CN111440785B - 一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法，所述方法是将含葡萄糖异构酶基因的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体经缓冲液悬浮，制成菌悬液；向菌悬液中添加改性硅藻土，搅拌混匀，加入聚乙烯亚胺，然后再加入戊二醛进行交联，15～35℃搅拌交联0.5～5h后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后，粉碎成粒，得到含葡萄糖异构酶的固定化葡萄糖异构酶制剂；本发明所提供的固定化方法具有固定化材料成本低，操作简单，机械强度高，制备的固定化产葡萄糖异构酶重组大肠杆菌全细胞用于催化D‑葡萄糖生产D‑果糖，在60℃条件下，分批次反应重复使用40批次后，仍具有86％以上的残余酶活力；连续反应603h，时空产率为3.8kg/L/d，平均转化率大于42％，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法。
(二)背景技术
葡萄糖异构酶(Glucose isomerase，GI)，又称木糖异构酶，能将D-葡糖转化成甜度比蔗糖更高的D-果糖，是工业上利用生物转化法生产果葡糖浆(High Fructose CornSyrup，HFCS)的关键酶。HFCS是一种以玉米淀粉为原料，经液化、糖化、连续异构化加工成的D-葡萄糖和D-果糖组成的混合糖糖浆。果葡糖浆作为天然的甜味剂，具有溶解度高、化学和热稳定性好、渗透压大、吸潮性和保湿性强、与其它添加剂混合不影响食品风味等优势，广泛应用于食品、软饮料、医药等行业。
葡萄糖异构酶在适宜的反应条件下，可以表现出较高的异构化性能，但在工业生产中游离酶的活性大幅度降低、稳定性差、不可重复使用、分离困难，大大降低游离酶在实际生产中的应用。为了克服上述游离酶在实际生产中的弊端，可将其固定化，固定化酶(细胞)是通过物理、化学的方法把酶细胞固定成具有高活力、水不溶性、颗粒状的固定化制剂，以实现生产的连续化、自动化、低成本化。
硅藻土的化学成分主要为二氧化硅，作为一种稳定、廉价的天然吸附剂，因其表面具有大量排列有序的孔隙，比表面积较大等物理特性而广泛应用于污水处理，空气净化，生物催化剂的固定化等领域。硅藻土表面具有羟基官能团，其在吸附过程中起到主要吸附作用。为进一步增加硅藻土的吸附性能和稳定性，我们对硅藻土进行改性，通过对其后进行酸洗精制、氧化剂氧化和扩孔等改性处理后，一方面能增加硅藻土表面的含氧基团，提高其亲水性能，另一方面增大硅藻土比表面积和孔容比，提高吸附量。硅藻土经改性后就是增加了其表面官能团的数量或者改变其化学键从而大大增加其吸附能力。
近年来，随着人们对HFCS需求的日益增长促进了HFCS产业的蓬勃发展，每年世界上生产的HFCS就有千万吨，对固定化葡萄糖异构酶制剂的需求很大，而我国的固定化葡萄糖异构酶制剂市场一直被国外公司垄断，造成果葡糖浆的生产成本过高。因此，研究一种成本低、性能优异且可实现工业化生产的固定化方法具有非常重要的现实意义。
(三)发明内容
本发明目的是针对现有技术的不足，提供一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法。
本发明采用的技术方案是：
一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法，所述方法包括：
(1)硅藻土改性：取适量天然硅藻土加入到2～3倍体积的5～6M的盐酸溶液中，充分反应(去除一些金属氧化物杂质)后去离子水洗涤至中性，重新悬浮于H2SO4浓度60～80％(w/w)、HNO3浓度10～20％(w/w)的混合酸中，40～50℃超声处理2～3h(增加硅藻土表面的含氧量)，冷却至室温，抽滤后用去离子水洗涤至中性，得到氧化后的硅藻土加水搅拌制浆，置于马福炉中于500～600℃下焙烧2～3h，然后过滤、干燥、过筛制得到改性硅藻土，干燥储存备用；
(2)异构酶固定化：将含有葡萄糖异构酶的湿菌体用磷酸盐缓冲液悬浮，获得菌悬液；向菌悬液中加入改性硅藻土，在室温、600～700rpm条件下水浴搅拌20～30min；再加入质量浓度3～5％的聚乙烯亚胺水溶液，在室温、600～700rpm条件下水浴搅拌交联0.5～2h；然后加入质量浓度5～10％的戊二醛水溶液，在室温、600～700rpm条件下水浴搅拌交联0.5～2h，抽滤，滤饼用磷酸盐缓冲液清洗1～2次，粉碎，即获得葡萄糖异构酶固定化细胞；所述改性硅藻土与湿菌体质量之比为0.01～0.4:1。
本发明方法联合使用吸附与共价交联技术，可实现含葡萄糖异构酶细胞固定化的高效制备，所得固定化细胞酶活回收率高，稳定性好。
步骤(1)中硅藻土质量与混合酸体积之比为1g：5～10mL。
步骤(2)中聚乙烯亚胺水溶液用量为0.3～0.7mL/g湿菌体。
步骤(2)中戊二醛水溶液用量为0.1～2.0mL/g湿菌体。
具体的，所述含有葡萄糖异构酶的湿菌体，是以SEQ ID NO.1所示葡萄糖异构酶基因构建基因工程菌，再经活化培养、种子培养和发酵培养，于发酵液中获得。
所述基因工程菌构建方法如下：将SEQ ID NO.1所示葡萄糖异构酶基因与PGEM-T载体连接后导入E.coli JM109中，提取连接质粒并与质粒pET28b(+)-Nit进行双酶切后，连接过夜，将连接产物导入宿主E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-TEGI，即所述基因工程菌。
具体的，所述湿菌体由如下方法获得：
(1)将含葡萄糖异构酶基因的基因工程菌接种至含有50μg/mL卡那霉素的斜面培养基，37℃培养12h，获得斜面菌体；所述斜面培养基组成如下：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，20g/L琼脂粉，溶剂为去离子水；
(2)将斜面菌体接种至含有50μg/mL卡那霉素的种子培养基，37℃，150rpm培养8h，获得种子液；所述种子培养基组成如下：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，溶剂为去离子水；
(3)将种子液以体积浓度1％接种量接种至发酵培养基，37℃、150rpm条件下培养至OD600达到0.6～0.8，然后加入终浓度0.1mMIPTG，28℃，150rpm条件下诱导11h，取发酵液离心，收集获得湿菌体；所述发酵培养基组成如下：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，溶剂为去离子水。
葡萄糖异构酶细胞固定化颗粒可用于分批次催化D-葡萄糖异构化制备D-果糖，具体方法为：以含重组葡萄糖异构酶细胞固定化颗粒为催化剂，以D-葡萄糖为底物，以钴盐和镁盐为激活剂，以pH 6.0～7.0、50mM的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液为反应介质，在150rpm、60℃下进行反应，反应完全后抽滤，滤饼用Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液充分洗涤后投入到新的反应体系，进行下一个批次反应，上清分离纯化，获得D-果糖。所述底物初始浓度为50～200g/L(优选100g/L)；催化剂用量为10～40g/L(优选30g/L)；镁盐终浓度为0～40mM(优选10mM)；钴盐终浓度为0～4mM(优选1mM)。
所述重组葡萄糖异构酶细胞固定化颗粒也可用于连续催化D-葡萄糖异构化制备D-果糖，具体方法为：在带有夹套玻璃管的填充床反应器中填充重组葡萄糖异构酶细胞固定化颗粒，将含有10mM镁盐和1mM钴盐的底物溶液通过蠕动泵从下而上泵进填充床反应器，以恒定的流速在60℃条件下连续催化反应制备果葡糖浆。所述填充柱反应器的高径比为7:1～18:1(优选7:1)；生物催化剂填充用量5～15g(优选12.5g)；蠕动泵流速0.2～1.7mL/min(优选0.8mL/min)；底物浓度60～140g/L(优选100g/L)。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种以改性硅藻土作为载体固定化葡萄糖异构酶基因工程菌微生物细胞的方法，所得固定化细胞总酶活回收＞74.1％。以固定化的大肠杆菌E.coli TEGI细胞作为生物催化剂进行分批次果葡糖浆的生物催化制备，底物浓度100g/L，反应2h，产物得率均在45％以上。将固定化细胞回收利用，重复反应40个批次，底物转化率均大于42％，并且催化剂仍保留86％以上的初始酶活。在填充柱反应器连续果葡糖浆的生物制备，底物浓度100g/L，流速为0.8mL/min，连续反应603h，时空产率为3.8kg/L/d，平均转化率大于42％。该固定化催化剂具备生物催化生产果葡糖浆的工业化应用潜力。
(四)附图说明
图1为本发明制备改性硅藻土固定化葡萄糖异构酶工程菌的流程图；
图2为固定化葡萄糖异构酶工程菌的扫描电镜图；
图3为固定化葡萄糖异构酶工程菌重复使用批次和残余活性示意图；
图4为固定化葡萄糖异构酶工程菌填充床连续转化D-果糖得率示意图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：硅藻土改性
取适量天然硅藻土加入到2倍体积的6M的盐酸溶液中，反应2h去除一些金属氧化物杂质，去离子水洗涤至中性后，重新悬浮于H2SO4和HNO3的混合酸(H2SO4浓度72％、HNO3浓度17％)中(混合酸用量为6mL/g硅藻土)，40℃超声处理3h，增加硅藻土表面的含氧量，冷却至室温，抽滤后用去离子水洗涤至中性。在氧化后的硅藻土中加等体积的水搅拌制浆，置于马福炉中于500℃下焙烧3h,然后过滤、干燥、过筛制得到改性硅藻土，干燥储存备用。制得改性硅藻土颗粒大小1.5～4nm，比表面积17.56m2/g，孔容0.092mL/g，孔径18.4nm。
硅藻土改性前后的参数如表1所示。
表1：硅藻土改性前后参数
Figure BDA0002394529280000061
实施例2：重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-TEGI的构建及湿菌体的制备及性能测定
具体方法如下：
(1)重组菌的构建：将嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacter ethanolicus的GI基因TEGI(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)与PGEM-T载体进行连接后导入E.coli JM109中，对TEGI/PGEM-T和质粒pET28b(+)-Nit进行双酶切，连接酶过夜连接，将连接产物pET28b(+)-TEGI导入宿主E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-TEGI。
SEQ ID NO.1序列如下：
atggtagaatacttcaaaaacgttcctcaaatcaaatacgaaggccctaaatctaacaacccttacgctttcaaattctacaaccctgatgaaatcatcgatggcaaacctcttaaagaacatcttcgtttctctgttgcttactggcatacattcacagctaacggcacagatcctttcggcgctcctacaatgcaacgtccttgggatcatttcacagatcctatggatatcgctaaagctcgtgttgaagctgctttcgaacttttcgaaaaacttgatgttcctttcttctgcttccatgatcgtgatatcgctcctgaaggcgaaacacttcgtgaaacaaacaaaaaccttgatacaatcgttgctatgatcaaagattaccttaaaacatctaaaacaaaagttcttttcggcacagctaaccttttctctaaccctcgtttcgttcatggcgctgctmcatcttgcaacgctgatgttttcgcttacgctgctgctcaagttaaaaaagctcttgaaatcacaaaagaacttggcggccaaaactacactttctggggcggccgtgaaggctacgaaacacttcttaacacagatatggaacttgaacttgataaccttgctcgtttccttcacatggctgttgaatacgctaaagaaatcggcttcgaaggccaacttcttatcgaacctaaacctaaagaacctacaaaacatcaatacgatttcgatgctgctaacgtttacgctttccttaaaaaatacgatcttgataaatacttcaaacttaacatcgaagctaaccatgctacacttgctggccatgatttccaacatgaacttcgttacgctcgtatcaacaacatgcttggctctatcgatgctaacatgggcgatatgcttcttggctgggatacagatcaattccctacagatatccgtatgacaacacttgctatgtacgaagttatcaaaatgggcggcttcgataaaggcggccttaacttcgatgctaaagttcgtcgtgcttctttcgaacctgaagatcttttccttggccatatagctggcatggatgcgttcgctaaaggctttgaagttgcttacaaacttgttaaagatggcgttttcgatcgtttcatcgaagaacgttacaaatcttaccgtgaaggcatcggcgctgaaatcgtttctggcaaagctaacttcaaaacacttgaagaatacgctcttaacaaccctaaaatcgaaaacaaatctggcaaacaagaacttcttgaatctatccttaaccaataccttttctctgaactcgagcaccaccaccaccaccactga
PGEM-T载体连接条件为：10μL连接体系在PCR管中依次加入2×Buffer 5μL，T4连接酶1μL，GI目的基因3μL，PGEM-T载体1μL；振荡器上充分混匀后16℃条件下连接过夜。
双酶切体系：首先对目的基因进行双酶切，60μL双酶切体系在PCR管中依次加入GI目的基因40μL，2×Buffer Tango 12μL，NcoⅠ1μL，XhoⅠ1μL，ddH2O 6μL，振荡器上充分混匀；然后对表达载体进行双酶切，60μL双酶切体系在PCR管中依次加入pET28b 40μL，2×BufferTango 12μL，NcoⅠ1μL，XhoⅠ1μL，ddH2O 6μL振荡器上充分混匀；分别将其放在37℃，200rpm条件下酶切4～5h。
(2)湿菌体的制备：将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-TEGI接种至含有50μg/mL卡那霉素的斜面培养基，37℃培养12h，获得斜面菌体；斜面培养基组成为：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，20g/L琼脂粉，溶剂为去离子水；将斜面菌体接种至含有50μg/mL卡那霉素的种子培养基，37℃培养10h，获得种子液；种子培养基组成：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，溶剂为去离子水。
再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养11h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清，去离子水洗涤三次，所得基因工程菌湿细胞于-20℃储存备用；发酵培养基组成：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，溶剂为去离子水。
实施例3：酶固定化
用蒸馏水配制pH 6.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(50mM)，称取1g实施例1方法制备的葡萄糖异构酶基因工程菌湿细胞加入到20mL pH6.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(50mM)，充分搅拌得到20mL菌悬液。准确称取0.2g天然硅藻土和改性硅藻土分别添加到20mL菌悬液进行混合，在室温(25℃)，650rpm条件下，水浴搅拌吸附30min；再加入1mL质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液(按体系总体积的5％添加)，在室温，650rpm条件下，水浴搅拌交联1h，然后加入1mL质量浓度10％戊二醛水溶液(按体系总体积的0.5％添加)，在室温，650rpm条件下，水浴搅拌交联1h，固定化结束；抽滤去上清液，所得滤饼用pH 6.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(50mM)清洗两次，抽滤除去多余水分后，获得含葡萄糖异构酶基因工程菌固定化细胞，置4℃冰箱保存备用。
固定化酶酶活的定义：在60℃、150rpm条件下，以D-葡萄糖为底物催化反应20min，每分钟内催化生成1μmol产物D-果糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
本发明中产物的检测方法：液相色谱柱Hypersil NH2-S(4.6mm×250mm)(依利特分析仪器有限公司，大连，中国)；流动相：75％乙腈；流速1min/mL；柱温30℃；检测器：Agilent 12600示差折光检测器；检测波长：210nm；检测器温度35℃；保留时间：D-果糖：6.7min；D-葡萄糖：7.6min。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：
Figure BDA0002394529280000091
实施例4：
用蒸馏水配制pH 6.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(50mM)，称取2g实施例1方法制备的葡萄糖异构酶基因工程菌湿细胞加入到20mL pH6.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(50mM)，充分搅拌得到20mL菌悬液。准确称取0.2g改性后的硅藻土添加到20mL菌悬液进行混合,在室温(25℃)，650rpm条件下，水浴搅拌吸附30min；再加入0.6mL、0.8mL、1mL、1.2mL、1.4mL质量浓度5％聚乙烯亚胺(PEI)水溶液(按体系总体积的3％、4％、5％、6％、7％添加)，在室温，650rpm条件下，水浴搅拌交联1h，然后加入1mL质量浓度10％戊二醛水溶液(按体系总体积的0.5％添加)，在室温，650rpm条件下，水浴搅拌交联1h，固定化结束；抽滤去上清液，所得滤饼用pH 6.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(50mM)清洗两次，抽滤除去多余水分后，获得含葡萄糖异构酶基因工程菌固定化细胞，置4℃冰箱保存备用。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：
Figure BDA0002394529280000101
实施例5：
用蒸馏水配制pH 6.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(50mM)，称取2g实施例1方法制备的葡萄糖异构酶基因工程菌湿细胞加入到20mL pH6.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(50mM)，充分搅拌得到20mL菌悬液。准确称取0.2g改性后的硅藻土添加到20mL菌悬液进行混合,在室温(25℃)，650rpm条件下，水浴搅拌吸附30min；再加入1mL质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液(按体系总体积的5％添加)，在室温，650rpm条件下，水浴搅拌交联1h，然后加入0.2mL、0.6mL、1mL、1.6mL、2mL、4mL质量浓度10％戊二醛水溶液(按体系总体积的0.1％、0.3％、0.5％、0.8％、1％、2％添加)，在室温，650rpm条件下，水浴搅拌交联1h，固定化结束；抽滤去上清液，所得滤饼用pH 6.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(50mM)清洗两次，抽滤除去多余水分后，获得含葡萄糖异构酶基因工程菌固定化细胞，置4℃冰箱保存备用。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：
Figure BDA0002394529280000111
实施例6：
用蒸馏水配制pH 6.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(50mM)，称取50g实施例1方法制备的葡萄糖异构酶基因工程菌湿细胞加入到pH 6.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(50mM)中至总体积500mL，充分搅拌得到500mL菌悬液。准确称取5g改性后的硅藻土添加到500mL菌悬液进行混合,在室温(25℃)，650rpm条件下,水浴搅拌吸附30min；再加入25mL质量浓度5％聚乙烯亚胺水溶液(按体系总体积的5％添加)，在室温，650rpm条件下，水浴搅拌交联1h，然后加入25mL质量浓度10％戊二醛水溶液(按体系总体积的0.5％添加)，在室温，650rpm条件下，水浴搅拌交联1.5h，固定化结束；抽滤去上清液，所得滤饼用pH 6.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(50mM)清洗两次，抽滤除去多余水分后，获得含葡萄糖异构酶基因工程菌固定化细胞，置4℃冰箱保存备用。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：在60℃下，转化率为47.5％，酶活回收率为74.1％。
实施例7：
用去离子水配制pH 6.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(50mM)10mL，加入实施例4制备的固定化葡萄糖异构酶基因工程菌细胞0.3g，D-葡萄糖50g/L、75g/L、100g/L、125g/L、150g/L、200g/L，镁盐和钴盐终浓度10mM和1mM，在60℃，400rpm条件下进行转化反应2h。样品置于冰上5min终止反应。
根据上述方法，所测得固定化细胞催化性能如下：
Figure BDA0002394529280000121
实施例8：
用蒸馏水配制pH 6.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(50mM)10mL，加入实施例4制备的固定化葡萄糖异构酶基因工程菌细胞0.3g，D-葡萄糖1g，镁盐浓度10mM，钴盐浓度0、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM，在60℃，400rpm条件下进行转化反应2h。样品置于冰上5min终止反应。
根据上述方法，所测得固定化细胞催化性能如下：
Figure BDA0002394529280000131
实施例9：
用蒸馏水配制pH 6.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(50mM)100mL，分别加入实施例4制备的固定化葡萄糖异构酶基因工程菌细胞3g，D-葡萄糖10g，镁盐和钴盐终浓度10mM和1mM，在60℃，400rpm条件下进行转化反应2h，反应结束后固定化葡萄糖异构酶基因工程菌细胞经抽滤，洗涤后投入到新的反应体系进行下一批次的转化反应。反应结束后测不同使用批次的残余酶活与转化率，第40批的活性与第1批活性之比即为重复使用40批后的残留酶活。
根据上述方法，测得固定化细胞催化性能如下：在60℃下，初始酶活为151.6U/g初始转化率为47.5％，在60℃下,重复使用40批后，残留酶活86.2％，转化率42.1％。
实施例10：
在径高比为7:1的填充床反应器中填充12.5g实施例4中的固定化葡萄糖异构酶基因工程菌细胞，通过加套管保温60℃。用pH 6.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(50mM)配置葡萄糖溶液终浓度100g/L，并含有10mM的镁盐和1mM的钴盐，通过蠕动泵以0.2mL/min、0.5mL/min、0.8mL/min、1.1mL/min、1.4mL/min、1.7mL/min的恒定流速，从反应器底部进入与固定化酶制剂反应，顶部流出反应液取样检测果糖浓度。
根据上述方法，在60℃下，连续反应8h所测得固定化细胞催化性能如下：
Figure BDA0002394529280000141
实施例11：
在径高比为7:1的填充床反应器中填充12.5g实施例4中的固定化葡萄糖异构酶基因工程菌细胞，通过加套管保温60℃。用pH 6.5的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液(50mM)配置葡萄糖溶液终浓度100g/L，并含有10mM的镁盐和1mM的钴盐，通过蠕动泵以0.8mL/min的恒定流速，从反应器底部进入与固定化酶制剂反应，顶部流出反应液取样检测果糖浓度。
根据上述方法，所测得固定化细胞催化性能如下：在60℃下，初始转化率为48.4％，连续反应603h，时空产率为3.8kg/L/d，平均转化率大于42％。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1344
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atggtagaat acttcaaaaa cgttcctcaa atcaaatacg aaggccctaa atctaacaac 60
ccttacgctt tcaaattcta caaccctgat gaaatcatcg atggcaaacc tcttaaagaa 120
catcttcgtt tctctgttgc ttactggcat acattcacag ctaacggcac agatcctttc 180
ggcgctccta caatgcaacg tccttgggat catttcacag atcctatgga tatcgctaaa 240
gctcgtgttg aagctgcttt cgaacttttc gaaaaacttg atgttccttt cttctgcttc 300
catgatcgtg atatcgctcc tgaaggcgaa acacttcgtg aaacaaacaa aaaccttgat 360
acaatcgttg ctatgatcaa agattacctt aaaacatcta aaacaaaagt tcttttcggc 420
acagctaacc ttttctctaa ccctcgtttc gttcatggcg ctgctmcatc ttgcaacgct 480
gatgttttcg cttacgctgc tgctcaagtt aaaaaagctc ttgaaatcac aaaagaactt 540
ggcggccaaa actacacttt ctggggcggc cgtgaaggct acgaaacact tcttaacaca 600
gatatggaac ttgaacttga taaccttgct cgtttccttc acatggctgt tgaatacgct 660
aaagaaatcg gcttcgaagg ccaacttctt atcgaaccta aacctaaaga acctacaaaa 720
catcaatacg atttcgatgc tgctaacgtt tacgctttcc ttaaaaaata cgatcttgat 780
aaatacttca aacttaacat cgaagctaac catgctacac ttgctggcca tgatttccaa 840
catgaacttc gttacgctcg tatcaacaac atgcttggct ctatcgatgc taacatgggc 900
gatatgcttc ttggctggga tacagatcaa ttccctacag atatccgtat gacaacactt 960
gctatgtacg aagttatcaa aatgggcggc ttcgataaag gcggccttaa cttcgatgct 1020
aaagttcgtc gtgcttcttt cgaacctgaa gatcttttcc ttggccatat agctggcatg 1080
gatgcgttcg ctaaaggctt tgaagttgct tacaaacttg ttaaagatgg cgttttcgat 1140
cgtttcatcg aagaacgtta caaatcttac cgtgaaggca tcggcgctga aatcgtttct 1200
ggcaaagcta acttcaaaac acttgaagaa tacgctctta acaaccctaa aatcgaaaac 1260
aaatctggca aacaagaact tcttgaatct atccttaacc aatacctttt ctctgaactc 1320
gagcaccacc accaccacca ctga 1344

Claims (2)

1.一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法，所述方法包括：
（1）硅藻土改性：取适量天然硅藻土加入到2倍体积的6 M的盐酸溶液中，充分反应后用去离子水洗涤至中性，重新悬浮于H2SO4浓度为72%、HNO3浓度为17%的混合酸中，40 ℃超声处理3 h，冷却至室温，抽滤后用去离子水洗涤至中性，得到氧化后的硅藻土，在氧化后的硅藻土中加水搅拌制浆，置于马福炉中于500 ℃下焙烧3 h，然后过滤、干燥、过筛制得改性硅藻土，干燥储存备用；所述硅藻土的质量与混合酸的体积之比为1g：6mL；
（2） 异构酶固定化：将含有葡萄糖异构酶的湿菌体用磷酸盐缓冲液悬浮，获得菌悬液；向菌悬液中加入改性硅藻土，在室温、650 rpm条件下水浴搅拌30 min；再加入质量浓度5%的聚乙烯亚胺水溶液，在室温、650 rpm条件下水浴搅拌交联1 h；然后加入质量浓度10%的戊二醛水溶液，在室温、650 rpm条件下水浴搅拌交联1 h，抽滤，滤饼用磷酸盐缓冲液清洗1~2次，粉碎，即获得葡萄糖异构酶固定化细胞；所述改性硅藻土与湿菌体质量之比为0.1~0.2:1；聚乙烯亚胺水溶液用量为0.3~0.7 mL/g湿菌体；戊二醛水溶液用量为0.1~2.0 mL/g湿菌体；
所述含有葡萄糖异构酶的湿菌体，是以SEQ ID NO.1所示葡萄糖异构酶基因构建基因工程菌，再经活化培养、种子培养和发酵培养，于发酵液中获得；
所述基因工程菌的构建方法如下：将SEQ ID NO.1所示葡萄糖异构酶基因与PGEM-T载体连接后导入E.coli JM109中，提取连接质粒并与质粒pET28b(+)-Nit进行双酶切后，连接过夜，将连接产物导入宿主E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-TEGI，即所述基因工程菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述湿菌体由如下方法获得：
（1）将所述基因工程菌接种至含有50 μg/mL卡那霉素的斜面培养基，37 ℃培养12 h，获得斜面菌体；所述斜面培养基组成如下：10 g/L蛋白胨，10 g/L氯化钠，5 g/L酵母粉，20g/L琼脂粉，溶剂为去离子水；
（2）将斜面菌体接种至含有50 μg/mL卡那霉素的种子培养基，37 ℃，150 rpm培养10h，获得种子液；所述种子培养基组成如下：10 g/L蛋白胨，10 g/L氯化钠，5 g/L酵母粉，溶剂为去离子水；
（3）将种子液以体积浓度1 %接种量接种至发酵培养基，37 ℃、150 rpm条件下培养至OD600 达到0.6~0.8，然后加入终浓度0.1 mM IPTG，28℃，150 rpm条件下诱导11 h，取发酵液离心，收集获得湿菌体；所述发酵培养基组成如下：10 g/L蛋白胨，10 g/L氯化钠，5 g/L酵母粉，溶剂为去离子水。
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