CN115992051A - 一种戊二醛交联有机硅细胞涂层的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种戊二醛交联有机硅细胞涂层的制备方法，该方法以戊二醛(GA)为交联剂，将其加入具有有机硅涂层的菌悬液中，所述的有机硅涂层是含有氧化硅颗粒的有机硅层，通过稳定的化学键将具有有机硅涂层的菌体交联，交联反应后得到GA交联的有机硅细胞涂层，最终得到在保护菌体结构不被破坏、提高菌体本身及胞内蛋白的稳定性上优于有机硅涂层的菌体。制备过程中，在有机硅细胞涂层中仅加入少量的GA，并通过改变制备过程中GA的浓度、反应时间和反应温度可调控GA交联有机硅涂层的交联程度，进而获得不同稳定性的细胞。本发明制备原料廉价、易得，制备工艺简单易行，适用于大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于细胞涂层制备及应用，尤其涉及一种戊二醛交联有机硅细胞涂层的制备方法及应用。
背景技术
合成生物学作为一个新兴领域，将工程学的概念引入到生命科学中，对生物系统和有机体进行设计，用于调整现有的生物系统或者构建自然界中不存在的生物系统。合成生物学一词出现于20世纪初，直至今日合成生物学仍然处于高速发展的初期。细胞改造在合成生物学的研究中是非常重要的环节，自然界中，所有的细胞行为都直接或者间接地由细胞表面和外部环境的界面进行控制或调节。在细胞表面涂层可以为细胞提供一些自然状态下无法实现的功能，增强细胞在不利条件下的抗性、控制细胞活性和新陈代谢，扩大细胞在细胞催化、生物传感、细胞治疗、可持续能源等方面的应用。
基于有机硅制备细胞涂层的方法(CN 202110455041X)是通过3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)与菌体表面的活性基团反应及其自身的缩聚，在菌体表面形成一层有机硅，有机硅涂层能有效保护菌体结构不被破坏，提高菌体及胞内蛋白的稳定性。通过优化发现，在加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)前加入正硅酸乙酯(TEOS)，结合3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)对正硅酸乙酯(TEOS)水解生成的氧化硅颗粒的修饰作用，使菌体表面的有机硅涂层中增加了氧化硅颗粒，使有机硅涂层维持细胞及其胞内蛋白稳定性的能力更加显著。但实验现象表明，虽然有机硅涂层可以提高菌体及胞内蛋白的稳定性，但有机硅涂层机械强度较差，多次使用后涂层存在脱落和降解现象，使菌体及胞内蛋白的稳定性变差，限制了其在大规模细胞涂层中的应用。
发明内容
与有机硅细胞涂层相比，本发明的目的在于提供一种戊二醛交联有机硅细胞涂层的制备方法。本发明提供的戊二醛交联有机硅细胞涂层的制备方法，在加入少量廉价的戊二醛后即可显著提高细胞及胞内蛋白的稳定性。本发明制备原料廉价、易得，制备工艺简单易行，适用于工业生产。
为了解决上述技术问题，本发明提出的一种戊二醛交联有机硅细胞涂层的制备方法，是以戊二醛(GA)为交联剂，将其加入具有有机硅涂层的菌悬液中，所述的有机硅涂层是含有氧化硅颗粒的有机硅层，交联反应后得到戊二醛交联有机硅细胞涂层。
进一步讲，本发明所述的戊二醛交联有机硅细胞涂层的制备方法，其中，所述的菌悬液为革兰氏阳性菌菌悬液或革兰氏阴性菌菌悬液，在工业化生产中枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的应用领域和实际使用情况相对其他菌种更高，本发明优选枯草芽孢杆菌作为革兰氏阳性菌代表菌种，优选大肠杆菌作为革兰氏阴性菌的代表菌种。
所述的戊二醛交联有机硅细胞涂层的制备方法的具体步骤是：
步骤一、将戊二醛加入具有有机硅涂层的菌悬液中，戊二醛的终浓度为0.05％-0.3％；将含有戊二醛的具有有机硅涂层的菌悬液置于温度为4℃-37℃的摇床摇晃时间为20min-180min，得到戊二醛交联有机硅细胞涂层的混合溶液。
步骤二、将所述的戊二醛交联有机硅细胞涂层的混合溶液进行离心，除去上清液，用去离子水离心水洗，最终在菌体表面得到戊二醛交联有机硅细胞涂层。
本发明提出的戊二醛交联有机硅细胞涂层的制备方法的优点是：制备原料廉价、易得，制备条件温和，制备工艺简单易行，在有机硅细胞涂层中仅加入少量的戊二醛(GA)，通过改变制备过程中戊二醛(GA)的浓度、反应时间和反应温度，可调控戊二醛交联有机硅涂层的交联程度，进而获得不同稳定性的细胞。
本发明所制备的细胞@有机硅@戊二醛稳定性显著提升，与现有技术中未经戊二醛与菌体交联的具有有机硅涂层的细胞相比，本发明所述的制备方法制备得到的戊二醛交联有机硅细胞涂层用于维持细胞及其胞内蛋白在外界不利环境(如高温)下活性的效果更加显著。在50-75℃条件下，与未经戊二醛与菌体交联的有机硅细胞涂层相比，半衰期显著延长。50℃半衰期延长95.82-256.24倍，60℃延长105.74-180.48倍，75℃延长15.97-46.04倍。在细胞催化过程中，该戊二醛交联有机硅细胞涂层与有机硅细胞涂层相比提高细胞的稳定性和细胞的回用性效果更加显著，枯草芽孢杆菌在循环使用55次后酶的活性为初始活性的41.18％，大肠杆菌在循环使用45次后酶的活性为初始活性的40.82％。
附图说明
图1为对比例1、实施例1循环使用后剩余活性图。
图2为对比例2、实施例7循环使用后剩余活性图。
具体实施方式
本发明提出的一种戊二醛交联有机硅细胞涂层的制备方法，设计思路是：在具有有机硅涂层的细胞中加入化学活性高的交联剂戊二醛(GA)，使有机硅交联，得到涂层结构更加致密、机械稳定性更高的涂层，使GA交联有机硅涂层维持细胞及其胞内蛋白稳定性的能力更加显著。
本发明所述有机硅细胞涂层的制备方法的基本方案是：首先，向具有有机硅细胞涂层的菌悬液中加入GA，摇晃反应；然后，将得到的菌悬液离心，除去上清液，用去离子水离心水洗，所得即为细胞@有机硅@戊二醛。
下面结合附图和对比例及具体实施例对本发明技术方案作进一步详细描述，所描述的具体实施例仅对本发明进行解释说明，并不用以限制本发明。
对比例1
具有催化活性的表面涂覆有机硅涂层的枯草芽孢杆菌(酶@枯草芽孢杆菌@有机硅)的制备
步骤一、制备具有有机硅涂层的枯草芽孢杆菌菌悬液(枯草芽孢杆菌@有机硅)：
向浓度为100 OD600的枯草芽孢杆菌菌悬液中加入体积为671.7μl的正硅酸乙酯(TEOS)，使正硅酸乙酯(TEOS)的终浓度为150mM，置于120r min-1 30℃水浴摇床反应20min；
然后向该菌悬液中加入体积为164.7μl的3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)，使3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)的终浓度为35.15mM，将含有3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)的枯草芽孢杆菌菌悬液置于120r min-1 30℃水浴摇床反应160min；离心，除去上清液，用去离子水离心水洗，最终得到枯草芽孢杆菌@有机硅。
步骤二、将步骤一得到的枯草芽孢杆菌@有机硅置于120r min-1 70℃水浴摇床反应30min，得到具有催化活性的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅。
将对比例1获得的具有催化活性的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅分别在50℃、60℃、75℃下孵育，取出孵育后的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅，加入底物淀粉进行催化反应，通过高效液相色谱检测产物塔格糖的含量。通过公式
计算出酶的半衰期，其中Et为特定温度孵育后酶的剩余活性，E0为特定温度孵育前酶的初始活性，Kd为特定温度的热失活常数，t为孵育时间。酶的活性以胞内蛋白催化底物淀粉生产塔格糖的活性计算。胞内酶的半衰期为胞内酶活性剩余50％时的孵育时间。
经过计算，对比例1制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅涂层在50℃的半衰期为225.42min；60℃的半衰期为149.34min；75℃的半衰期为37.32min；如图1所示，在循环使用20次后酶的活性为初始活性的51.39％。
实施例1
具有催化活性的表面涂覆戊二醛交联有机硅涂层的枯草芽孢杆菌(酶@枯草芽孢杆菌@有机硅@戊二醛)的制备
步骤一、制备含有戊二醛(GA)的具有有机硅涂层的枯草芽孢杆菌菌悬液(枯草芽孢杆菌@有机硅@戊二醛)，包括：
步骤1-1)向浓度为100 OD600的枯草芽孢杆菌菌悬液中加入体积为671.7μl的正硅酸乙酯(TEOS)，使正硅酸乙酯(TEOS)的终浓度为150mM，置于120r min-1 30℃水浴摇床反应20min；
步骤1-2)向该菌悬液中加入体积为164.7μl的3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)，使3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)的终浓度为35.15mM，将含有3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)的枯草芽孢杆菌菌悬液置于120r min-1 30℃水浴摇床反应160min，得到枯草芽孢杆菌@有机硅的菌悬液；
步骤1-3)向步骤1-2)获得的菌悬液中加入体积为100μl的戊二醛(GA)，使GA的终浓度为0.25％，将含有GA的枯草芽孢杆菌菌悬液置于120r min-1 37℃水浴摇床反应60min；离心，除去上清液，用去离子水离心水洗，最终得到枯草芽孢杆菌@有机硅@戊二醛。
步骤二、将上述的枯草芽孢杆菌@有机硅@戊二醛置于120r min-1 70℃水浴摇床反应30min，得到具有催化活性的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅@戊二醛。
将实施例1获得的具有催化活性的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅@戊二醛在50℃、60℃、75℃下孵育，取出孵育后的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅，加入底物淀粉进行催化反应，通过高效液相色谱检测产物塔格糖的含量。通过公式
计算出酶的半衰期，其中Et为特定温度孵育后酶的剩余活性，E0为特定温度孵育前酶的初始活性，Kd为特定温度的热失活常数，t为孵育时间。酶的活性以胞内蛋白催化底物淀粉生产塔格糖的活性计算。胞内酶的半衰期为胞内酶活性剩余50％时的孵育时间。
经过计算，实施例1制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅@戊二醛涂层在50℃的半衰期为57761.62min，与对比例1相比延长了256.24倍；75℃的半衰期为1718.96min，与对比例1相比延长了46.04倍；如图1所示，在循环使用55次后酶的活性为初始活性的41.18％
实施例2
实施例2与实施例1步骤基本相同，与其不同的是：对步骤1-3)的过程操作中，加入GA后，溶液中GA的终浓度由0.25％改为0.3％，将含有GA的枯草芽孢杆菌菌悬液置于120rmin-1 37℃水浴摇床反应60min变为将含有GA的枯草芽孢杆菌菌悬液置于120r min-14℃水浴摇床反应180min。
经过计算，实施例2制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅@戊二醛涂层在60℃的半衰期为26952.88min，与对比例1相比延长了180.48倍；75℃的半衰期为1702.54min，与对比例1相比延长了45.62倍。
实施例3
实施例3与实施例1步骤基本相同，与其不同的是：对步骤1-3)的过程操作中，加入GA后，溶液中GA的终浓度由0.25％改为0.05％，将含有GA的枯草芽孢杆菌菌悬液置于120rmin-1 37℃水浴摇床反应60min变为将含有GA的枯草芽孢杆菌菌悬液置于120r min-1 20℃水浴摇床反应120min。
经过计算，实施例3制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅@戊二醛涂层在75℃的半衰期为28269.92min，与对比例1相比延长了125.41倍；75℃的半衰期为785.96min，与对比例1相比延长了21.06倍。
实施例4
实施例4与实施例1步骤基本相同，与其不同的是：对步骤1-3)的过程操作中，加入GA后，溶液中GA的终浓度由0.25％改为0.1％，将含有GA的枯草芽孢杆菌菌悬液置于120rmin-1 37℃水浴摇床反应60min变为将含有GA的枯草芽孢杆菌菌悬液置于120r min-1 37℃水浴摇床反应20min。
经过计算，实施例4制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅@戊二醛涂层在60℃的半衰期为19597.89min，与对比例1相比延长了131.23倍；75℃的半衰期为1209.91min，与对比例1相比延长了32.42倍。
实施例5
实施例5与实施例1步骤基本相同，与其不同的是：对步骤1-3)的过程操作中，加入GA后，溶液中GA的终浓度由0.25％改为0.15％，将含有GA的枯草芽孢杆菌菌悬液置于120rmin-1 37℃水浴摇床反应60min变为将含有GA的枯草芽孢杆菌菌悬液置于120r min-1 30℃水浴摇床反应60min。
经过计算，实施例5制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅@戊二醛涂层在50℃的半衰期为49829.09min，与对比例1相比延长了221.05倍；75℃的半衰期为1362.55min，与对比例1相比延长了36.51倍。
表1为不同条件制备得到的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅@戊二醛涂层的热稳定性。
表1
对比例2、具有催化活性的表面涂覆有机硅涂层的大肠杆菌(酶@大肠杆菌@有机硅)的制备，其制备方法与对比例1步骤基本相同，不同仅为，将其中的浓度为100 OD600的枯草芽孢杆菌菌悬液改为浓度为100 OD600的大肠杆菌，最终得到酶@大肠杆菌@有机硅。
将对比例2获得的具有催化活性的酶@大肠杆菌@有机硅分别在50℃、60℃、75℃下孵育，取出孵育后的酶@大肠杆菌@有机硅，加入底物淀粉进行催化反应，通过高效液相色谱检测产物塔格糖的含量。通过公式
计算出酶的半衰期，其中Et为特定温度孵育后酶的剩余活性，E0为特定温度孵育前酶的初始活性，Kd为特定温度的热失活常数，t为孵育时间。酶的活性以胞内蛋白催化底物淀粉生产塔格糖的活性计算。胞内酶的半衰期为胞内酶活性剩余50％时的孵育时间。
经过计算，本对比例2制备的酶@大肠杆菌@有机硅涂层在50℃的半衰期为110.98min；60℃的半衰期为71.25min；75℃的半衰期为17.64min。如图2所示，在循环使用12次后酶的活性为初始活性的50.72％。
实施例6
具有催化活性的表面涂覆戊二醛交联有机硅涂层的大肠杆菌(酶@大肠杆菌@有机硅@戊二醛涂层)的制备，实施例6与实施例1步骤基本相同，与其不同的是：将步骤1-1)中的浓度为100 OD600的枯草芽孢杆菌菌悬液改为浓度为100 OD600的大肠杆菌，最终制得酶@大肠杆菌@有机硅@戊二醛涂层。
经过计算，实施例6制备的酶@大肠杆菌@有机硅@戊二醛涂层在50℃的半衰期为22309.20min，与对比例2相比延长了201.02倍；75℃的半衰期为593.94min，与对比例2相比延长了33.67倍。
实施例7
实施例7与实施例6步骤基本相同，与其不同的是：对步骤1-3)的过程操作中，加入GA后，溶液中GA的终浓度由0.25％改为0.3％，将含有GA的大肠杆菌菌悬液置于120r min- 137℃水浴摇床反应60min改为将含有GA的大肠杆菌菌悬液置于120r min-1 18℃水浴摇床反应100min。
经过计算，实施例7制备的酶@大肠杆菌@有机硅@戊二醛涂层在60℃的半衰期为10106.10min，与对比例2相比延长了141.84倍；75℃的半衰期为621.10min，与对比例2相比延长了35.21倍。如图2所示，在循环使用45次后酶的活性为初始活性的40.82％。
实施例8
实施例8与实施例6步骤基本相同，与其不同的是：对步骤1-3)的过程操作中，加入GA后，溶液中GA的终浓度由0.25％改为0.05％，将含有GA的大肠杆菌菌悬液置于120r min-137℃水浴摇床反应60min改为将含有GA的大肠杆菌菌悬液置于120r min-1 37℃水浴摇床反应20min。
经过计算，实施例8制备的酶@大肠杆菌@有机硅@戊二醛涂层在50℃的半衰期为10634.10min，与对比例2相比延长了95.82倍；75℃的半衰期为281.71min，与对比例2相比延长了15.97倍。
实施例9
实施例9与实施例6步骤基本相同，与其不同的是：对步骤1-3)的过程操作中，加入GA后，溶液中GA的终浓度由0.25％改为0.1％，将含有GA的大肠杆菌菌悬液置于120r min- 137℃水浴摇床反应60min改为将含有GA的大肠杆菌菌悬液置于120r min-1 4℃水浴摇床反应180min。
经过计算，实施例9制备的酶@大肠杆菌@有机硅@戊二醛涂层在50℃的半衰期为7533.98min，与对比例2相比延长了105.74倍；75℃的半衰期为465.17min，与对比例2相比延长了26.37倍。
表2为不同条件制备得到的酶@大肠杆菌@有机硅@戊二醛涂层的热稳定性。
表2
综上，本发明所述的制备方法中利用涂覆有机硅涂层的细胞，通过加入化学活性高、含有对称醛基的交联剂戊二醛(GA)，利用稳定的化学键将具有有机硅涂层的菌体交联，得到在保护菌体结构不被破坏、提高菌体本身及胞内蛋白的稳定性上优于有机硅涂层的菌体。本发明在有机硅细胞涂层中仅加入少量的GA就可以使有机硅涂层维持细胞及其胞内蛋白稳定性的能力更加显著。本发明通过改变制备过程中GA的浓度、反应时间和反应温度，可调控戊二醛交联有机硅涂层的交联程度，最终提升胞内蛋白的稳定性。
尽管上面结合附图对本发明戊二醛交联有机硅细胞涂层以及其在提高胞内蛋白稳定性中应用的思路和方法进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以做出很多变形，这些均属于本发明的保护之内。
Claims (9)
1.一种戊二醛交联有机硅细胞涂层的制备方法，其特征在于，以戊二醛(GA)为交联剂，加入具有有机硅涂层的菌悬液中，所述的有机硅涂层是含有氧化硅颗粒的有机硅层，得到戊二醛交联有机硅细胞涂层。
2.根据权利要求1所述的戊二醛交联有机硅细胞涂层的制备方法，其特征在于，所述的菌悬液为革兰氏阳性菌菌悬液或革兰氏阴性菌菌悬液。
3.根据权利要求2所述的戊二醛交联有机硅细胞涂层的制备方法，其特征在于，所述的革兰氏阳性菌菌悬液为枯草芽孢杆菌。
4.根据权利要求2所述的戊二醛交联有机硅细胞涂层的制备方法，其特征在于，所述的革兰氏阴性菌菌悬液为大肠杆菌。
5.根据权利要求1所述的戊二醛交联有机硅细胞涂层的制备方法，其特征在于，将戊二醛加入具有有机硅涂层的菌悬液中，戊二醛的终浓度为0.05％-0.3％；将含有戊二醛的具有有机硅涂层的菌悬液置于温度为4℃-37℃的摇床摇晃时间为20min-180min，得到戊二醛交联有机硅细胞涂层的混合溶液。
6.根据权利要求5所述的戊二醛交联有机硅细胞涂层的制备方法，其特征在于，将所述的戊二醛交联有机硅细胞涂层的混合溶液进行离心，除去上清液，用去离子水离心水洗，最终在菌体表面得到戊二醛交联有机硅细胞涂层。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法得到的戊二醛交联有机硅细胞涂层。
8.根据权利要求7所述的戊二醛交联有机硅细胞涂层，其特征在于，所述的戊二醛交联有机硅细胞涂层在50-75℃条件下，与未经戊二醛与菌体交联的有机硅细胞涂层相比，50℃半衰期延长95.82-256.24倍，60℃延长105.74-180.48倍，75℃延长15.97-46.04倍；所述的戊二醛交联有机硅细胞涂层在循环使用55次后酶的活性为初始活性的41.18％，循环使用45次后酶的活性为初始活性的40.82％。
9.一种戊二醛交联有机硅细胞涂层的应用，其特征在于，根据权利要求1至6任一所述的制备方法制备得到的如权利要求7或8所述的戊二醛交联有机硅细胞涂层用于维持细胞及其胞内蛋白在外界不利环境(如高温)下的活性；在细胞催化过程中，提高了细胞的稳定性，进而提高细胞的回用性。
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