CN110272982A - 一种磁性dna水凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种磁性dna水凝胶及其制备方法 Download PDF

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唐建普
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Tianjin University
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Abstract

本发明公开了一种磁性脱氧核糖核酸(DNA)水凝胶及其制备方法，制备方法为：(1)长单链DNA的合成；(2)表面修饰有DNA引物的复合磁性纳米颗粒的合成；(3)向步骤(1)体系里加入复合磁性纳米颗粒，得到DNA磁性水凝胶。本发明的DNA磁性水凝胶，具有磁导向功能，能够在外加磁场下实现各种复杂的运动；更重要的是，这种磁性DNA水凝胶具有一种被动的形状适应性，能够很好地应对不规则、复杂的外部环境。制备水凝胶的过程简单、方便。这种材料具有较好的生物相容性，能够应用于组织工程、医用敷料、药物缓释(吸附)等领域。

Description

一种磁性DNA水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于脱氧核糖核酸(DNA)材料功能化制备及应用领域，涉及一种磁性DNA水凝胶及其制备方法。
背景技术
近年来，微机器人在生物诊断、药物输送、微创手术等医学领域显示出潜在价值。微型机器人的小尺寸(从毫米到微米)使它们能够在狭窄的空间内完成一些复杂的动作，并有可能进入人体深处。然而，传统的硬体机器人通常具有较低的灵活性和较高的机械强度，阻碍了微型机器人在动态非结构化环境中的应用。为了降低微型机器人与环境交互的复杂性，科学家们将更多的目光投向了软材料的合成，从而赋予机器人在运动过程中更多的形状自由。现有的软材料包括电活性聚合物、形状记忆材料、热响应弹性体和水凝胶。在这些软材料中，水凝胶具有与细胞外基质相似的高含水量和三维网络结构的特性，在医学应用方面具有天然优势。然而，尽管对水凝胶的研究非常广泛，但对于具有形状适应性的水凝胶的制备却相对较少。
滚环扩增技术(rolling circle amplification，RCA)是在1998年发明应用的一种核酸扩增技术。根据其扩增效率的不同可分为“线性RCA”和“指数RCA”。线性RCA也被称为单引物RCA。线性RCA在扩增反应的过程中，引物首先与单链环状DNA结合，在DNA聚合酶的作用下，以单链环状DNA为模板，合成新的与其互补的DNA链。完成一圈后，DNA聚合酶再次到达引物与模板的结合位点，其链置换功能发生作用将已合成的引物延伸链替换下来，重复之前的合成过程，从而合成周期性重复的DNA片段。指数RCA技术的原理与线性RCA相同，在线性RCA的基础上，再增加一条与环状DNA序列完全一致的引物，该引物和第一次线性RCA产物的部分序列互补并酶促延伸，同时置换掉下游杂交到扩增产物上其他拷贝段的引物，之后被置换掉的延伸产物又可以作为第一条引物的模板进行扩增，这样一来，扩增产物量在很短的时间内呈指数递增。一般来说，线性扩增的效率为105，指数扩增的效率为109[1]。
之前已有文献报道通过滚环扩增技术形成DNA水凝胶[2]。这种水凝胶被报道具有一种有趣的力学性质，即在水中呈固态，在空气中呈液态，可以轻易地被注入直径只有几毫米的管道中。这种特性使RCA水凝胶具有形状自适应的潜力。但是，已有的研究中很少有对这种DNA水凝胶的性状的展示，这是因为纯RCA水凝胶的弹性模量极低，在实际应用中的可操控性不强。
参考文献：
1.Ali,M.M.,et al.,Rolling circle amplification:a versatile tool forchemical biology,materials science and medicine.Chemical Society Reviews,2014.43(10):p.3324-3341.
2.Lee,J.B.,et al.,A mechanical metamaterial made from a DNAhydrogel.Nature Nanotechnology,2012.7(12):p.816.
3.Hu,W.,et al.,Small-scale soft-bodied robot with multimodallocomotion.Nature,2018.554(7690):p.81-85.
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种磁性DNA水凝胶。
本发明的第二个目的是提供一种磁性DNA水凝胶的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种磁性DNA水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)长单链DNA的合成；
(2)表面修饰有DNA引物的复合磁性纳米颗粒的合成；
(3)向步骤(1)体系里加入复合磁性纳米颗粒，得到DNA磁性水凝胶。
所述步骤(1)具体为：在容器中，加入终浓度为40～60nmol/L的带有初级DNA引物的环状DNA模板，终浓度为1～2mmol/L的dNTPs，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液及2×BSA，终浓度为10～20mmol/L的NaCl水溶液，以及终浓度0.05～0.15U/μL的phi 29 DNA聚合酶，余量为超纯水，400～500rpm振荡4～6小时，得到含有长单链DNA的液体；
所述步骤(2)具体为：以终浓度为1.0～3.0mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和3.0～7.0mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液为溶液一，用溶液一溶解5’端修饰了羧基的二级DNA引物，使浓度为1～3μmol/L，静置10～30分钟得到溶液二；用pH＝7.4磷酸缓冲液将氨基改性的磁性Fe3O4纳米颗粒分散成浓度为1～3mg/mL的悬浊液；按体积比1～3:1的比例，将溶液二和悬浊液混合，常温反应3～6小时；离心，得到复合磁性纳米颗粒，用存储液将复合磁性纳米颗粒离心清洗2～4次，用存储液分散得到浓度为1～3mg/mL的复合磁性纳米颗粒悬浊液；所述存储液为20mmol/L Tris-HCl，5mmol/L MgCl2，pH＝8.0的水溶液；
所述步骤(3)具体为：按体积比10:1～3的比例将含有长单链DNA液体与步骤(2)获得的复合磁性纳米颗粒悬浊液，30～37℃下以600～700rpm的振荡8～16小时，得到磁性DNA水凝胶；
所述5’端修饰了羧基的二级DNA引物的碱基数为22～130，由两部分组成：位于3’端的6～50个碱基，与长单链DNA碱基互补配对；余下的序列为任意序列。
带有初级DNA引物的环状DNA模板用下述方法制成：
a.按比例，将1mol碱基数为30～200的、5’端经过磷酸化修饰的线性DNA模板和1mol碱基数为6～30的初级DNA引物混合，所述初级DNA引物的5’端区域可以与所述5’端经过磷酸化修饰的线性DNA模板的5’端区域互补配对，初级DNA引物的3’端区域可以与线性DNA模板的3’端区域互补配对；加入终浓度为20～80mmol/L的NaCl水溶液，提高DNA双链结构的稳定性，进行高温退火反应；
b.向每200ng步骤a得到的DNA产物中加入2U的T4 DNA连接酶，22℃下反应4～8小时，得到带有初级DNA引物的环状DNA模板。
上述方法制备的磁性DNA水凝胶。
本发明的优点：
本发明的磁性DNA水凝胶，具有磁导向功能，能够在外加磁场下实现各种复杂的运动；更重要的是，这种DNA磁性水凝胶具有一种被动的形状适应性，能够很好地应对不规则、复杂的外部环境。制备水凝胶的过程简单、方便。这种材料具有较好的生物相容性，能够应用于组织工程、医用敷料、药物缓释(吸附)等领域。
为了避免磁性纳米颗粒从水凝胶中逸散出来，通过在其表面修饰上能与水凝胶DNA网络碱基互补配对的单链DNA，从而将磁球锚定在水凝胶网络中，增强磁性水凝胶的稳定性。
附图说明
图1为验证合成带有初级DNA引物的环状DNA模板的电泳图；
图2为合成的磁性DNA水凝胶的照片；
图3为合成的磁性DNA水凝胶的扫描电镜照片；
图4为合成的磁性DNA水凝胶的流变学测试图；
图5为合成的磁性DNA水凝胶的细胞毒性实验的结果；
图6为合成的磁性DNA水凝胶的磁导航和形状适应性的展示图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
实施例1
带有初级DNA引物的环状DNA模板的制备方法，包括如下步骤：
a.将2μL浓度为100μmol/L碱基数为92的、5’端经过磷酸化修饰的线性DNA模板(其中线性DNA模板的核苷酸序列用SEQ ID NO.1表示)和2μL浓度为100μmol/L碱基数为22的初级DNA引物混合(SEQ ID NO.2)，所述初级DNA引物的5’端区域与所述5’端经过磷酸化修饰的线性DNA模板的5’端区域互补配对，初级DNA引物的3’端区域与线性DNA模板的3’端区域互补配对；加入终浓度为40mmol/L的NaCl水溶液，提高DNA双链结构的稳定性，加入15μL超纯水将体积补足至20μL，进行高温退火反应；
所述的5’端经过磷酸化修饰的线性DNA模板、初级DNA引物和二级DNA引物的碱基序列见表1。
表1.DNA样品的碱基序列
b.按表2将样品进行混合。
表2.线性模板的环化体系组分
将混合后的液体置于PCR仪中进行下列高温退火程序：
在退火过程中，线性DNA模板的两端会与初级DNA引物通过碱基互补配对结合，实现对线性DNA模板的环化，此时，模板的两端之间存在缺口；获得DNA产物为10μmol/L的液体，为方便取用，将其用超纯水稀释成浓度为1μmol/L的样品一。
向每200ng上述得到的DNA产物中加入2U的T4 DNA连接酶，按表3将样品进行混合。
表3.环状模板的合成体系组分
将混合液置于22℃下静置4h，使T4 DNA连接酶将模板的缺口连接，得到带有初级DNA引物的环状DNA模板，浓度为0.29μmol/L。
(2)验证环状DNA模板的合成：
通过12％聚丙烯酰胺凝胶电泳实验来验证环状DNA模板的合成。电泳条件：电压，110V；时间，110min。
上样量如表4：
表4.聚丙烯凝胶电泳样品
跑胶结果见图1。
实施例2
一种磁性DNA水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)在容器中，按表5加入终浓度为50nmol/L的环状DNA模板(实施例1制备)，终浓度为0.05U/μL的phi 29 DNA聚合酶，终浓度为1mmol/L的dNTPs，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液及2×BSA，终浓度为16mmol/L的NaCl水溶液，余量为超纯水，反应条件为450rpm震荡5小时，得到含有长单链DNA的液体一；
表5.滚环扩增体系的组分
(2)复合磁性纳米颗粒的制备：
a.将0.5mol/L氢氧化钠水溶液和0.4mol/L盐酸分别脱气30分钟；将0.024molFeCl3·6H2O和0.012mol FeCl2·4H2O溶解在脱气后盐酸溶液，搅拌15分钟；将得到的盐酸溶液加入到脱气后的氢氧化钠水溶液，80℃下混合搅拌1小时。离心，用乙醇离心清洗4次，得到磁性纳米颗粒；
b.将1mmol磁性纳米颗粒加入到100mL 28.6mmol/L的柠檬酸溶液，超声处理后，向液体中加入25％的四甲基铵直到pH＝7.0，得到磁性纳米颗粒的悬浊液，记作悬浊液一；
c.取45mL悬浊液一，与680mL无水乙醇、180mL水、6.19mL 28％氢氧化铵和3.5mL正硅酸四乙酯混合。在0℃下超声1小时。离心，用乙醇离心清洗4次，得到硅烷化的磁性纳米颗粒；
d.将0.5g硅烷化的磁性颗粒分散于50mL甲苯中，加入0.5mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在110℃下回流8小时。离心，用乙醇和水分别离心清洗4次，得到氨基改性的磁性纳米颗粒；
e.将2.0mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5.0mg N-羟基琥珀酰亚胺加入到1mL1μmol/L 5’端羧基化修饰的二级DNA引物水溶液中，30℃下混合15分钟；将1mg氨基改性的磁性颗粒和1mL pH＝7.4的磷酸缓冲液加入上述溶液中，30℃下振荡3小时；离心，用存储液离心清洗3次；用存储液分散得到浓度为1mg/mL的复合磁性纳米颗粒悬浊液，记作悬浊液二；
所述的存储液为pH＝8.0的20mmol/L Tris-HCl，5mmol/L MgCl2的水溶液；
所述的二级DNA引物的碱基数为49，序列由两部分片段组成：3'端为第一部分，碱基数为30，与长单链DNA互补配对；5'端为第二部分，碱基数为19，是任意碱基序列；二级引物的5'端经过羧基化修饰；
(3)向含有长单链DNA的液体一中每隔2小时加2μL 1mg/mL的悬浊液二，一共加3次，在37℃下550rpm振荡12小时；将容器在70℃下静置10min，使phi29 DNA聚合酶失活，得到DNA水凝胶，如图2所示。
实施例3
带有初级DNA引物的环状DNA模板的制备方法，包括如下步骤：
a.将1mol碱基数为30的、5’端经过磷酸化修饰的线性DNA模板和1mol碱基数为6的初级DNA引物混合，所述初级DNA引物的5’端区域可以与所述5’端经过磷酸化修饰的线性DNA模板的5’端区域互补配对，初级DNA引物的3’端区域可以与线性DNA模板的3’端区域互补配对；加入终浓度为20mmol/L的NaCl水溶液，提高DNA双链结构的稳定性，进行高温退火反应；
所述的5’端经过磷酸化修饰的线性DNA模板、初级DNA引物和二级DNA引物的碱基序列见表6。
表6.DNA样品的碱基序列
b.按表7将样品进行混合。
表7.线性模板的环化体系组分
将混合后的液体置于PCR仪中进行下列高温退火程序：
在退火过程中，线性DNA模板的两端会与初级DNA引物通过碱基互补配对结合，实现对线性DNA模板的环化，此时，模板的两端之间存在缺口；获得DNA浓度为10μmol/L的液体，将其用超纯水稀释成浓度为1μmol/L的样品二。
c.按表8将样品进行混合。
表8.环状模板的合成体系组分
将混合液置于22℃下静置4h，使T4 DNA连接酶将模板的缺口连接；再将其置于70℃下10min，灭活T4 DNA连接酶，得到带有初级DNA引物的环状DNA模板，浓度为0.29μmol/L。
实施例4
一种磁性DNA水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)在容器中，按表9加入终浓度为50nmol/L的环状DNA模板(实施例3制备)，终浓度为0.05U/μL的phi 29 DNA聚合酶，终浓度为1mmol/L的dNTPs，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液及2×BSA，终浓度为16mmol/L的NaCl水溶液，余量为超纯水，反应条件为450rpm震荡5小时，得到含有长单链DNA的液体二；
表9.滚环扩增体系的组分
(2)复合磁性纳米颗粒的制备：
按实施例2(2)中的步骤，制备浓度为1mg/mL的复合磁性纳米颗粒悬浊液二；
(3)向液体二中每隔2小时加2μL 1mg/mL的悬浊液二，一共加3次，在37℃下500rpm振荡12小时；将容器在70℃下静置10min，使phi29 DNA聚合酶失活，得到磁性DNA水凝胶。
实施例5
带有初级DNA引物的环状DNA模板的制备方法，包括如下步骤：
a.将1mol碱基数为200的、5’端经过磷酸化修饰的线性DNA模板和1mol碱基数为30的初级DNA引物混合，所述初级DNA引物的5’端区域可以与所述5’端经过磷酸化修饰的线性DNA模板的5’端区域互补配对，初级DNA引物的3’端区域可以与线性DNA模板的3’端区域互补配对；加入终浓度为80mmol/L的NaCl水溶液，提高DNA双链结构的稳定性，进行高温退火反应；
所述的5’端经过磷酸化修饰的线性DNA模板、初级DNA引物和二级DNA引物的碱基序列见表10。
表10.DNA样品的碱基序列
b.按表11将样品进行混合。
表11.线性模板的环化体系组分
将混合后的液体置于PCR仪中进行下列高温退火程序：
在退火过程中，线性DNA模板的两端会与初级DNA引物通过碱基互补配对结合，实现对线性DNA模板的环化，此时，模板的两端之间存在缺口；获得DNA浓度为10μmol/L的液体，将其用超纯水稀释成浓度为1μmol/L的样品三。
c.按表12将样品进行混合。
表12.环状模板的合成体系组分
将混合液置于22℃下静置4h，使T4 DNA连接酶将模板的缺口连接；再将其置于70℃下10min，灭活T4 DNA连接酶，得到带有初级DNA引物的环状DNA模板，浓度为0.29μmol/L。
实施例6
一种磁性DNA水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)在容器中，按表13加入终浓度为50nmol/L的环状DNA模板(实施例5制备)，终浓度为0.05U/μL的phi 29 DNA聚合酶，终浓度为1mmol/L的dNTPs，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液及2×BSA，终浓度为16mmol/L的NaCl水溶液，余量为超纯水，反应条件为450rpm震荡5小时，得到含有长单链DNA的液体三；
表13.滚环扩增体系的组分
(2)复合磁性纳米颗粒的制备：
按实施例2(2)中的步骤，制备浓度为1mg/mL的复合磁性纳米颗粒悬浊液二；
(3)向液体三中每隔2小时加2μL 1mg/mL的悬浊液二，一共加3次，在37℃下600rpm振荡12小时；将容器在70℃下静置10min，使phi29 DNA聚合酶失活，得到磁性DNA水凝胶。
用实施例2得到的磁性DNA水凝胶做下列实验：
1.流变学测试
用旋转流变仪测试磁性DNA水凝胶的在时间模式下的储能模量(G’)和损耗模量(G”)的关系，所述凝胶为实施例2制备。从图4所示，G’始终大于G”，说明磁性水凝胶一直保持凝胶状态。
从图4所示的实验结果可知，实施例2制备的磁性DNA水凝胶具备凝胶的流变学特性。
2.细胞毒性实验
在96孔板的每个孔中加入约9000个平滑肌细胞(MSCs)，每个孔中加入不同浓度的磁性水凝胶的浸提液，使得每组孔的浸提液浓度分别为0，10，20，30，40，50mg/mL，所述凝胶为实施例2制备。将加样完成后的96孔板在CO2培养箱中37℃下培养24h；吸去上清，加入90mL新鲜培养液，再加入10μL MTT溶液，继续培养4h；吸去上清，每孔加入110μL Formazan溶解液，在300rpm下震荡10min；测量490nm处各孔的吸光值，计算各个样品孔细胞相对活力。
各样品孔细胞相对活力定义为：各个孔吸光值/对照孔的吸光值×100％。
从图5所示的实验结果可知，实施例2制备的磁性DNA水凝胶没有细胞毒性。
3.磁导航实验和形状适应性实验
将磁性DNA水凝胶放在具有狭小缝隙的模型上，所述凝胶为实施例2制备，如图6所示，在不施加磁场的情况下，磁性DNA水凝胶无法进入缝隙里；当在模型底部放置一个磁铁，磁性DNA水凝胶受磁场作用，通过比自身体积小很多的缺口进入缝隙。
从图6所示的实验结果可知，实施例2制备的磁性DNA水凝胶具有磁导航和形状适应的能力。
<110> 天津大学
<120> 一种磁性DNA水凝胶及其制备方法
<130>
<160> 7
<170>
<210> 1
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcgtttgatg ttcctaacgt accaacgcac acgcagaatt ctggactggt aaaagctttc 60
cgaggtagcc tggagcatag aggcattggc tg 92
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
taggaacatc aaacgacagc ca 22
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cttaacggtt gctaactact ggttaacatc gaatcaacag taacacgcag aattctggac 60
tggtaaaagc tt 72
<210> 4
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<213> 人工序列
<400> 4
cgcagaattc tggactggta aaagcttctg 30
<210> 5
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<213> 人工序列
<400> 5
gcgcag 6
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tcgtttgatg ttcctaacgt acctaacgca cagcgcagta cgtacacgta ccaacgcaca 60
cgcagtacgt accaacgcag cacgcagtac gtacctaacg cacagcgcag tacgtacacg 120
taccacacgc agagaattct ggactggtaa aagctttacg taccaacgca ttatggactg 180
gtaaaagctt tccgaggtag cctggagcat agaggcattg gctg 224
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
taggaacatcaaacgacagccaatgcctct 30

Claims (8)

1.一种磁性DNA水凝胶的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)长单链DNA的合成；
(2)表面修饰有DNA引物的复合磁性纳米颗粒的合成；
(3)向步骤(1)体系里加入复合磁性纳米颗粒，得到DNA磁性水凝胶。
2.根据权利要求1所述磁性DNA水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)长单链DNA的合成具体方法为：在容器中，加入终浓度为40～60nmol/L的带有初级DNA引物的环状DNA模板，终浓度为1～2mmol/L的dNTPs，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液及2×BSA，终浓度为10～20mmol/L的NaCl水溶液，以及终浓度0.05～0.15U/μL的phi 29 DNA聚合酶，余量为超纯水，400～500rpm振荡4～6小时，得到含有长单链DNA的液体。
3.根据权利要求2所述磁性DNA水凝胶的制备方法，其特征在于，带有初级DNA引物的环状DNA模板用下述方法制成：
a.按等摩尔比例，将碱基数为30～200的、5’端经过磷酸化修饰的线性DNA模板和碱基数为6～30的初级DNA引物混合，所述初级DNA引物的5’端区域与所述5’端经过磷酸化修饰的线性DNA模板的5’端区域互补配对，初级DNA引物的3’端区域与线性DNA模板的3’端区域互补配对；加入终浓度为20～80mmol/L的NaCl水溶液，用超纯水将体积补足至20μL；
b.将上述混合后的液体置于PCR仪中，进行高温退火反应，向得到的DNA产物中加入T4DNA连接酶，22℃下反应4～8小时，得到带有初级DNA引物的环状DNA模板。
4.根据权利要求1所述磁性DNA水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：以终浓度为1.0～3.0mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和3.0～7.0mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液为溶液一，用溶液一溶解5’端修饰了羧基的二级DNA引物，使浓度为1～3μmol/L，静置10～30分钟得到溶液二；用pH＝7.4磷酸缓冲液将氨基改性的磁性Fe3O4纳米颗粒分散成浓度为1～3mg/mL的悬浊液；按体积比1～3:1的比例，将溶液二和悬浊液混合，常温反应3～6小时；离心，得到复合磁性纳米颗粒，用存储液将复合磁性纳米颗粒离心清洗2～4次，用存储液分散得到浓度为1～3mg/mL的复合磁性纳米颗粒悬浊液。
5.根据权利要求4所述磁性DNA水凝胶的制备方法，其特征在于，所述存储液为20mmol/L Tris-HCl，5mmol/L MgCl2，pH＝8.0的水溶液。
6.根据权利要求4所述磁性DNA水凝胶的制备方法，其特征在于，所述5’端修饰了羧基的二级DNA引物的碱基数为22～130，由两部分组成：位于3’端的6～50个碱基，与长单链DNA碱基互补配对；余下的序列为任意序列。
7.根据权利要求1所述磁性DNA水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为：按体积比10:1～3的比例将含有长单链DNA液体与步骤(2)获得的复合磁性纳米颗粒悬浊液，30～37c下以600～700rpm的振荡8～16小时，得到磁性DNA水凝胶。
8.权利要求1-7任意一项权利要求的方法制备的磁性DNA水凝胶。
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