CN109576256B - 一种磁性dna水凝胶封装双酶的方法 - Google Patents

一种磁性dna水凝胶封装双酶的方法 Download PDF

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Abstract

一种磁性DNA水凝胶封装双酶的方法，属于固定化酶制备领域。本发明分为以下步骤：首先通过生物素功能化的单链DNA与未修饰的首尾交叉互补配对的单链DNA通过碱基互补配对制备长链DNA超分子结构；之后将DNA超分子结构与葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶及磁性纳米粒子混合；加入链霉亲和素，通过链霉亲和素和生物素的相互作用实现酶和磁性纳米粒子的封装，进而制备磁性DNA水凝胶封装双酶体系。由于DNA水凝胶具有较好的生物相容性和生物源性及磁性纳米粒子的磁响应性，制备的固定化酶体系拥有较好的重复使用性、稳定性以及高酶活性，有利于酶的重复利用及回收，降低使用制备成本。

Description

一种磁性DNA水凝胶封装双酶的方法
技术领域
本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及通过DNA水凝胶封装酶和磁性纳米粒子制备磁性DNA水凝胶封装酶的方法。
背景技术
天然酶是一种温和高效的生物催化剂，在基础研究和工业化实际应用中都有着极其广阔的前景。与传统的化学反应相比，酶促反应的条件更加温和，操作更加简单，区域选择性更高，反应中副产物更少，而且很多化学方法难以合成的反应都可以通过一种或多种酶来完成。除此之外，酶还具有很多优势，比如高催化效率、活性可调控、选择专一性等。但游离酶成本较高、稳定性差、不能重复使用等缺点成为阻碍其普及的瓶颈。将天然酶固定在载体上，拓宽酶的应用范围和稳定性。固定化酶具有以下优点：其一，固定化的载体易于和底物分离，因此可以避免酶对反应底物的污染；其二，酶本身价格昂贵，固定化酶可以实现对酶的回收利用，从而大大降低了反应的成本；其三，将酶固定在载体表面可以增加酶的结构稳定性，使酶在实验室和工业化研究中更不易失活；其四，将酶固定在合适的载体上可以提高酶的重复使用性及酶活性，降低反应及应用成本。
由于DNA水凝胶具有较好的物理化学稳定性、较好的生物相容性以及生物源性，被广泛应用于生物和医疗领域。近年来，以DNA水凝胶为载体进行酶封装制备固定化酶得到发展。尽管这些固定化酶具有满意的酶促分析及酶活性，但几乎都是基于同相酶分析，导致固定化酶难以从反应体系中分离，因此具有较差的重复使用性和稳定性。因此，需要进一步探索易于制备和从反应体系中分离的基于DNA水凝胶封装的固定化酶方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用DNA水凝胶为封装载体，同时封装多酶和磁性纳米粒子固定化酶的方法，以克服传统DNA水凝胶封装酶难以从反应体系中分离的缺点。本发明的封装方法操作简单，条件温和，制备的封装酶酶活性高，重复使用性、稳定性好，且易于从反应体系中分离。本发明以辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶为模型来证明固定化酶体系的优良性能。
该方法首先合成生物素均匀功能化的长链DNA超分子结构，再经过生物素和链霉亲和素的特异性相互作用实现辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和磁性纳米粒子的封装，制备磁性DNA水凝胶封装双酶的固定化酶。
为了达到上述目的，本发明按照以下技术方案实现:
一种磁性DNA水凝胶封装双酶的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将生物素功能化修饰的单链DNA ssDNA1与未修饰的单链DNA ssDNA2溶于缓冲溶液中，混合溶液在95℃反应5min，反应后的混合溶液室温冷却4h制备长链DNA超分子结构；生物素与ssDNA1的摩尔比为1:1；ssDNA1和ssDNA2摩尔比为1:1；ssDNA1和ssDNA2为首尾交相互补配对构成DNA超分子结构；
(2)将(1)中合成的DNA超分子结构与磁性纳米粒子、葡萄糖氧化酶及辣根过氧化物酶混合30min，混合液中加入链霉亲和素反应24h，合成磁性DNA水凝胶封装双酶体系；辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶摩尔比为2:1，链霉亲和素和生物素的摩尔比为1:2；DNA超分子结构与磁性纳米粒子、葡萄糖氧化酶的摩尔比为1:239:22。
进一步，将(1)中合成的DNA超分子结构与磁性四氧化三铁纳米粒子、葡萄糖氧化酶及辣根过氧化物酶混合30min，混合液中加入链霉亲和素反应24h，合成磁性DNA水凝胶封装双酶体系。
进一步，步骤(1)中所述的ssDNA1的序列为
5′-CGTCCTACACTCCTGGCAGTCTCGTTCTAGTCTCGCGTTGCACCTCCGTCATGATCCATTCTCCACCTCG-biotin-3′，ssDNA2的序列为
5′-CGAGACTAGAACGAGACTGCCAGGAGTGTAGGACGCGAGGTGGAGAATGGATCATGACGGAGGTGCAACG-3′，且ssDNA1和ssDNA2浓度均为50μM；
进一步，步骤(1)中所述的ssDNA1和ssDNA2为首尾交相互补配对构成长链DNA超分子结构，且生物素均匀分布在长链DNA超分子结构中；
进一步，步骤(1)中所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，pH 7.4,0.1M NaCl；
进一步，所述的辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的浓度分别为2mM和1mM，摩尔比为2:1，链霉亲和素和生物素的摩尔比为1:2；
进一步，磁性DNA水凝胶封装双酶体系为球形；
进一步，所述的磁性四氧化三铁纳米粒子粒径为10nm；
进一步，所述的磁性DNA双酶水凝胶为球形，在磁场的控制下易于从反应体系中分离；
进一步，所述的磁性DNA水凝胶封装双酶为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶，此封装方法可以扩展到其他双酶，不仅限于葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶。
本发明的优点在于：
(1)DNA水凝胶具有较好的生物相容性和物理化学稳定性，酶的封装反应条件温和，均有利于保持酶的活性；
(2)封装方法简单高效，利用链霉亲和素和生物素之间的相互作用，通过DNA超分子结构实现双酶和磁性纳米粒子的封装，封装过程中不涉及酶的化学改性，未对酶的二级、三级结构产生影响，充分保持酶活性和稳定性；
(3)与其他水凝胶相比，本发明制备的磁性DNA水凝胶封装酶在磁场的控制下易于从反映体系中分离，可显著提高固定化酶的重复使用性；
(4)显著提高双酶的级联反应效率，经DNA水凝胶将酶封装在狭小空间内，可提高双酶距离的邻近性，使葡萄糖氧化酶的催化产物快速被辣根过氧化物酶消耗，节约合成和使用成本。
(5)本发明以葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶为模型酶，可广泛应用于不同类型的单酶或多酶封装，是一种通用型制备磁性DNA水凝胶的封装酶策略。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明，但并不构成对本发明的限制。
实施例1：长链DNA超分子结构的制备
将相同摩尔数(1OD)的生物素功能化修饰的单链DNA(ssDNA1)与未修饰的单链DNA(ssDNA2)分别溶于10mM PBS(pH 7.4，0.1M NaCl)缓冲溶液中配制成50μM反应液，将ssDNA2转移到ssDNA1溶液中，混合溶液在95℃反应5min，反应后的混合液室温冷却4h制备长链DNA超分子结构；
实施例2：磁性DNA水凝胶封装双酶的制备
将0.5mg四氧化三铁磁性纳米粒子(0.5mg mL-1，0.5mL)用10mM PBS(pH 7.4，0.1MNaCl)超声洗3遍，磁性分离倒掉上清液，加入实施例1中制备的长链DNA超分子结构(50μM，180μL)、葡萄糖氧化酶溶液(1mM，200μL)和辣根过氧化物酶溶液(2mM，200μL)，置于摇床反应，29℃，30min，400rpm；反应完后，加入链霉亲和素(15μM，300μL)，链霉亲和素和生物素的摩尔比为1:2，置于摇床反应，29℃，24h，400rpm；反应完后，用去离子水洗4遍待用。以上所用溶液均为10mM PBS(pH 7.4，0.1M NaCl)。
实施例3：DNA水凝胶封装单酶和双酶的制备
(1)长链DNA超分子结构的制备：同实施例1。
(2)实施例1中制备的长链DNA超分子结构(50μM，120μL)与辣根过氧化物酶溶液(2mM，200μL)或葡萄糖氧化酶溶液(1mM，200μL)和辣根过氧化物酶溶液(2mM，200μL)双酶混合物，混合溶液用10mM PBS(pH 7.4，0.1M NaCl)稀释至1mL，置于摇床反应，29℃，30min，400rpm；反应完后，加入链霉亲和素(15μM，200μL)，链霉亲和素和生物素的摩尔比为1:2，置于摇床反应，29℃，24h，400rpm；反应完后，用去离子水离心(10000rpm，15min)洗4遍待用。
实施例4：磁性DNA水凝胶封装双酶体系条件优化及动力学考察
(1)双酶比例、酶封装效率及酶泄露均对固定化酶体系活性和稳定性有影响，因此本发明对制备的固定化酶体系的反应条件进行考察。
(2)分别制备葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的摩尔比为1:1，1:2，1:4，1:6和1:8的磁性DNA水凝胶封装固定化酶体系(0.5mg)，分别在37℃下酶促底物100mM葡萄糖和0.5mM2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，摇床反应5min，400rpm，考察双酶比例对固定化酶体系影响。用紫外可见分光光度计测量产物在415nm处的吸光度。分析结果表明，葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的摩尔比为1:2是封装固定化酶的最佳摩尔比例，随着摩尔比例的升高，固定化酶的活性先升高后逐渐降低，说明过高比例的辣根过氧化物酶并未提高封装双酶体系的活性。
(3)取长链DNA超分子结构(180μL)，葡萄糖氧化酶(1mM，200μL)，辣根过氧化物酶(2mM，200μL)，四氧化三铁磁性纳米粒子(0.5mg)和链霉亲和素(300μL)混合溶液(1mL)，链霉亲和素和生物素的摩尔比为1:2，反应封装时间分别为0，4，8，12，16，20，24，28，32，36，40，44，48h，摇床反应，29℃，400rpm，考察封装时间对磁性DNA水凝胶封装效率的影响。封装产物用磁铁分离，上清液酶浓度用Broadford方法测量。分析结果表明，24h是封装酶的最佳封装时间，封装效率为60％。
(4)取0.5mg磁性DNA水凝胶封装酶体系，在磷酸盐缓冲溶液中(10mM，pH 7.4，0.1MNaCl)分别连续孵育0，4，8，12，16，20，24，28，32，36，40，44，48h，摇床反应，29℃，400rpm，考察孵育时间对磁性DNA水凝胶酶泄露效率的影响。封装产物用磁铁分离，上清液酶浓度用Broadford方法测量。分析结果表明，酶泄露随着孵育时间的延长而略有增长，当孵育时间为28h时达到最大泄漏量(5％)，之后不再变化，表明本发明的封装策略具有较高的稳定性，可以显著抑制封装酶的泄露。
(5)在最佳反应条件下对磁性DNA水凝胶封装双酶体系进行动力学考察。根据米氏方程(Michaelis-Menten equation)分别考察封装双酶体系和自由葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶双酶的动力学参数。以双酶体系中葡萄糖氧化酶为模型酶衡量对比封装酶和自由酶的动力学参数。磁性DNA水凝胶封装双酶体系的米氏常数(Km)及最大反应速率(Vmax)分别为9.4mM和6.29μmol·L-1·s-1，自由酶的Km和Vmax分别为55.7mM和1.85μmol·L-1·s-1，表明封装酶与自由酶相比具有较好的底物亲和性和较大的反应速率。磁性DNA水凝胶封装双酶体系的催化常数(kcat)及催化效率(kcat/Km)分别为56.61s-1和6.02s-1mM-1，自由酶的kcat和kcat/Km分别为16.65s-1和0.30s-1mM-1，表明制备的封装酶体系与自由酶相比具有较高的酶促反应活性。
实施例5：磁性DNA水凝胶封装双酶体系重复使用性及稳定性
(1)封装双酶体系的制备：同实施例2。
(2)重复使用性考察：配制1mL 100mM葡萄糖和0.5mM ABTS底物溶液，加入到0.5mg实施例2中合成的固定化酶体系，摇床反应5min，37℃，400rpm。
(3)反应完后，用紫外可见分光光度计测量产物上清液在415nm处的吸光度，(2)中的封装酶用10mM PBS(pH 7.4，0.1M NaCl)充分洗涤，去除其表面粘有的底物溶液，加入1mL100mM葡萄糖和0.5mM ABTS底物溶液，摇床反应5min，37℃，400rpm，用紫外可见分光光度计测量产物在415nm处的吸光度。反复批次催化1mL 100mM葡萄糖和0.5mM ABTS底物溶液，考察封装酶体系的重复使用性。
(4)经考察，本发明制备的封装双酶体系拥有很好的重复使用性。重复使用10次后仍可保持原酶活性的87％；与其他非磁性DNA水凝胶封装酶相比，本发明制备的封装酶体系在磁场控制下易于从反应体系中分离，重复使用性及易回收的特性使其具有很大优势。
(5)热稳定性考察：0.5mg(100μL)实施例2中合成的封装酶体系和相同酶量的自由葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶双酶(100μL)分别在40℃和50℃中孵育0，15，30，45，60，75，90min，考察高温对磁性DNA水凝胶封装酶活性的影响。孵育结束后，封装酶体系中分别加入1mL 100mM葡萄糖和0.5mM ABTS底物溶液，摇床反应5min，37℃，400rpm，封装酶用磁铁分离，上清液和自由酶反应溶液分别用紫外可见分光光度计测量415nm处的吸光度。分析结果表明，封装酶和自由酶的活性随热孵育时间的延长而降低，但封装酶与自由酶相比具有较好的热稳定性，在40℃和50℃中孵育60min后仍可分别保留原酶活性的90％和85％，是相同条件下自由酶酶活的1.6和1.8倍。
储存稳定性考察：0.5mg(100μl)实施例2中合成的封装酶体系和相同酶量的自由葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶双酶(100μL)分别在4℃和室温条件下分别储存0，3，6，9，12，15天，考察不同储存条件对磁性DNA水凝胶封装酶活性的影响。储存结束后，封装酶体系中分别加入1mL 100mM葡萄糖和0.5mM ABTS底物溶液，摇床反应5min，37℃，400rpm，封装酶用磁铁分离，上清液和自由酶反应溶液分别用紫外可见分光光度计测量415nm处的吸光度。分析结果表明，封装酶和自由酶的活性随储存时间的延长而降低，但封装酶与自由酶相比具有较好的储存稳定性，在4℃储存9天后，封装酶仍可保持原酶活性的87％，在室温储存12天后，封装酶仍可保持原酶活性的75％，然而自由酶在相同条件下仅分别保留原酶活性的36％和19％。
实施例6：磁性DNA水凝胶封装双酶体系用于葡萄糖检测
(1)固定化酶体系的制备：同实施例2。
(2)5mg实施例2中合成的封装酶体系，分别加入6，16，32，48，64，80，96，135μM葡萄糖和3.0mM ABTS，摇床反应10min，37℃，400rpm。封装酶用磁铁分离，上清液分别用紫外可见分光光度计测量415nm处的吸光度。
(3)将得到的吸光度与相应浓度的葡萄糖做线性拟合，表明葡萄糖浓度在6.0-135μM范围内，封装酶体系与葡萄糖浓度具有较好的线性关系(R2＝0.999)。进一步对葡萄糖浓度进行分析，表明封装酶对葡萄糖的检出限为0.6μM。实验结果表明，封装酶体系具有较好的葡萄糖浓度响应性能，可将其应用于葡萄糖浓度的检测。
(4)5mg实施例2中合成的封装酶体系，分别加入1mL 100μM葡萄糖及干扰物质1.0mM木糖，1.0mM果糖，1.0mM麦芽糖，1.0mM半乳糖，1.0mM乳糖，1.0mM甘露糖和1mg mL-1BSA及3.0mM ABTS，摇床反应10min，37℃，400rpm。封装酶用磁铁分离，上清液分别用紫外可见分光光度计测量415nm处的吸光度。实验表明，尽管干扰物质的浓度比葡萄糖浓度高10倍，但是基本上没有吸收值，然而催化葡萄糖具有较高的吸光度。进而表明，制备的封装酶体系对葡萄糖具有较好的选择性。

Claims (5)

1.一种磁性DNA水凝胶封装双酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将生物素功能化修饰的单链DNA ssDNA1与未修饰的单链DNA ssDNA2溶于缓冲溶液中，混合溶液在95°C反应5 min，反应后的混合溶液室温冷却4 h制备长链DNA超分子结构；生物素与ssDNA1的摩尔比为1:1；ssDNA1和ssDNA2摩尔比为1:1；ssDNA1和ssDNA2为首尾交相互补配对构成DNA超分子结构；
（2）将（1）中合成的DNA超分子结构与磁性纳米粒子、葡萄糖氧化酶及辣根过氧化物酶混合30 min，混合液中加入链霉亲和素反应24 h，合成磁性DNA水凝胶封装双酶体系；辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶摩尔比为2:1，链霉亲和素和生物素的摩尔比为1:2；
步骤(1)中所述的ssDNA1的序列为5′-CGTCCTACACTCCTGGCAGTCTCGTTCTAGTCTCGCGTTGCACCTCCGTCATGATCCATTCTCCACCTCG-biotin-3′，ssDNA2的序列为5′-CGAGACTAGAACGAGACTGCCAGGAGTGTAGGACGCGAGGTGGAGAATGGATCATGACGGAGGTGCAACG-3′；
步骤(2)中所述的磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的磁性DNA水凝胶封装双酶的方法，其特征在于：步骤（1）中ssDNA1和ssDNA2浓度均为50 μM。
3.根据权利要求1所述的磁性DNA水凝胶封装双酶的方法，其特征在于：步骤(1)中生物素均匀分布在长链DNA超分子结构中。
4.根据权利要求1所述的磁性DNA水凝胶封装双酶的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，pH 7.4，0.1 M NaCl。
5.根据权利要求1所述的磁性DNA水凝胶封装双酶的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的浓度分别为2 mM和1 mM。
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自组装DNA凝胶作为固定化酶载体的应用研究;万兰;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科技辑》;20170315;第2章前言第3段，第21-22页，第24-25页第2.3.1节及图2.1，第35页第3章前言，第50页最后一段 *

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