CN113355261A - 一种有机硅细胞涂层的制备方法及应用 - Google Patents

一种有机硅细胞涂层的制备方法及应用 Download PDF

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姜忠义
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Abstract

本发明公开了一种有机硅细胞涂层的制备方法，利用菌体表面为模板，通过3‑氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)与菌体表面的活性基团反应及其自身的缩聚，在菌体表面形成一层有机硅，有机硅涂层能有效保护菌体结构不被破坏，提高菌体本身及胞内蛋白的稳定性。优选地，在加入3‑氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)前加入正硅酸乙酯(TEOS)，通过正硅酸乙酯(TEOS)水解形成的氧化硅颗粒结合3‑氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)对氧化硅颗粒的修饰作用，使菌体表面的有机硅涂层中增加了氧化硅颗粒，使有机硅涂层维持细胞及其胞内蛋白稳定性的能力更加显著。本发明制备原料廉价、易得，制备工艺简单易行，适用于工业生产。

Description

一种有机硅细胞涂层的制备方法及应用
技术领域
本发明属于细胞涂层制备及应用，尤其涉及一种有机硅细胞涂层的制备方法及应用。
背景技术
由于微生物具有生长繁殖快、廉价易得等优点被广泛应用于全细胞生物催化、合成生物学等领域，其中大肠杆菌是革兰氏阴性菌中最具有代表性的一种模式生物，其生长快速、易于操作，是一种被人类研究较为透彻的细胞。因此，重组DNA技术等分子水平的研究最初都是在大肠杆菌中进行的，是合成生物学中重要的“底盘生物”。枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌中最具有代表性的一种模式生物，作为重要的生物安全菌株被广泛应用于医药与食品添加剂的工业生物合成过程。大肠杆菌和枯草芽孢杆菌虽然都常用于全细胞生物合成过程，但由于细胞对外界不良环境的抗性较差，容易发生细胞破裂、溶菌等现象从而导致目标蛋白的变性和泄露，阻碍其在大规模生产中的应用。
细胞涂层是一种可以有效防止细胞破裂的方法，基于仿生的细胞涂层技术是一种无细胞毒性的涂层技术，常用于全细胞生物催化、生物传感器、细胞治疗等领域。常用的基于仿生的细胞涂层技术有仿生硅化、仿生钛化、仿生粘合等。以仿生硅化为例，一般的仿生硅化方法是根据静电吸附原理层层自组装(LbL)，利用带正电的诱导剂使硅前驱体水解生成二氧化硅颗粒并通过诱导剂吸附在细胞表面，根据层数的增加来调控涂层的厚度。这种方法通过控制层数来调控涂层厚度，但该过程中需要多次水洗操作复杂，且该方法中诱导剂的价格昂贵(如聚乙烯亚胺)限制了其在大规模细胞涂层中的应用。
发明内容
与现有技术相比，本发明的目的在于提供一种有机硅细胞涂层的制备方法。本发明提供的有机硅细胞涂层的制备方法可有效保护细胞结构不被破坏，提高细胞及胞内蛋白的稳定性。本发明制备原料廉价、易得，制备工艺简单易行，适用于工业生产。
本发明提出的一种有机硅细胞涂层的制备方法，其步骤是：向菌悬液中加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)，以菌体表面为模板，利用3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)中的氨基与菌体表面的活性基团反应使3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)附着在菌体表面，同时，所述的3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)在水中缩聚在菌体表面形成有机硅层。
进一步讲，本发明所述的制备方法，其中，在向菌悬液中加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)之前，先向菌悬液中加入正硅酸乙酯(TEOS)，所述的正硅酸乙酯(TEOS)水解生成氧化硅颗粒；随后，加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)，加入的3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)作为修饰剂在氧化硅颗粒表面修饰氨基，使氧化硅颗粒可以与菌体表面的活性基团反应附着在菌体表面，随后，3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)在水中缩聚在菌体表面形成含有氧化硅颗粒的有机硅层。
所述的菌悬液为革兰氏阳性菌菌悬液或革兰氏阴性菌菌悬液。所述的革兰氏阳性菌菌悬液为枯草芽孢杆菌菌悬液，所述的革兰氏阴性菌菌悬液为大肠杆菌菌悬液。
通过改变其中正硅酸乙酯(TEOS)与3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)的浓度和反应时间，以调控有机硅层的厚度。
所述的制备方法按照以下步骤实现：
步骤一、向菌悬液中加入正硅酸乙酯(TEOS)，使正硅酸乙酯(TEOS)的终浓度为0mM-150mM，将含有正硅酸乙酯(TEOS)的菌悬液置于转速为120r min-1、温度为25℃-35℃的水浴摇床摇晃反应20min；
步骤二、向步骤一得到的混合溶液中加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)，使3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)的终浓度为4mM-40mM继续摇晃反应30min-5h；
步骤三、将步骤二得到的混合溶液离心，除去上清液，用去离子水离心水洗3次，最终得到菌体表面涂覆有有机硅涂层的细菌(记为细胞@有机硅)。
进一步讲，步骤一、向菌悬液中加入正硅酸乙酯(TEOS)，使正硅酸乙酯(TEOS)的终浓度优选为20mM-150mM。
本发明提出的有机硅细胞涂层的制备方法的优点是：制备原料廉价、易得，制备条件温和，制备工艺简单易行，通过改变制备过程中3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)的浓度和时间和正硅酸乙酯(TEOS)的浓度，可调控有机硅层厚度，进而获得不同稳定性的细胞。本发明所制备的细胞@有机硅稳定性显著提升，与纯细胞相比，将本发明所述的制备方法制备得到的有机硅细胞涂层用于维持细胞及其胞内蛋白在外界不利环境(如高温)下的活性。进一步讲，在细胞催化过程中，该有机硅细胞涂层可以提高细胞的机械稳定性以防止细胞破裂，进而提高细胞的回用性。
附图说明
图1为对比例1制备的酶@枯草芽孢杆菌的扫描电镜(SEM)照片；
图2为对比例1制备的酶@枯草芽孢杆菌的透射电镜(TEM)照片；
图3为实施例3制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅的扫描电镜(SEM)照片；
图4为实施例3制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅的透射电镜(TEM)照片；
图5为对比例1(cell)与实施例3(cell@有机硅)制备样品的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图；
图6为对比例1、实施例2、实施例6和实施例8循环使用后剩余活性图。
具体实施方式
本发明提出的一种有机硅细胞涂层的制备方法，设计思路是：利用菌体表面为模板，通过3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)与菌体表面的活性基团反应及其自身的缩聚，在菌体表面形成一层有机硅，有机硅涂层能有效保护菌体结构不被破坏，提高菌体本身及胞内蛋白的稳定性。优选地，在加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)前加入正硅酸乙酯(TEOS)，通过正硅酸乙酯(TEOS)水解形成的氧化硅颗粒结合3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)对氧化硅颗粒的修饰作用，使菌体表面的有机硅涂层中增加了氧化硅颗粒，使有机硅涂层维持细胞及其胞内蛋白稳定性的能力更加显著。
本发明所述有机硅细胞涂层的制备方法的基本方案是：首先，向菌悬液中加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)，摇晃反应；然后，将得到的菌悬液离心，除去上清液，用去离子水离心水洗3次，所得即为细胞@有机硅。
本发明所述有机硅细胞涂层的制备方法的优选方案是：首先，先向菌悬液加入正硅酸乙酯(TEOS)，正硅酸乙酯(TEOS)水解生成氧化硅颗粒；随后，加入的3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)，以3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)作为修饰剂在氧化硅颗粒表面修饰氨基，使其与菌体表面的活性基团反应附着在菌体表面，且菌体表面的有机硅涂层中增加了氧化硅颗粒，使有机硅涂层维持细胞及其胞内蛋白稳定性的能力更加显著。
下面结合附图和对比例及具体实施例对本发明技术方案作进一步详细描述，所描述的具体实施例仅对本发明进行解释说明，并不用以限制本发明。
对比例1、具有催化活性的枯草芽孢杆菌的制备
步骤一、将20ml浓度为100OD600的枯草芽孢杆菌菌悬液离心，除去上清液，用去离子水离心水洗3次。
步骤二、将步骤一中的菌泥置于120r min-1 70℃水浴摇床反应30min，得到具有催化从淀粉生成塔格糖活性的酶@枯草芽孢杆菌。
步骤三、将步骤二中获得的具有催化活性的酶@枯草芽孢杆菌在70℃下孵育0h-72h，取出孵育后的酶@枯草芽孢杆菌，加入底物淀粉进行催化反应，通过高效液相色谱检测产物塔格糖的含量。通过公式
Figure BDA0003040229290000031
计算出酶的半衰期，其中Et为特定温度孵育后酶的剩余活性，E0为特定温度孵育前酶的初始活性，Kd为特定温度的热失活常数，t为孵育时间。酶的活性以胞内蛋白催化底物淀粉生产塔格糖的活性计算。胞内酶的半衰期为胞内酶活性剩余50％时的孵育时间。
图1和图2分别是酶@枯草芽孢杆菌的扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)照片。经过计算胞内酶在70℃下的半衰期为30.03h；如图6所示，在循环使用5次后酶的活性仅为初始活性的5.82％。
实施例1、具有催化活性的表面涂覆有机硅涂层的枯草芽孢杆菌的制备
步骤一、向浓度为100OD600的枯草芽孢杆菌菌悬液中加入体积为98.8μl的3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)，使3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)的终浓度为21.09mM，将含有3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)的枯草芽孢杆菌菌悬液置于120r min-1 30℃水浴摇床反应3h 40min；
步骤二、将步骤一中的菌悬液离心，除去上清液，用去离子水离心水洗3次，最终得到枯草芽孢杆菌@有机硅。
步骤三、将步骤二得到的枯草芽孢杆菌@有机硅置于120r min-1 70℃水浴摇床反应30min，得到具有催化活性的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅。
步骤四、将步骤三中获得的具有催化活性的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅在70℃下孵育0h-72h，取出孵育后的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅，加入底物淀粉进行催化反应，通过高效液相色谱检测产物塔格糖的含量。通过公式
Figure BDA0003040229290000041
计算出酶的半衰期，其中Et为特定温度孵育后酶的剩余活性，E0为特定温度孵育前酶的初始活性，Kd为特定温度的热失活常数，t为孵育时间。酶的活性以胞内蛋白催化底物淀粉生产塔格糖的活性计算。胞内酶的半衰期为胞内酶活性剩余50％时的孵育时间。
经过计算，本实施例1制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅涂层厚度约为40nm，在70℃下的半衰期与对比例1相比延长了58.04％。
实施例2
本实施例与实施例1步骤基本相同，与其不同的是：对步骤一的过程操作中，在加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)前先加入体积为403μl的正硅酸乙酯(TEOS)，使正硅酸乙酯(TEOS)的终浓度为90mM，置于120r min-1 30℃水浴摇床反应20min。
经过计算，本实施例2制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅涂层厚度约为50nm，在70℃下的半衰期与对比例1相比延长了78.61％；如图6所示，在循环使用8次后酶的活性为初始活性的17.92％。
实施例3
本实施例与实施例2步骤基本相同，与其不同的是：对步骤二的过程操作中，加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)后继续摇晃时间由3h 40min改变为2h 40min。
图3为实施例3制得的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅的扫描电镜(SEM)照片。与对比例1的酶@枯草芽孢杆菌相比，有机硅涂层附着在菌体表面，菌体表面比未涂层前光滑。
图4为实施例3制得的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅的透射电镜(TEM)照片。与对比例1的酶@枯草芽孢杆菌相比，菌体外明显长出涂层。
图5为对比例1(Cell)与实施例3(Cell@有机硅)制备样品的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图，与对比例1相比，实施例3在460cm-1和800cm-1处出现了明显的吸收峰，这是由于Si-O键的弯曲振动和Si-O-Si键的对称伸缩所导致的，证明该涂层是由有机硅缩聚得到。
经过计算，本实施例3制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅涂层厚度约为50nm，在70℃下的半衰期与对比例1相比延长了90.84％。
实施例4
本实施例与实施例3步骤基本相同，与其不同的是：对步骤二的过程操作中，加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)后继续摇晃时间由2h 40min改变为40min。
经过计算，本实施例4制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅涂层厚度约为50nm，在70℃下的半衰期与对比例1相比延长了75.82％。
实施例5
本实施例与实施例3步骤基本相同，与其不同的是：对步骤二的过程操作中，加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)后继续摇晃时间由2h 40min改变4h 40min。
经过计算，本实施例5制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅涂层厚度约为50nm，在70℃下的半衰期与对比例1相比延长了60.57％。
实施例6
本实施例与实施例2步骤基本相同，与其不同的是：对步骤一的过程操作中，正硅酸乙酯(TEOS)的加入终浓度由90mM改为20mM；对步骤二的过程操作中，加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)的终浓度由21.09mM改为4.69mM。
经过计算，本实施例6制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅涂层厚度约为10nm，在70℃下的半衰期与对比例1相比延长了10.18％；如图6所示，在循环使用5次后酶的活性仅为初始活性的4.98％。
实施例7
本实施例与实施例2步骤基本相同，与其不同的是：对步骤一的过程操作中，正硅酸乙酯(TEOS)的加入终浓度由90mM改为40mM；对步骤二的过程操作中，加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)的终浓度由21.09mM改为9.37mM。
经过计算，本实施例7制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅涂层厚度约为20nm，在70℃下的半衰期与对比例1相比延长了25.32％。
实施例8
本实施例与实施例2步骤基本相同，与其不同的是：对步骤一的过程操作中，正硅酸乙酯(TEOS)的加入终浓度由90mM改为60mM；对步骤二的过程操作中，加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)的终浓度由21.09mM改为14.06mM。
经过计算，本实施例8制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅涂层厚度约为45nm，在70℃下的半衰期与对比例1相比延长了55.31％；如图6所示，在循环使用7次后酶的活性仅为初始活性的11.72％。
实施例9
本实施例与实施例2步骤基本相同，与其不同的是：对步骤一的过程操作中，正硅酸乙酯(TEOS)的加入终浓度由90mM改为120mM；对步骤二的过程操作中，加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)的终浓度由21.09mM改为28.12mM。
经过计算，本实施例9制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅涂层厚度约为55nm，在70℃下的半衰期与对比例1相比延长了57.84％。
实施例10
本实施例与实施例2步骤基本相同，与其不同的是：对步骤一的过程操作中，正硅酸乙酯(TEOS)的加入终浓度由90mM改为150mM；对步骤二的过程操作中，加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)的终浓度由21.09mM改为35.15mM。
经过计算，本实施例10制备的酶@枯草芽孢杆菌@有机硅涂层厚度约为60nm，在70℃下的半衰期与对比例1相比延长了59.56％。
对比例2、具有催化活性的大肠杆菌的制备
步骤一、将20ml浓度为100OD600的大肠杆菌悬液离心，除去上清液，用去离子水离心水洗3次。
步骤二、将步骤一得到的菌泥置于120r min-1 70℃水浴摇床反应30min，得到具有催化活性的酶@大肠杆菌。
步骤三、将步骤二中获得的具有催化活性的酶@大肠杆菌在70℃下孵育0h-72h，分别取出孵育后的酶@大肠杆菌，加入底物淀粉进行催化反应，通过高效液相色谱检测产物塔格糖的含量。通过公式
Figure BDA0003040229290000061
计算出酶的半衰期，其中Et为特定温度孵育后酶的剩余活性，E0为特定温度孵育前酶的初始活性，Kd为特定温度的热失活常数，t为孵育时间。酶的活性以胞内蛋白催化底物淀粉生产塔格糖的活性计算。胞内酶的半衰期为胞内酶活性剩余50％时的孵育时间。
经过计算对比例2的酶@大肠杆菌在70℃下的半衰期为29.12h。
实施例11、具有催化活性的表面涂覆有机硅涂层的大肠杆菌的制备
本实施例与实施例3步骤基本相同，与其不同的是：对步骤一的过程操作中，枯草芽孢杆菌菌悬液改变为大肠杆菌菌悬液。
经过计算，本实施例11制备的酶@大肠杆菌@有机硅涂层厚度约为50nm，在70℃下的半衰期与对比例2相比延长了83.10％。
综上，本发明所述的制备方法中利用菌体表面为模板，通过3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)表面的氨基与菌体表面的活性基团反应及其自身的缩聚，在菌体表面形成一层有机硅。而在加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)前加入正硅酸乙酯(TEOS)，通过正硅酸乙酯(TEOS)水解形成的氧化硅颗粒结合3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)对氧化硅颗粒的修饰作用，使菌体表面的有机硅涂层中增加了氧化硅颗粒，使有机硅涂层维持细胞及其胞内蛋白稳定性的能力更加显著，通过SEM和TEM验证了成功构建有机硅涂层。本发明利用3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)的缩聚过程以及正硅酸乙酯(TEOS)的水解过程，制备过程简便，条件温和，通过改变有机硅前驱体浓度可以调节形成的有机硅层厚度，最终提升胞内蛋白的稳定性。
尽管上面结合附图对本发明有机硅细胞涂层以及其在提高胞内蛋白稳定性中应用的思路和方法进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以做出很多变形，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (9)

1.一种有机硅细胞涂层的制备方法，其特征在于，向菌悬液中加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)，以菌体表面为模板，利用3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)中的氨基与菌体表面的活性基团反应使3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)附着在菌体表面，同时，所述的3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)在水中缩聚在菌体表面形成有机硅层。
2.根据权利要求1所述的有机硅细胞涂层的制备方法，其特征在于，在向菌悬液中加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)之前，先向菌悬液中加入正硅酸乙酯(TEOS)，所述的正硅酸乙酯(TEOS)水解生成氧化硅颗粒；随后，加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)，加入的3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)作为修饰剂在氧化硅颗粒表面修饰氨基，使氧化硅颗粒可以与菌体表面的活性基团反应附着在菌体表面，随后，3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)在水中缩聚在菌体表面形成含有氧化硅颗粒的有机硅层。
3.根据权利要求1所述的有机硅细胞涂层的制备方法，其特征在于，所述的菌悬液为革兰氏阳性菌菌悬液或革兰氏阴性菌菌悬液。
4.根据权利要求3所述的有机硅细胞涂层的制备方法，其特征在于，所述的菌悬液为枯草芽孢杆菌菌悬液或大肠杆菌菌悬液。
5.根据权利要求2所述的有机硅细胞涂层的制备方法，其特征在于，通过改变其中正硅酸乙酯(TEOS)与3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)的浓度和反应时间，以调控有机硅层的厚度。
6.根据权利要求1或2所述的有机硅细胞涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、向菌悬液中加入正硅酸乙酯(TEOS)，使正硅酸乙酯(TEOS)的终浓度为0mM-150mM，将含有正硅酸乙酯(TEOS)的菌悬液置于转速为120r min-1、温度为25℃-35℃的水浴摇床摇晃反应20min；
步骤二、向步骤一得到的混合溶液中加入3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)，使3-氨丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)的终浓度为4mM-40mM继续摇晃反应30min-5h；
步骤三、将步骤二得到的混合溶液离心，除去上清液，用去离子水离心水洗3次，最终得到菌体表面涂覆有有机硅涂层的细菌(记为细胞@有机硅)。
7.根据权利要求6所述的有机硅细胞涂层的制备方法，其特征在于，步骤一、向菌悬液中加入正硅酸乙酯(TEOS)，使正硅酸乙酯(TEOS)的终浓度为20mM-150mM。
8.一种有机硅细胞涂层的应用，根据权利要求1或2所述的制备方法制备得到的有机硅细胞涂层用于维持细胞及其胞内蛋白在外界不利环境(如高温)下的活性。
9.根据权利要求8所述的有机硅细胞涂层的应用，在细胞催化过程中，提高细胞的机械稳定性以防止细胞破裂，进而提高细胞的回用性。
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