CN111154749B - 一种磁性dna隔室封装双酶的方法 - Google Patents

一种磁性dna隔室封装双酶的方法 Download PDF

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Abstract

一种磁性DNA隔室封装双酶的方法，属于固定化酶制备领域。本发明分为以下步骤：首先通过部分互补配对的单链DNA制备Y‑型DNA脚手架结构；之后制备与Y‑型DNA脚手架部分互补配对的酶‑DNA复合物；随后制备与Y‑型DNA脚手架和酶‑DNA复合物部分互补配对的单链DNA修饰的磁性微球，通过DNA碱基互补配对实现磁性DNA隔室酶的制备。由于DNA具有较好的生物相容性和生物源性以及隔室对酶的保护和活性提高，制备的固定化酶具有较好的稳定性和高酶活性，有利于酶的重复利用及回收，降低制备使用成本。

Description

一种磁性DNA隔室封装双酶的方法
技术领域
本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及通过DNA纳米技术和功能化磁性粒子制备磁性DNA隔室封装酶的方法。
背景技术
酶是一类极为重要的天然生物催化剂，大部分为蛋白质。与传统化学催化剂相比，酶具有催化效率高、选择性好、能耗低等诸多优点，被认为是一种更经济、更环保的催化剂。虽然酶在温和的条件下(即在环境温度、水介质中)可以表现出较高的催化活性，但其稳定性和活性也受到这些条件的限制。酶固定化技术的出现在一定程度上克服了游离酶在溶液中稳定性差、回收率低和不可循环使用等缺点，使其在工业和商业上具有可行性。受体内酶与膜类物质相结合进行特有的催化反应的启发，酶固定化技术是模拟体内酶的作用方式，通过物理或化学手段，采用载体将酶束缚在一定区域内，限制酶分子在此区域内发挥其催化作用的一种交叉学科技术。目前传统的酶固定化方法主要包括吸附法、包埋法、共价结合法和交联法，这些固定化方式在一定程度上改善了酶的性能，但仍在一定程度上存在着自身不可忽视的弊端。例如，酶固定不牢固，酶的催化活性难以充分保留等。为解决以上问题，研究者们不断致力于新型酶固定化方法的研究。近年来，生物固定化方法得到了广泛关注。生物固定化方法主要是利用生物分子之间的特异性结合进行酶固定化的技术。其主要包括抗原和抗体之间的特异性结合、生物素和亲和素之间的亲和作用、DNA分子的碱基互补配对等。生物固定化方法不仅更加温和，而且可以实现定向固定化，有效避免酶结构的变性以及充分暴露酶的活性位点。
近年来，基于生物固定化，DNA纳米技术在固定化酶领域得到了应用。DNA由于具有较好的物理化学稳定性、较好的生物相容性以及生物源性，被广泛应用于生物和医疗领域。尽管基于DNA纳米技术固定化酶具有满意的酶促分析及酶活性，但将酶直接固定在载体表面会造成酶稳定性在一定程度上降低，同时也会对酶的活性产生影响。因此，需要进一步探索易于制备和基于DNA纳米技术用于制备酶稳定高和利于保护酶的固定化酶技术。
发明内容
本发明的目的是构建一种磁性DNA隔室为载体，将酶封装到DNA隔室中，以克服传统固定化酶难以保护酶稳定性和活性等缺点。本发明的封装方法操作简单，条件温和，制备的封装酶活性高，重复使用性、稳定性好，且易于从反应体系中分离。本发明以葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶(HRP)为模型来证明磁性DNA隔室固定化酶体系的优良性能。
该方法首先合成Y-型DNA脚手架，再经过不同的ssDNA分别对HRP、GOx和磁性粒子进行功能化改性，制备磁性DNA隔室封装双酶的固定化酶。
为了达到上述目的，本发明按照以下技术方案实现:
一种磁性DNA隔室封装双酶的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将单链DNA ssDNA1，单链DNA ssDNA2和单链DNA ssDNA3溶于缓冲溶液中，混合溶液在95℃反应5min，反应后的混合溶液室温冷却2h制备Y-型DNA结构；采用单链DNAssDNA L1对GOx进行修饰以及单链DNA ssDNA L2对HRP进行修饰分别制备ssDNA L1-GOx和ssDNA L2-HRP；
(2)将(1)中合成的Y-型DNA结构与单链DNA ssDNA L功能化的磁性粒子、ssDNAL1-GOx和ssDNA L2-HRP混合，混合液在37℃下反应3h，合成磁性DNA隔室封装双酶体系；ssDNA L功能化的磁性粒子、ssDNA L1-GOx和ssDNA L2-HRP的摩尔比为1:1:1，ssDNA L1-GOx和Y-型DNA结构的摩尔比为3:1，ssDNA L1和GOx的摩尔比为1:1，ssDNA L2和HRP的摩尔比为1:1。
进一步，将(2)中合成的DNA隔室酶用缓冲溶液(10mM NaCl，pH 7.4)充分润洗，洗去未固定化的酶-DNA复合物以及DNA材料，制备高纯度的固定化酶体系。
进一步，步骤(1)中所述的ssDNA1的序列为5′-CACGCTGTCCTAACCATGACCGTCGAAGCGATTGACTCTC-3′，ssDNA2的序列为5′-CTTCGACGGTCATGTACTAGATCAGAGGCGATTGACTCTC-3′，ssDNA3的序列为5′-CCTCTGATCTAGTAGTTAGGACAGCGTGCGATTGACTCTC-3′，ssDNA L1的序列为5′-SH-TCTATTCGCATGAGAATTCCATTCACCGTAAGGAGAGTCAATCG，ssDNA L2的序列为5′-SH-CTTACGGTGAATGGAATTCTCATGCGAATAGAGAGAGTCAATCG，且ssDNA1和ssDNA2浓度均为100μM；
进一步，步骤(1)中所述的ssDNA1，ssDNA2和ssDNA3为部分互补配对序列；
进一步，步骤(1)中所述的ssDNA L1和ssDNA L2为部分互补配对序列且ssDNA L1和ssDNA L2与酶连接的一端与ssDNA1，ssDNA2和ssDNA3的部分碱基序列互补配对；
进一步，步骤(2)中所述的ssDNA L的序列为NH2-CGATTGACTCTC，混合缓冲液为10mM NaCl，pH为7.4；
进一步，磁性DNA隔室封装双酶体系为聚集体，类似水凝胶性质；
进一步，所述的磁性四氧化三铁粒子粒径为500nm；
进一步，所述的磁性DNA隔室双酶体系易于操控，在磁场的控制下易于从反应体系中分离；
进一步，所述的磁性DNA隔室封装双酶为GOx和HRP，此封装方法可以扩展到其他双酶，不仅限于GOx和HRP。
本发明的优点在于：
(1)制备的DNA隔室具有较好的生物相容性和物理化学稳定性，酶的封装反应条件温和，均有利于保持酶的活性；
(2)封装固定方法简单高效，利用碱基互补配对原则，以Y-型DNA脚手架为桥梁实现在磁性粒子周围构建DNA隔室，用于双酶封装，封装过程中不涉及酶的化学改性，未对酶的二级、三级结构产生影响，充分保持酶活性和稳定性；
(3)与其他方式制备的固定化酶相比，本发明制备的磁性DNA隔室封装酶在磁场的控制下易于从反应体系中分离，有效促进固定化酶的重复使用性；
(4)显著提高酶稳定性和级联反应效率，通过DNA隔室将双酶固定在狭小空间隔室内，隔室外面有磁球保护，可以显著提高酶的稳定性；同时较小的隔室空间以及通过DNA双链调节酶之间的距离进而显著提高双酶邻近性，使GOx的催化产物快速被HRP消耗，提高级联反应效率，节约合成和使用成本。
(5)本发明制备的磁性DNA隔室酶是以GOx和HRP为模型酶，此方法制备的固定化酶可以扩展到不同类型的单酶或多酶，是一种通用型制备磁性DNA隔室的封装酶策略。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明，但并不构成对本发明的限制。
实施例1：Y-型DNA脚手架的制备
分别取溶解在10mM PBS(pH 7.4，0.1M NaCl)的100μM ssDNA1，ssDNA2和ssDNA3，涡旋使其充分溶解。将ssDNA2和ssDNA3溶液加入到ssDNA1中，95℃油浴反应5min，室温冷却2h制备Y-型DNA脚手架。
实施例2：酶-DNA复合物的制备
分别称取5mg GOx和5mg HRP于2mL离心管中，各加入500μL 10mM PBS(pH 7.4，0.1M NaCl)，涡旋使其完全溶解。称取5mg Sulfo-SMCC于2mL离心管中，加入1mL 10mM PBS(pH 7.4，0.1M NaCl)，涡旋并超声，至Sulfo-SMCC完全溶解。称取1.3mg TCEP于2mL离心管中，加入1.5mL 10mM PBS(pH 7.4，0.1M NaCl)，涡旋并超声，至TCEP完全溶解。将GOx溶液、HRP溶液、Sulfo-SMCC溶液和TCEP溶液离心(5min，8000rpm，12℃)。移取500μL Sulfo-SMCC溶液和500μL GOx溶液于5mL离心管中，移取500μL Sulfo-SMCC溶液和500μL HRP溶液于另一个5mL离心管中，摇床反应3h(37℃，400rpm)。
取ssDNA L1和ssDNA L2各1OD，各加入300μL 10mM PBS(pH 7.4，0.1M NaCl)，涡旋使其完全溶解，离心(5min，8000rpm，12℃)。移取300μL ssDNA L1和120μL TCEP于5mL离心管中，移取300μL ssDNA L2和120μL TCEP于另一个5mL离心管中，摇床反应3h(37℃，400rpm)。
将反应后的酶用10K超滤管离心6次(10min/次，8100xg，12℃)，DNA用3K超滤管离心6次(20min/次，8100xg，12℃)，各反离心1次(10min，8100xg，12℃)。将L1和GOx及L2和HRP分别混合于50mL离心管中，摇床反应12h(29℃，400rpm)。将产物用10k超滤管离心6次(10min/次，8100xg，12℃)，反离心1次(10min，8100xg，12℃)，制备的酶-DNA复合物分别命名为ssDNA L1-GOx和ssDNA L2-HRP，放入冰箱4℃中保存待用。
实施例3：磁性DNA隔室封装双酶的制备
(1)功能化磁性微球的制备：称取30mg合成的Fe3O4于100mL三口烧瓶中，加入8mL去离子水和32mL无水乙醇，超声并手动搅拌约10min，使Fe3O4磁性粒子分散均匀。在机械搅拌下快速加入1mL APTES和1mL NH3H2O，加入完毕后计时反应12h。取出合成的Fe3O4@APTES，用PBS(pH 8.0)清洗3次，加入9mL PBS(pH 8.0)和1mL戊二醛(50％wt)，摇床反应3h(29℃，400rpm)。反应结束后，用PBS(pH 8.0)清洗5次，除去过量的戊二醛。向清洗后的产物中加入1mL PBS(pH 8.0)和300μL ssDNA L(1OD)，摇床反应3.5h(29℃，400rpm)。反应结束后，用10mM PBS(pH 7.4，0.1M NaCl)清洗3次，产物命名为MNPs，放入冰箱4℃中保存待用。
(2)将实施例3(1)中制备的MNPs与实施例1中制备的Y-型DNA脚手架和实施例2中制备的ssDNA L1-GOx和ssDNA L2-HRP充分混合，混合溶液用10mM PBS(pH 7.4，0.1M NaCl)稀释至2mL，置于摇床反应3h(37℃，400rpm)。反应结束后，用10mM PBS(pH 7.4，0.1M NaCl)清洗3次，放入冰箱4℃中保存待用。
实施例4：磁性DNA隔室封装双酶活性优化及动力学考察
(1)本发明制备的封装双酶活性受双酶之间的距离大小和酶促微环境的影响，因此本发明对影响制备固定化酶活性的条件进行考察。
(2)调节制备合成过程，分别制备GOx和HRP的摩尔比为1:1，1:2，1:4，1:6和1:8的磁性DNA隔室固定化酶(0.5mg)，以100mM葡萄糖和0.5mM 2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)为底物，分别在37℃摇床反应5min，考察酶比例变化对双酶活性的影响。反应结束后，用紫外可见分光光度计在415nm处测量产物的吸光度。实验结果表明，当GOx和HRP的摩尔比为1:2时，制备的封装酶具有最佳酶促活性，实验结果同时表明高比例的HRP会降低双酶整体酶促活性。
(3)级联双酶之间的邻近性对酶促活性产生重要影响，本发明通过调节ssDNA L1和ssDNA L2的长度调节双酶之间的距离大小。保持ssDNA L1和ssDNA L2的3’与酶连接端的碱基长度不变，调节ssDNA L1和ssDNA L2的5’杂交部分的碱基序列，分别制备杂交部分为0个碱基对、10个碱基对、20个碱基对、30个碱基对、40个碱基对、50个碱基对、60个碱基对和80个碱基对的磁性DNA隔室封装双酶(0.5mg)。以100mM葡萄糖和0.5mM ABTS为底物，分别在37℃摇床反应5min，考察邻近性对双酶活性的影响。反应结束后，用紫外可见分光光度计在415nm处测量产物的吸光度。实验结果表明，杂交部分少于20个碱基对时，酶促活性随着碱基对的增加而升高，这主要是由于不杂交不能形成DNA隔室固定化酶体系(0个碱基对)和空间位阻对固定化酶活性产生重要影响(10个碱基对)；当超过20个碱基对时，酶促活性逐渐降低，主要是由于随着碱基对的增加，双酶之间的距离逐渐加大，级联酶促活性受到严重影响。
(4)在前期最佳实验条件基础上，进一步考察酶促微环境对级联双酶酶促活性的影响。首先制备等摩尔比的ssDNA L1-GOx，ssDNA L2-HRP和Y-型DNA脚手架复合物并命名为固定化酶A，随后分别制备固定化酶A：ssDNA L1：ssDNA L2的摩尔比为1:1:1的固定化酶B和固定化酶A：ssDNA L1：ssDNAL2的摩尔比为1:2:2的固定化酶C，考察DNA密度对磁性DNA隔室封装酶的影响。分析结果表明，制备封装酶的酶促活性随着DNA隔室密度的增加而逐渐增大，DNA电负性密度的增加可以在隔室内部和表面吸附大量结合水分子，显著增强封装酶的亲水微环境，进而增加酶活性，以上研究表明DNA隔室微环境对双酶级联效率产生重要影响。
(5)在最佳实验条件下对磁性DNA隔室封装双酶的动力学进行了考察。在前期研究双酶之间邻近性和DNA隔室微环境对酶促活性的影响时，根据米氏方程(Michaelis-Mentenequation)进一步考察了在此条件下的酶促动力学性能。以封装双酶体系中GOx为模型酶衡量对比封装酶和自由酶的动力学参数。当ssDNA L1和ssDNA L2的5’杂交部分的碱基序列为0个碱基对，20个碱基对和80个碱基对时，磁性DNA隔室封装酶的催化常数(kcat)分别为16.0s-1，204s-1和17.3s-1，表明双酶之间的邻近性对固定化酶的底物亲和性和催化活性有很大影响，这与前面提及的酶促活性分析相一致。当改变DNA隔室的电负性密度，发现酶促动力学同样会发生改变，固定化酶A，固定化酶B和固定化酶C的kcat分别为189.3s-1，272s-1和388s-1，表明高密度高电负性的DNA隔室有利于提高酶的活性，与自由酶相比具有较高的酶促反应效率。
实施例5：磁性DNA隔室封装双酶体系的重复使用性和稳定性
(1)磁性DNA隔室封装双酶的制备：同实施例3。
(2)重复使用性考察：0.5mg实施例3中合成的固定化酶加入到预先配制好的1mL100mM葡萄糖和0.5mM ABTS底物溶液中，在37℃下摇床反应5min。
(3)反应结束后使用紫外可见分光光度计检测反应液在415nm下的吸光度，将DNA固定化双酶用10mM PBS(pH 7.4)充分清洗，去除其表面粘有的底物溶液，再加入1mL 100mM葡萄糖和0.5mM ABTS底物混合溶液在37℃下摇床反应5min。反应结束后使用紫外可见分光光度计检测反应液在415nm下的吸光度。反复批次以上实验步骤，考察封装酶体系的重复使用性。
(4)考察发现，本发明制备的磁性DNA隔室封装双酶具有较好的重复使用性。经过16次循环使用后，制备固定化酶的活性仍未发生明显改变，仍可保持原酶活性的92％，同时本发明制备的磁性DNA隔室固定化酶在磁场控制下易于从反应体系中分离，易回收的特性使其具有很大优势。
(5)热稳定性考察：分别取0.5mg实施例3中制备的磁性DNA隔室封装酶和相同酶量的自由酶GOx和HRP分别在50℃和60℃中孵育0，15，30，45，60，75，90min，考察高温对制备固定化酶活性的影响。孵育结束后，在反应体系中分别加入1mL 100mM葡萄糖和0.5mM ABTS底物溶液，于37℃下摇床反应5min。用紫外可见分光光度计在415nm处测量反应溶液的吸光度。实验结果表明，制备的磁性DNA隔室酶和自由酶的酶促活性随着高温孵育时间的延长而降低。与自由酶相比，制备的隔室封装酶具有较好的热稳定性，在50℃和60℃中孵育75min后仍可分别保留原酶活性的60％。然而在相同条件下，自由酶仅分别保留原酶活性的35％和20％。
储存稳定性考察：分别取0.5mg实施例3中制备的磁性DNA隔室封装酶和相同酶量的自由酶GOx和HRP分别在室温和4℃中孵育0，3，6，9，12和15天，考察不同储存条件对制备固定化酶活性的影响。每隔3天将储存的固定化酶取出，在反应体系中分别加入1mL 100mM葡萄糖和0.5mM ABTS底物溶液，于37℃下摇床反应5min。用紫外可见分光光度计在415nm处测量反应溶液的吸光度。实验结果表明，制备的磁性DNA隔室酶和自由酶的酶促活性随着储存时间的延长而降低。与自由酶相比，制备的隔室封装酶具有较好的储存稳定性，在室温和4℃中储存15天后仍可分别保留原酶活性的50％和77.6％。然而在相同条件下，自由酶分别已完全失去活性和仅保留原酶活性的9.2％。
实施例6：磁性DNA隔室封装双酶用于葡萄糖在线可视化检测
(1)固定化酶体系的制备：同实施例3。
(2)取出合成的30mg磁性DNA隔室固定化双酶，将其泵入到流动装置中，并用磁铁将其固定在一段管路中，水浴控温为37℃。将管内液体排净，首先使用高浓度底物溶液(2.0mM葡萄糖和2.0mM ABTS的混合溶液)将固定化酶活化3次。设计葡萄糖浓度梯度为1000、750、500、250、125、62.5、31.25、15.625μM。分别通入不同浓度葡萄糖和ABTS(2.0mM)底物混合溶液，流速为1mL/min，收集未孵育及孵育10min的反应液，观察并对比反应液颜色，并检测其在415nm下的吸光度。
(3)为实现对固定化酶酶促反应活性的可视化在线检测，本发明将固定化酶泵入到透明管路中，并用磁铁将其固定，通过观察反应产物颜色变化对反应程度进行在线监测，通过肉眼即可判断反应进程。实验结果表明，当孵育0min时，随着葡萄糖浓度的升高，反应液颜色逐渐加深，与之对应的吸光度也逐渐增大；当孵育10min时，随着葡萄糖浓度的升高，反应液颜色逐渐加深，当浓度达到500μM后，颜色不再发生变化，与吸光度变化结果一致。将得到的吸光度与相应浓度的葡萄糖做线性拟合，表明葡萄糖浓度分别在15.6μM到500μM(孵育0min)和15.6μM到250μM(孵育10min)范围内，封装酶体系与葡萄糖浓度具有较好的线性关系，检出限分别为5.2μM和3.125μM。孵育0min与10min趋势不完全一致，是由于较长的孵育时间使反应更充分，当浓度达到一定值后，酶的活性位点达到饱和。以上实验结果表明，我们可以根据目视反应液的颜色变化对反应进程进行估计，进而通过标准曲线对未知样品中葡萄糖的浓度进行检测。
(4)0.5mg实施例3中合成的磁性DNA隔室固定化酶，分别加入1mL 100μM葡萄糖及干扰物质1.0mM木糖，1.0mM果糖，1.0mM麦芽糖，1.0mM半乳糖，1.0mM乳糖，1.0mM甘露糖和1mg mL-1BSA及0.5mM ABTS，于37℃下摇床反应10min，在415nm处测量上清液的吸光度。实验发现干扰物质基本上没有吸收值，而底物葡萄糖具有较高的紫外吸收，表明制备的隔室固定化酶对葡萄糖具有较好的选择性。

Claims (3)

1.一种磁性 DNA 隔室封装双酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将单链 DNA ssDNA1，单链 DNA ssDNA2 和单链 DNA ssDNA3 溶于缓冲溶液中，混合溶液在 95 °C 反应 5 min，反应后的混合溶液室温冷却 2 h 制备 Y-型 DNA结构；采用ssDNA L1 对葡萄糖氧化酶（GOx）进行修饰以及 ssDNA L2 对辣根过氧化物酶（HRP）进行修饰分别制备 ssDNA L1-GOx 和 ssDNA L2-HRP；
（2）将（1）中合成的 Y-型 DNA 结构与 ssDNA L 功能化的磁性纳米粒子、ssDNA L1-GOx 和 ssDNA L2-HRP 混合，混合液在 37 oC 下反应 3 h，合成磁性 DNA 隔室封装双酶体系；ssDNA L 功能化的磁性纳米粒子、ssDNA L1-GOx 和 ssDNA L2-HRP 的摩尔比为 1:1:1，ssDNA L1-GOx 和 Y-型 DNA 结构的摩尔比为 3:1，ssDNA L1 和 GOx的摩尔比为 1:1，ssDNA L2 和 HRP 的摩尔比为 1:1；
步骤（1）中 ssDNA1，ssDNA2 和 ssDNA3 浓度均为 100 μM；
步骤（1）中所述的 ssDNA1 的序列为 5’- CACGCTGTCCTAACCATGACCGTCGAAGCGATTGACTCTC-3’，ssDNA2 的序列为 5’- CTTCGACGGTCATGTACTAGATCAGAGGCGATTGACTCTC-3’，ssDNA3 的序列为 5’- CCTCTGATCTAGTAGTTAGGACAGCGTGCGATTGACTCTC-3’，ssDNA L1 的序列为 5’-SH- TCTATTCGCATGAGAATTCCATTCACCGTAAGGAGAGTCAATCG，ssDNA L2 序列的序列为 5’-SH-
CTTACGGTGAATGGAATTCTCATGCGAATAGAGAGAGTCAATCG；
步骤（2）中所述的 ssDNA L 的序列为 NH2-CGATTGACTCTC，混合缓冲液为 10 mM NaCl，pH7.4；
步骤（2）中所述的磁性粒子为四氧化三铁粒子，其表面由 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）直接修饰。
2.根据权利要求 1 所述的磁性 DNA 隔室封装双酶的方法，其特征在于：步骤（1）中ssDNA1，ssDNA2 和 ssDNA3 为部分互补配对序列。
3.根据权利要求 1 所述的磁性 DNA 隔室封装双酶的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的ssDNA L1 和ssDNA L2 为部分互补配对序列且ssDNA L1 和ssDNA L2 与酶连接的一端与 ssDNA1，ssDNA2 和 ssDNA3 的部分碱基序列互补配对。
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