷酸序列和编码蛋白的氨基酸序列分别同专利申请CN201610999999.4中的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述缓冲液为pH 6.5～7.5、50mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，优选pH 7.0，所述缓冲液体积用量以湿菌体湿重计为5～15mL/g。
进一步，所述THP以体积浓度30％水溶液形式加入，体积用量以湿菌体重量计为0.01～0.3mL/g(优选0.05mL/g)。
进一步，所述PEI以体积浓度5％水溶液形式加入，体积用量以湿菌体重量计为0.1～0.7mL/g(优选0.2mL/g)，本发明所述PEI分子量70000，聚合度1600。
本发明所述湿菌体按如下方法制备：将含ToGI的基因工程菌接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，于37℃、150r/min培养10h，获得种子液；随后，将该种子液以体积浓度2-5％的接种量接种到含3L发酵液体培养基(胰蛋白胨15g/L、酵母粉12g/L、NaCl 10g/L、甘油12g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、硫酸铵5g/L、三水合磷酸氢二钾2.3g/L、氯化锰3.8g/L、溶剂为水，pH值自然)的5L发酵罐中，于37℃、500r/min、1.33vvm、罐压0.05Mpa条件下发酵3.5h，发酵过程用氨水和磷酸调节pH为7.0，再将发酵罐温度降低至28℃，加入终浓度10g/L乳糖继续发酵10h，离心收集湿菌体，即为含ToGI基因的湿菌体细胞。
本发明所述硅藻土为
Figure BDA0001383596680000031
545，购自阿拉丁公司。分子式为SiO2，分子量为60.08，中位粒径19.6μm，比重0.32，能吸收大于本身4倍的水；溶于浓碱和氢氟酸，不溶于水、酸或稀碱。
本发明所述含重组耐高温葡萄糖异构酶细胞固定化颗粒在催化D-葡萄糖异构化制备D-果糖中应用方法为：以含重组耐高温葡萄糖异构酶细胞固定化颗粒为催化剂，以D-葡萄糖为底物，以锰盐为助剂，以pH 6.5～7.5、50mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液为反应介质，在200r/min，85℃下进行反应，反应完全后，反应液离心，沉淀用pH 6.5～7.5、50mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液洗涤后重复利用，上清分离纯化，获得D-果糖；所述底物初始浓度为50-500g/L缓冲液(优选200g/L)，催化剂用量为10-50g/L缓冲液(优选40g/L)，锰盐终浓度为5-25mM(优选8mM)。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种改良的固定化耐高温ToGI细胞的方法。经交联剂THP固定的催化剂具有优良热稳定性和重复使用率，于90℃添加8mM锰盐助剂保温72h，仍保持70.1％以上初始酶活，在85℃条件下连续催化D-葡萄糖生成D-果糖的15个批次中，转化率均大于50％，并且催化剂仍保留85.8％以上的初始酶活，该固定化催化剂具备在高温生物催化生产高果糖浆的工业化应用潜力。
(四)附图说明
图1为固定化产品的热稳定性比较的示意图；
图2为固定化产品重复使用批次和残余酶活的示意图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/ToGI的构建与湿菌体的制备
以重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET28b/ToGI为生产菌种，方法为：
(1)构建重组菌
利用蛋白质PDB数据库和NCBI数据库数据对葡萄糖异构酶基因序列进行筛选，得到来源于Thermus oshimai的GI基因(ToGI,GenBank accession no.WP_016329521.1)。根据该葡萄糖异构酶的氨基酸序列，并依据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了该段ToGI的核苷酸序列(同专利申请CN201610999999.4中SEQ ID NO.2所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示)。在核酸序列末端加入6×his-tag标签，两端加入酶切位点Xba I和Xho I，将该基因克隆至pET28b(+)对应的Xba I和Xho I位点，获得重组表达质粒pET28b/ToGI。
获得的重组表达质粒pET28b/ToGI转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度为50μg/mL卡那霉素的琼脂平板上，37℃下培养过夜，第2天于平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得含ToGI基因的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/ToGI。
(2)重组菌发酵和湿菌体制备
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、溶剂为水，pH值自然；LB固体培养基需添加20g/L琼脂。发酵培养基：胰蛋白胨15g/L、酵母粉12g/L、NaCl 10g/L、甘油12g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、硫酸铵5g/L、三水合磷酸氢二钾2.3g/L、氯化锰3.8g/L、溶剂为水，pH值自然。
将步骤(1)制备的E.coli BL21(DE3)/pET28b/ToGI接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，于37℃培养10h，获得种子液；然后将发酵罐于121℃空消20min，待发酵罐罐体冷却后按照发酵培养基配方配制3L发酵培养基，再于121℃实消灭菌20min。将罐体冷却至37℃，接种100mL种子液，于500r/min、1.33vvm、罐压0.05Mpa和37℃条件下发酵3.5h，发酵过程用氨水和磷酸调节pH为7.0。随后，将发酵罐温度降至28℃，加入终浓度为10g/L的乳糖继续发酵10h，离心收集湿菌体，即为含ToGI的湿菌体细胞(简称重组ToGI细胞)。
实施例2：使用不同交联剂固定化耐高温葡萄糖异构酶细胞
(1)以THP为交联剂固定重组ToGI细胞
制备体积浓度30％三羟甲基磷(THP)水溶液：取15g的四羟甲基氯化磷(浓度80％)溶于90mL去离子水，3.4g的氢氧化钾溶于10mL去离子水，室温25℃、100r/min条件下将两者缓慢混合，制得THP水溶液，现用现配，四羟甲基氯化磷和氢氧化钾按摩尔比1:0.995。
将实施例1制备的重组ToGI细胞6g用pH 7.0、50mL磷酸盐(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液悬浮，加入0.3g的硅藻土(
Figure BDA0001383596680000051
545)，适当搅拌。加入2mL 5％(v/v)PEI水溶液在25℃、100r/min条件下絮凝，再加入0.25mL 体积浓度30％THP水溶液，在25℃、100r/min条件下交联反应2h。然后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，粉碎成粒(优选粒径为0.5～2mm)，得含耐高温ToGI的固定化颗粒，为THP固定化细胞。
(2)以丁二醛为交联剂固定重组ToGI细胞
将实施例1制备的重组ToGI细胞6g用pH 7.0、50mL磷酸盐(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液悬浮，加入0.3g的硅藻土(
Figure BDA0001383596680000052
545)，室温下适当搅拌。加入2mL 5％(v/v)PEI水溶液在室温下搅拌絮凝，再加入0.25mL的30％(w/v)丁二醛水溶液，在25℃、100r/min条件下反应2h。然后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，粉碎成粒(优选粒径为0.5～2mm)，得含耐高温ToGI的固定化颗粒，为丁二醛固定化细胞。
(3)以GLU为交联剂固定重组ToGI细胞
将实施例1制备的重组ToGI细胞6g用pH 7.0、50mL磷酸盐(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液悬浮，加入0.3g的硅藻土(
Figure BDA0001383596680000053
545)，室温下适当搅拌。加入2mL 5％(v/v)PEI水溶液在25℃、100r/min条件下絮凝，再加入0.25mL的25％(w/v)GLU(戊二醛)水溶液，室温搅拌交联反应2h。然后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，粉碎成粒(优选粒径为0.5～2mm)，得含耐高温ToGI的固定化颗粒，为GLU固定化细胞。
(4)以对苯二醛为交联剂固定重组ToGI细胞
将实施例1制备的重组ToGI细胞6g用pH 7.0、50mL磷酸盐(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液悬浮，加入0.3g的硅藻土(
Figure BDA0001383596680000054
545)，室温下适当搅拌。加入2mL 5％(v/v)PEI水溶液在室温下搅拌絮凝，再加入0.25mL的30％(w/v)对苯二醛水溶液，在25℃、100r/min条件下反应2h。然后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，粉碎成粒(优选粒径为0.5～2mm)，得含耐高温ToGI的固定化颗粒，为对苯二醛固定化细胞。
实施例3：不同交联剂对重组ToGI细胞固定化效果的比较
GI酶活的测定方法如下。5mL反应体系：pH 7.0、50mM磷酸盐(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液、1mM Co2+、10mM Mg2+、200mM D-葡萄糖、0.25g湿菌体或固定化催化剂(实施例2制备)。反应条件：于85℃、150r/min条件下反应20min，冰浴10min终止反应，8000r/min离心10min，取上清液；采用HPLC检测D-葡萄糖和D-果糖的浓度。酶活定义：85℃和pH 7.0下，每分钟将D-葡萄糖异构化生成1μmol D-果糖所需酶量定义为一个酶活单位(U)。
分析柱为Hypersil NH2柱(250×4.6mm，5μm)(依利特分析仪器有限公司，大连，中国)。Waters 2414示差折光检测器，Waters 1525泵，Waters 717进样器。柱温30℃，流动相80％(v/v)乙腈，流速1.0mL/min，进样量10μL。
从表1的结果可知，经THP交联的ToGI固定化细胞的蛋白结合效率和固定化酶活收率均高于其他固定化细胞。
表1重组葡萄糖异构酶的酶活测定
Figure BDA0001383596680000061
a[(细胞中的蛋白总量-洗脱液中的蛋白总量)/细胞中的蛋白总量]×100。
b(固定化后的总酶活/初始总酶活)×100。
实施例4：不同固定化催化剂的热稳定性比较
使用实施例2制备的不同固定化细胞测定热稳定性。具体操作如下：将3g固定化细胞和5mM Mn2+加入pH7.0、50mM磷酸盐(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液24ml，于90℃保温，每隔6h取少量样品，测定残余酶活，将初始酶活力定义为100％。
由图1可知，孵育72h后，THP固定化细胞仍能保持70.1％的初始酶活，效果均优于其他固定化细胞。原因是THP能与氨基物质形成P-CH2-N键，该键在高温条件下更加稳定，不易水解。
实施例5：THP固定化细胞异构化制备D-果糖的重复使用率
以实施例2中的THP固定化细胞为生物催化剂，以D-葡萄糖为底物，生物转化制备D-果糖。20mL催化体系包括：50mM磷酸盐(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液(pH 7.0)，200g/L D-葡萄糖、8mM Mn2+、40g/L的THP固定化细胞。于85℃、200r/min，异构化2h。然反应液于4℃离心，少量上清液经0.22μm膜过滤后用HPLC检测D-果糖浓度；收集的THP固定化细胞经缓冲液洗涤，少量用于酶活测定，其余催化剂进行下一批转化。
由图2可知，THP固定化细胞生物转化15批次后，仍保持85.8％的初始酶活，15个批次的D-果糖转化率均在50％以上。
实施例6：采用THP为交联剂固定化其他GI
(1)构建重组菌
将嗜热Thermoanaerobacter ethanolicus GI基因(TeGI，同专利申请CN201510349443.6中SEQ ID NO.1所示)与PGEM-T载体进行连接后导入E.coli JM109中，对TEGI/PGEM-T和质粒pET28b-Nit进行双酶切，连接酶连接过夜，将连接产物pET28b/TEGI导入宿主E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/TeGI。
PGEM-T载体连接条件为：10μL连接体系在PCR管中依次加入2×Buffer 5μL、T4连接酶1μL、GI目的基因3μL、PGEM-T载体1μL；振荡器上充分混匀后16℃条件下连接过夜。
双酶切体系：首先对目的基因进行双酶切，60μL双酶切体系在PCR管中依次加入GI目的基因40μL、2×Buffer Tango 12μL、Nco I 1μL、Xho I 1μL、ddH2O 6μL、振荡器上充分混匀；然后对表达载体进行双酶切，60μL双酶切体系在PCR管中依次加入pET28b 40μL、2×Buffer Tango 12μL、Nco I 1μL、Xho I 1μL、ddH2O 6μL，振荡器上充分混匀；分别将其放在37℃，200r/min条件下酶切4-5h。
(2)重组菌发酵和湿菌体制备
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、溶剂为水，pH值自然；LB固体培养基需添加20g/L琼脂。发酵培养基：胰蛋白胨15g/L、酵母粉12g/L、NaCl 10g/L、甘油12g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、硫酸铵5g/L、三水合磷酸氢二钾2.3g/L、氯化锰3.8g/L、溶剂为水，pH值自然。
将步骤(1)制备的E.coli BL21(DE3)/pET28b/TeGI接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，于37℃培养10h，获得种子液；然后将发酵罐于121℃空消20min，待发酵罐罐体冷却后按照发酵培养基配方配制3L发酵培养基，再于121℃实消灭菌20min。将罐体冷却至37℃，接种100mL种子液，于500r/min、1.33vvm、罐压0.05Mpa和37℃条件下发酵3.5h，发酵过程用氨水和磷酸调节pH为7.0。随后，将发酵罐温度降至28℃，加入终浓度为10g/L的乳糖继续发酵10h，离心收集湿菌体，即为含TeGI基因的湿菌体细胞(简称重组TeGI细胞)。
(3)以THP为交联剂固定重组TeGI细胞
制备体积浓度30％三羟甲基磷(THP)水溶液：取15g的四羟甲基氯化磷(浓度80％)溶于90mL去离子水，3.4g的氢氧化钾溶于10mL去离子水，在25℃、100r/min条件下条件下将两者缓慢混合，制得THP水溶液，现用现配，四羟甲基氯化磷和氢氧化钾按摩尔比1:0.995。
将步骤(2)制备的重组TeGI细胞6g用pH 7.0、50mL磷酸盐(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液重悬，加入0.3g的硅藻土(
Figure BDA0001383596680000081
545)，适当搅拌。加入2mL 5％(v/v)PEI水溶液，在25℃、100r/min条件下絮凝，再加入0.25mL体积浓度30％THP水溶液，在25℃、100r/min条件下交联反应2h。然后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，粉碎成粒(优选粒径为0.5～2mm)，得含TeGI的固定化颗粒。
按照上述操作，经THP交联的TeGI固定化细胞的蛋白结合效率和固定化酶活收率均分别为88.3％和39.7％，蛋白结合率高而固定化酶活回收率较低，说明交联过程中大部分TnGI已失活，因此，THP交联剂并非适用于所有GI的固定化。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工业大学
<120> 一种含重组耐高温葡萄糖异构酶细胞的固定化方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 393
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
Met Tyr Glu Pro Lys Pro Glu His Lys Phe Thr Phe Gly Leu Trp Thr
1 5 10 15
Val Gly Asn Val Gly Arg Asp Pro Phe Gly Asp Ala Val Arg Glu Lys
20 25 30
Leu Asp Pro Val Tyr Val Val His Lys Leu Ala Glu Leu Gly Val Tyr
35 40 45
Gly Ile Asn Leu His Asp Glu Asp Leu Ile Pro Arg Gly Thr Pro Pro
50 55 60
Ala Glu Arg Asp Arg Ile Val Arg Arg Phe Arg Lys Ala Leu Glu Glu
65 70 75 80
Thr Gly Leu Lys Val Pro Met Val Thr Ala Asn Leu Phe Ser Asp Pro
85 90 95
Ala Phe Lys Asp Gly Ala Phe Thr Ser Pro Asp Pro Trp Val Arg Ala
100 105 110
Tyr Ala Leu Arg Lys Ser Leu Glu Thr Met Asp Leu Gly Ala Glu Leu
115 120 125
Gly Ala Glu Ile Tyr Val Val Trp Pro Gly Arg Glu Gly Ala Glu Val
130 135 140
Glu Ala Thr Gly Lys Ser Arg Arg Val Trp Gly Trp Val Arg Glu Ala
145 150 155 160
Leu Asn Phe Met Ala Ala Tyr Ala Glu Asp Gln Gly Tyr Gly Tyr Arg
165 170 175
Phe Ala Leu Glu Pro Lys Pro Asn Glu Pro Arg Gly Asp Ile Tyr Phe
180 185 190
Ala Thr Val Gly Ser Phe Leu Ala Phe Ile Tyr Thr Leu Asp Gln Pro
195 200 205
Glu Arg Phe Gly Leu Asn Pro Glu Phe Ala His Glu Thr Met Ala Gly
210 215 220
Leu Asn Phe Val His Ala Val Ala Gln Val Leu Asp Ala Gly Lys Leu
225 230 235 240
Phe His Ile Asp Leu Asn Asp Gln Arg Met Ser Arg Phe Asp Gln Asp
245 250 255
Leu Arg Phe Gly Ser Glu Asn Leu Lys Ala Ala Phe Phe Leu Val Asp
260 265 270
Leu Leu Glu Ser Ser Gly Tyr Gln Gly Pro Arg His Phe Asp Ala His
275 280 285
Ala Leu Arg Thr Glu Asp Glu Glu Gly Val Trp Ala Phe Ala Arg Gly
290 295 300
Cys Met Arg Thr Tyr Leu Ile Phe Lys Glu Lys Ala Gln Ala Phe Arg
305 310 315 320
Glu Asp Pro Glu Val Arg Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Tyr Gly Glu Asp
325 330 335
Pro Gln Ala Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ser Arg Glu Arg Ala Thr
340 345 350
Ala Leu Lys Glu Val Ala Leu Pro Leu Glu Ala Lys Arg Arg Arg Gly
355 360 365
Tyr Ala Leu Glu Arg Leu Asp Gln Leu Val Val Glu His Leu Leu Gly
370 375 380
Val Arg Gly His His His His His His
385 390
<210> 2
<211> 1179
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
atgtacgaac cgaaaccgga acacaaattc accttcggtc tgtggaccgt tggtaacgtt 60
ggtcgtgacc cgttcggtga cgctgttcgt gaaaaactgg acccggttta cgttgttcac 120
aaactggctg aactgggtgt ttacggtatc aacctgcacg acgaagacct gatcccgcgt 180
ggtaccccgc cggctgaacg tgaccgtata gttcgtaggt tccgtaaagc tctcgaagaa 240
accggtctga aagttccgat ggttaccgct aacctgttct ctgacccggc gttcaaagac 300
ggtgcgttca cctctccgga cccgtgggtt cgtgcttacg ctctgcgtaa atctctggaa 360
accatggacc tgggtgctga actgggtgct gaaatctacg ttgtttggcc gggtcgtgaa 420
ggtgctgaag ttgaagctac cggtaaatct cgtcgtgttt ggggttgggt tcgtgaagct 480
ctgaacttca tggctgctta cgctgaagac cagggttacg gttaccgttt cgctctggaa 540
ccgaaaccga acgaaccgcg tggtgacatc tacttcgcta ccgttggttc tttcctggct 600
ttcatctaca ccctcgacca gccagaaagg ttcggtctga acccagaatt cgctcacgaa 660
accatggctg gtctgaactt cgttcacgct gttgctcagg ttctggacgc tggtaaactg 720
ttccacatcg acctgaacga ccagcgtatg tctcgtttcg accaggacct gcgtttcggt 780
tctgaaaacc tgaaagctgc tttcttcctg gttgacctgc tggaatcttc tggttaccag 840
ggtccgcgtc acttcgacgc tcacgctctg cgtaccgaag acgaagaagg tgtttgggct 900
ttcgctcgtg gttgcatgcg tacctacctg atcttcaaag aaaaggcgca ggcgttccgt 960
gaagacccag aagttcgttc tctgctggaa gaatactacg gtgaagaccc gcaggctctg 1020
ggtctgctgg gtccgtactc tcgtgaacgt gctaccgctc tgaaagaagt tgctctgccg 1080
ctggaagcta aacgtcgtcg tggttacgct ctggaacgtc tggaccagct ggttgttgaa 1140
cacctgctgg gtgttcgtgg tcaccaccac caccaccac 1179

Claims (1)

1.一种含重组耐高温葡萄糖异构酶细胞的固定化方法，其特征在于所述方法为：将含耐高温葡萄糖异构酶基因的重组大肠杆菌BL21 (DE3)经发酵培养获得的湿菌体用pH值6.5-7.5的缓冲液制成菌悬液；向菌悬液中添加硅藻土，搅拌混匀，再加入聚乙烯亚胺室温搅拌絮凝1~2 h，然后加入三羟甲基磷，在25oC、100 r/min搅拌交联1~2 h后，抽滤，滤饼室温风干后粉碎成粒，得到所述含耐高温葡萄糖异构酶固定化细胞颗粒；所述硅藻土与菌悬液中湿菌体重量比为0.05：1；所述耐高温葡萄糖异构酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述缓冲液为pH 6.5~7.5、50 mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，所述缓冲液体积用量以湿菌体湿重计为50mL/6g；所述三羟甲基磷以体积浓度30%水溶液形式加入，体积用量以湿菌体重量计为0.25mL/6g；所述聚乙烯亚胺以体积浓度5%水溶液形式加入，体积用量以湿菌体重量计为2 mL/6g；
所述湿菌体按如下方法制备：将含重组耐高温葡萄糖异构酶基因的大肠杆菌BL21(DE3)接种至含100 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，于37oC、150 r/min培养10 h，获得种子液；将种子液以体积浓度2-5%的接种量接种到含3 L发酵培养基的5 L发酵罐中，于37oC、500 r/min、1.33 vvm、罐压0.05 Mpa条件下发酵3.5 h，发酵过程用氨水和磷酸调节pH为7.0，再将发酵罐温度降低至28oC，加入终浓度10 g/L乳糖继续发酵10 h，离心收集湿菌体；所述发酵培养基组成为：胰蛋白胨15 g/L、酵母粉12 g/L、NaCl 10 g/L、甘油12 g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、硫酸铵5 g/L、三水合磷酸氢二钾2.3 g/L、氯化锰3.8 g/L、溶剂为水，pH值自然。
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CN114258909B (zh) * 2021-12-14 2023-09-22 苏州良辰生物医药科技有限公司 一种细胞固定剂及细胞固定方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4355105A (en) * 1981-03-30 1982-10-19 Miles Laboratories, Inc. Glutaraldehyde/polyethylenimine immobilization of whole microbial cells
US4950596A (en) * 1985-03-04 1990-08-21 The Dow Chemical Company Stabilization of intracellular enzymes
CN102206622A (zh) * 2011-04-02 2011-10-05 华南理工大学 以纯棉毛巾为载体的固定化脂肪酶的制备方法
CN104962546A (zh) * 2015-06-19 2015-10-07 浙江工业大学 一种含葡萄糖异构酶细胞的固定化方法
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4355105A (en) * 1981-03-30 1982-10-19 Miles Laboratories, Inc. Glutaraldehyde/polyethylenimine immobilization of whole microbial cells
US4950596A (en) * 1985-03-04 1990-08-21 The Dow Chemical Company Stabilization of intracellular enzymes
CN102206622A (zh) * 2011-04-02 2011-10-05 华南理工大学 以纯棉毛巾为载体的固定化脂肪酶的制备方法
CN104962546A (zh) * 2015-06-19 2015-10-07 浙江工业大学 一种含葡萄糖异构酶细胞的固定化方法
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